8.蛋白质的生物合成.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Protein Biosynthesis(,Translation),蛋白质的生物合成,(翻译),第十二章,The biochemistry and molecular biology department of CMU,蛋白质的生物合成过程就是将mRNA分子中由,碱基序列,组成的遗传信息，通过,遗传密码,破译的方式转变成为蛋白质中的,氨基酸排列顺序,，因而称为翻译（translation)。,第一节,蛋白质合成体系,Protein Biosynthesis System,20,种氨基酸作为原料,酶及蛋白因子，如,IF,、,eIF,等,ATP,、,GTP,、无机离子,参与蛋白质生物合成的物质包括：,三种,RNA,mRNA,rRNA,tRNA,1961年，Nirenberg 证明了mRNA的模板作用。,一、翻译模板mRNA及遗传密码,细菌矾土颗粒,轻轻研磨,细菌液,离心，去除细胞壁和膜,提取液（DNA、mRNA、tRNA、核糖体、酶、离子）,DNA水解酶，20种氨基酸等,蛋白质,mRNA,结构简图,mRNA,上存在遗传密码,mRNA分子上从5,至3,方向，由AUG开始，每3个核苷酸为一组，决定肽链上某一个氨基酸或蛋白质合成的起始、终止信号，称为,三联体密码（triplet codon）。,ORF,从mRNA 5,端起始密码子AUG到3,端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编码一条多肽链，称为,开放阅读框架(open reading frame,ORF),。,保温,蛋白质合成停止,poly U，ATP，GTP，氨基酸,多聚苯丙氨酸（UUU是Phe的密码子）,同样方法证明了CCC是Pro的密码子，AAA是Lys的密码子。,提取液（DNA、mRNA、tRNA、核糖,体、酶、离子）,遗传密码的破译,遗传密码表,密码子的第一个字母,密码子的第二个字母,1.连续性（commaless）,遗传密码的特点,编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间隔也无重叠。,重叠密码,非重叠,连续的,密码,不连续的密码,基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失，可能导致框移突变(frameshift mutation)。,由于对mRNA外显子的加工，造成mRNA与其DNA模板序列之间不匹配，使同一mRNA前体翻译出序列、功能不同的蛋白质。这种基因表达的调节方式称为mRNA编辑（mRNA editing)。,mRNA编辑,2.简并性（degeneracy）,遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸有24个或多至6个密码子为之编码。,遗传密码的简并性,密码子简并性的生物学意义：减少有害突变。,遗传密码的特异性主要取决于前两位碱基。,GCU ACU,GCC ACC,GCA ACA,GCG ACG,Ala,Thr,3.通用性（universal）,蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。,有少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。,密码的通用性进一步证明各种生物进化自同一祖先。,4.摆动性（wobble）,tRNA上反密码子的,第1位,碱基与mRNA密码子的,第3位,碱基配对时，可以在一定范围内变动，即并不严格遵循碱基配对规律，这一现象称为,摆动性,。,摆动配对,U,二、核蛋白体是多肽链合成的装置,核蛋白体的组成,核蛋,白体,原核生物,真核生物,蛋白质,S值,rRNA,蛋白质,S值,rRNA,小亚基,21种,30S,16S,33种,40S,18S,大亚基,34种,50S,23S,5S,49种,60S,28S,5.8S,5S,核蛋白体,70S,80S,原核生物核蛋白体结构模式,30S小亚基：有mRNA结合位点,50S大亚基：E位：排出位（Exit site）,转肽酶活性,大小亚基共同组成：,A位：氨基酰位,(aminoacyl site),P位：肽酰位,(peptidyl site),三、tRNA与氨基酸的活化,反密码环,氨基酸臂,tRNA在翻译过程,中起,接合体,（adaptor）,作用，又是,氨基酸的运载体。