组织化学技术5-免疫组化.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 免疫组织化学,前言,免疫组织化学（Immunohistochemistry）,又称免疫细胞化学。它 是组织化学的分支，,它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织,内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原,位检测技术。,1发展简史,1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体检,测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。,60年代 Nakane建立酶标抗体技术铁,蛋白标记Ab技术。,70年代 Stemberger 改良上述技术，建立,辣根过氧化物酶抗体过氧化物酶（PAP,）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。,80年代 Hsu 等建立了抗生物素生素（ABC）,法之后，免疫金银染色法、半抗原标记法、,免疫电镜技术相继问世。,90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细,胞化学分类方法迅速发展。,2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组,化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综,合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各,个学科，是目前生 命科学工作者应 该掌握的基,本技术之一。,2免疫组织化学的技术分类,（1）根据染色方式分成：贴片染色,漂浮染色,（2）根据AgAb结合方式分成：,直接法,间接法,多层法,（3）按标记物的性质分成：,免疫荧光技术（免疫荧光法）,免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD,法、ABC法）,免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金,染色法、蛋白A金法）,3标记物,（1）,必要性：组织细胞内AgAb结合反应一,般是不可见的，若在镜下检测，则必须,具有可视性标记物。,一、免疫组织化学技术,（一）染色方法,1直接法,荧光素直接标记特异性抗体（抗）,上，标记抗体与抗原结合（在切片上）,荧光显微镜下观察检测抗原。,酶标抗体要显示后镜检。,直接法优点：简单，时间短，特异性强。缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济）。应用：基本不用了！,2间接法,荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动,物的 IgG抗体）。显色后镜检,特点：,较直接法灵敏，可标记一种抗体,鉴定多种抗原。,3非标记Ab桥法：,“桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，,其二抗为未标记桥抗体。,（1）单桥法,(2)双桥法,在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，,可增大染色强度。,特别提示：注意动物种属关系,4PAP法（过氧化物酶抗过氧化物酶法,Peroxidase antiperoxidase method，PAP法）,是桥法的改良，既先形成PAP复合物抗,原抗体抗IgG抗体PAP复合物。,该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染标本可长期保存。,5ABC法（亲和素生物素过氧化物酶复,合物法，Avidinbiotinperoxidase,Complex method，ABC法）,Avidin：亲和素，一种糖蛋白，其上有4个,与生物素相结合的位点。,Biotin：生物素维生素H，两者亲和力巨,大，牢不可破。,（1）ABC复合物的制备：,ABC法与PAP法的区别是：,以ABC复合物代替PAP复合物。,（2）,ABC法反应原理,6SP或SAP法（过氧化物酶标记的链霉卵 白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染 色）,Streptavidin/peroxidase or strepta-vidin/alkaline phosphatase）,该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白,素与链霉（而非生物素）结合，而后再结,合PO。,它有4个亚基可与生物素结合，灵敏特异，背景低，成本低。,现在还有plus盒。优点是：更简便，放大倍数，等电点中性更适合组织。分子量小，穿透力，原理保密。,7蛋白A金法,（ProteinA gold method）,多用于电镜,8双重组化染色法,应用双重免疫组织化学激素可在同一张切,片，同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不,同的抗原。,9免疫金银染色法,（Immunogoldsilver staining IGSS）,（二）固定见前述,注意事项：,1固定剂的选择：因组织而不同，注意质量和,性能。,2固定方式的选择：浸渍固定（参考文献）,灌注固定（+后固定）,蒸汽固定,（三）免疫组化染色步骤（以ABC法为例）,1切片脱蜡入水，入PAS 洗三次/15分钟。,2封闭内源性过氧化物酶。,用新配置的0.3H,2,O,2,（在PAS或0.05Tris,HCL缓冲液PH7.6中或甲醇中）室温，30 分,钟。,3水洗，入PBS，洗三次，每次5分钟。,4减少非特异性着色,用稀释20倍的正常血清（产生二次抗体动物,血清！），室温，30分钟。,5滴加第一抗体，4过液或室温51 hour。,60.1MPBS，洗三次，每次5分钟。,7滴加第二抗体，室温15 60。,80.1MPBS 洗净，洗三次，每次5分钟。,9滴加ABC复合物，室温1560分钟。,100.1MPBS 洗三次，每次5分钟。,110.05M Tris HCL 510分钟，此步可省略。,12DABH,2,O,2,显色：用0.01H,2,O,2,的DAB溶,液，室温530分钟，随时镜检（DAB用时,新配）,13自来水洗净。,14用Mayer 苏木精或0.5甲基绿，复染胞,核（可不染）。,15常规脱水、透明、封固、镜检。,结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。,（四）免疫组化染色基本技术及注意事项,1实验计划,根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。,如AbI鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则,不能用其他动物，而且Ab-必须是羊抗鼠，若,PAP法Ab-必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。,若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差,异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否,则无可比性。,选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。,2Ab稀释度,（如系购买的药盒有工作液和原液）,（1）工作液：无须稀释,（2）原液：,应参照其提供的工作液浓度进行预试验验。,如：工作液浓度为11000，可选1500,11000，11500试验；,若:1500有背景，11000阳性反应稍,浅，可选1750进行试验。,原液的保存（20）冻存应选最佳稀,度冻存。,若工作浓度大于1500则要先将原液稀释,十倍，而后分装10,l/,瓶冻存（-20）,于 冰箱备用。,关于,Ab,保存应参照说明书。,（3）,Ab,浓度的选择,Ab,浓度不可太高或太低，因为,Ag-,Ab,结合需在一定浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少；极过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。并非,Ab,浓度越高越好。,3Ab滴片技术,所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。,注意,滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能,干片。,要领：,甩净组织周围的水。,4PBS洗涤技术,（1）洗涤的目的,保证离子浓度和PH值。,减少非特异反应（平时Ab不可靠很纯）,Ab滴片图示：,（2）方法：洗三次，每次5分钟。,5Ab孵育技术,（1）必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。,（2）温度与时间 4：过液，16,37：1 h or 参考说明书,6光镜控制显色方法,（1）室内操作：注意温度与时间的关系，室温,最宜5分钟。,（2）染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可,加深。,（五）对照组和染色结果的评价,免疫组化染色实验组与对照组结果分析表,从表上可以看出，只有6，7实验结果有意义。15均因对照组的结果已否定Ab的特异性or因IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，必须重复实