,氨基酸+,tRNA,氨基酰-,tRNA,ATP,AMP,PPi,氨基酰-tRNA合成酶,（一）氨基酰-tRNA合成酶,(aminoacyl-tRNA synthetase),氨基酸的活化,第一步反应,氨基酸,ATPE,氨基酰,-AMP-E,AMP PPi,第二步反应,氨基酰,-AMP-E,tRNA,氨基酰,-tRNA,AMP,E,氨基酰-tRNA合成酶对氨基酸和tRNA都有高度特异性。,氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性(proof-reading activity)。,氨基酰-tRNA的表示方法：,Ala-,tRNA,Ala,Ser-tRNA,Ser,Met-tRNA,Met,氨基酸的活化形式：,氨基酰tRNA,氨基酸的活化部位：,羧基,氨基酸与tRNA连接方式：,酯键,氨基酸活化耗能：,2个P,真核生物：Met-tRNA,i,Met,原核生物：fMet-tRNA,i,f,Met,（二）起始肽链合成的氨基酰-tRNA,fMet-tRNA,i,fMet,的生成,：,第二节,蛋白质生物合成过程,The Process of Protein Biosynthesis,蛋白质合成中,mRNA模板的方向：5,3；,蛋白质的合成方向：N端,C端。,蛋白质合成过程：,起始,延长,终止,一、肽链合成起始,指mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核蛋白体结合而形成,翻译起始复合物,(translational initiation complex)。,参与起始过程的蛋白质因子称起始因子（initiation factor，IF）。,参与起始过程的蛋白质因子称起始因子（initiation factor，IF）。原核生物起始因子有三种：,IF-1：占据A位防止结合其他tRNA。,IF-2：促进起始tRNA与小亚基结合。,IF-3：促进大小亚基分离，提高P位对结合起始tRNA敏感性。,（一）原核生物翻译起始复合物形成,核蛋白体大小亚基分离；,mRNA,在小亚基定位结合；,起始氨基酰-tRNA,的结合；,核蛋白体大亚基结合。,IF-3,IF-1,1.核蛋白体大小亚基分离,A,U,G,5,3,IF-3,IF-1,2.mRNA在小亚基定位结合,S-D序列：,在原核生物mRNA起始密码AUG上游，存在49个富含嘌呤碱的一致性序列，如-AGGAGG-，称为S-D序列。又称为核蛋白体结合位点（ribosomal binding site，RBS),S-D序列,IF-3,IF-1,IF-2,GTP,A,U,G,5,3,3.起始氨基酰tRNA与小亚基结合,IF-3,IF-1,IF-2,GTP,GDP,Pi,A,U,G,5,3,4.核蛋白体大亚基结合,IF-3,IF-1,A,U,G,5,3,IF-2,GTP,IF-2,-GTP,GDP,Pi,起始过程消耗1个GTP。,（二）真核生物翻译起始复合物形成,核蛋白体大小亚基分离；,起始氨基酰-tRNA结合；,mRNA在核蛋白体小亚基就位；,核蛋白体大亚基结合。,真核生物翻译起始因子,起始因子,生物功能,eIF-2,促进起始tRNA与小亚基结合,eIF-2B,eIF-3,促进大小亚基分离,eIF-4A,eIF-4F复合物成分，有解螺旋酶活性，促进mRNA结合小亚基,eIF-4B,促进mRNA扫描定位起始AUG,eIF-4E,eIF-4F复合物成分，结合mRNA 5帽子,eIF-4G,eIF-4F复合物成分，结合eIF-4E和PAB,eIF-5,促进各种起始因子从小亚基解离，进而结合大亚基,eIF-6,促进核蛋白体分离成大小亚基,Met,40S,Me,t,Met,40S,60S,mRNA,eIF-2B、eIF-3、,eIF-6,elF-3,GDP+Pi,各种elF释放,elF-5,ATP,ADP+Pi,elF4E,elF4G,elF4A,elF4B,PAB,真核生物翻译起始复合物形成过程,Met-tRNA,i,Met,-elF-2,-GTP,Met,60S,真核生物翻译起始的特点,核蛋白体是80S；,起始因子种类多；,起始tRNA的Met不需甲酰化；,mRNA的5帽子和3poly A尾结构与mRNA在核蛋白体就位有关；,起始tRNA先与核蛋白体小亚基结合，然后再结合mRNA,二、肽链的延长,指按照mRNA密码序列的指导，依次添加氨基酸,从N端向C端,延伸肽链，直到合成终止的过程。,肽链的延长是在核蛋白体上连续性循环式进行，又称为核蛋白体循环（ribosomal cycle)，每次循环增加一个氨基酸，分为以下三步：,进位,（entrance）,成肽,（peptide bond formation）,转位,（translocation）,原核延长因子,生物功能,对应真核延长因子,EF-Tu,促进氨基酰-tRNA进入A位，结合分解GTP,EF-1-,EF-Ts,调节亚基,EF-1-,EFG,有转位酶活性，促进mRNA-肽酰-tRNA由A位前移到P位，促进卸载tRNA释放,EF-2,肽链合成的延长因子,（一）进位,指根据mRNA下一组遗传密码指导，使相应氨基酰-tRNA进入核蛋白体A位。,延长因子EF-T催化进位（原核生物）,Tu,Ts,GTP,GDP,A,U,G,5,3,Tu,Ts,GTP,（二）成肽,是由转肽酶（transpeptidase）催化的肽键形成过程。,（三）转位,延长因子EF-G有转位酶（translocase）活性，可结合并水解1分子GTP，促进核蛋白体向mRNA的3侧移动。,fMet,A,U,G,5,3,fMet,Tu,GTP,进位,转位,成肽,真核生物肽链合成的延长过程与原核基本相似，但有不同的反应体系和延长因子。,另外，真核细胞核蛋白体没有E位，转位时卸载的tRNA直接从P位脱落。,（四）真核生物延长过程,三、肽链合成的终止,当mRNA上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体等分离，这些过程称为肽链合成终止。,终止相关的蛋白因子称为释放因子,(release factor,RF),识别终止密码，如,RF-1,特异识别,UAA,、,UAG,；而,RF-2,可识别,UAA,、,UGA,。,诱导转肽酶改变为酯酶活性，使肽链从核蛋白体上释放。,释放因子的功能,原核生物释放因子：RF-1，RF-2，RF-3,真核生物释放因子：eRF,原核肽链合成终止过程,U,A,G,5,3,RF,COO,-,原核生物蛋白质合成的,能量计算,氨基酸活化：2个PATP,起始：1个GTP,延长：2个GTP,终止：1个GTP,结论：,每合成一个肽键至少消耗4个P。,多聚核蛋白体,（polysome),一个mRNA分子可同时有多个核蛋白体在进行同一种蛋白质的合成，这种mRNA和多个核蛋白体的聚合物称为多聚核蛋白体。,蛋白质合成后加工和输送,Posttranslational Processing&Protein Transportation,第 三 节,从核蛋白体释放出的新生多肽链不具备蛋白质生物活性，必需经过不同的翻译后复杂加工过程才转变为天然构象的功能蛋白。,主要包括,多肽链折叠为天然的三维结构,肽链一级结构的修饰,高级结构修饰,一、多肽链折叠为天然功能构象的蛋白质,新生肽链的折叠在肽链合成中、合成后进行，新生肽链N端在核蛋白体上一出现，肽链的折叠即开始。可能随着序列的不断延伸肽链逐步折叠，产生正确的二级结构、模体、结构域到形成完整的空间构象。,大多数天然蛋白质折叠都需要其他酶和蛋白质的辅助。,几种有促进蛋白折叠功能的大分子,1.分子伴侣(molecular chaperon),2.蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI),3.肽-脯氨酰顺反异构酶(peptide prolyl cis-trans isomerase,PPI),（1）热休克蛋白(heat shock protein,HSP),HSP70、HSP40和GreE族,（2）伴侣素(chaperonins),GroEL和GroES家族,1.分子伴侣,分子伴侣是细胞中一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。,热休克蛋白促进蛋白质折叠的基本作用：,结合保护待折叠多肽片段，再释放该片段进行折叠。形成HSP70和多肽片段依次结合、解离的循环。,HSP40结合待折叠多肽片段,HSP70-ATP复合物,HSP40-HSP70-ADP-多肽复合物,ATP水解,GrpE,ATP,ADP,复合物解离，释出多肽链片段进行正确折叠,伴侣素的主要作用:,为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。,伴侣素系统促进蛋白质折叠过程,2.蛋白二硫键异构酶（PDI）,二硫键异构酶在内质网腔活性很高，可在较大区段肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连接，最终使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象。,3.肽-脯氨酰顺反异构酶,多肽链中肽酰-脯氨酸间形成的肽键有顺反两种异构体，空间构象明显差别。,肽酰-脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两种异构体之间的转换。,肽酰-脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维构象形成的限速酶，在肽链合成需形成顺式构型时，可使多肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠。,二、一级结构的修饰,（一）肽链N端的修饰,（二）个别氨基酸的修饰,（三）多肽链的水解修饰,鸦片促黑皮质素原(POMC)的水解修饰,N,C,信号肽,PMOC,KR,KR,103,肽,(？),ACTH,-LT,-MSH,-MSH,Endophin,三、高级结构的修饰,（一）亚基聚合,（二）辅基连接,（三）疏水脂链的共价连接,蛋白质合成后需要经过复杂机制，定向输送到最终发挥生物功能的细胞靶部位，这一过程称为蛋白质的靶向输送。,四、蛋白质合成后的靶向输送,蛋白质的靶向输送（protein targeting）,所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，主要为N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这一序列称为信号序列。,信号序列(signal sequence),靶向输送蛋白,信号序列或成分,分泌蛋白,信号肽,内质网腔蛋白,信号肽，C端-Lys-Asp-Glu-Leu-COO,-,(KDEL序列),线粒体蛋白,N端靶向序列（2035氨基酸残基）,核蛋白,核定位序列（-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-，SV40 T抗原）,过氧化体蛋白,-Ser-Lys-Leu-（PST序列）,溶酶体蛋白,Man-6-P（甘露糖-6-磷酸）,靶向输送蛋白的信号序列或成分,（一）,分泌蛋白的靶向输送,真核细胞分泌蛋白等前体合成后靶向输送过程首先要进入内质网，再分别被包装成分泌小泡而分泌出细胞。,信号肽,(signal peptide),各种新生分泌蛋白的N端有保守的氨基酸序列称信号肽。,信号肽的一级结构,N端侧碱性区,疏水核心区,C端加工区,信号肽引导真核分泌蛋白进入内质网,（二）,线粒体蛋白的靶向输送,（三）,细胞核蛋白的靶向输送,蛋白质生物合成的干扰和抑制,I,nterference&Inhibition of Protein Biosynthesis,第 四 节,蛋白质生物合成是很多天然抗生素和某些毒素的作用靶点。它们就是通过阻断真核、原核生物蛋白质翻译体系某组分功能，干扰和抑制蛋白质生物合成过程而起作用的。,抗生素(antibiotics),是微生物产生的能够杀灭或抑制细菌的一类药物。,一、抗生素类,四环素族,氯霉素,链霉素和卡那霉素,嘌呤霉素,放线菌酮,抗生素,作用点,作用原理,应用,四环素族（金霉素 新霉素、土霉素）,链霉素、卡那霉素,氯霉素、林可霉素,红霉素,梭链孢酸,放线菌酮,嘌呤霉素,原核小亚基,原核小亚基,原核大亚基,原核大亚基,原核大亚基,真核大亚基,真核、原核核蛋白体,抑制氨基酰-tRNA与小亚基结合,改变构象引起读码错误、抑制起始,抑制转肽酶、阻断延长,抑制转肽酶、妨碍转位,与EFG-GTP结合，抑制肽链延长,抑制转肽酶、阻断延长,氨基酰-tRNA类似物，进位后引起未成熟肽链脱落,抗菌药,抗菌药,抗菌药,抗菌药,抗菌药,医学研究,抗肿瘤药,抗生素抑制蛋白质生物合成的原理,嘌呤霉素作用示意图,二、其他干扰蛋白质生物合成的物质,毒素(toxin),干扰素(interferon),白喉毒素,(diphtheria toxin),的作用机理,干扰素的作用机理,复习思考题：,1.,概念：,（1）翻译 （2）遗传密码,（3）密码的摆动性 （4）氨基酸活化,（5）SD序列 （6）信号肽,（7）分泌性蛋白质 （8）靶向输送,（9）多聚核蛋白体,2.,简述RNA在蛋白质合成中的作用。,3.简述蛋白质生物合成的大体过程。,4.原核生物和真核生物的翻译起始复合物,的生成有何异同？,5.简单介绍信号肽假说的具体内容。,6.按下列DNA单链,5TCGTCGACGATGATCTTCGGCTACTCGA3,试写出：,（1）DNA复制时另一条链的碱基顺序；,（2）以此为模板，转录成mRNA的碱基顺序；,（3）所合成肽链的氨基酸顺序。,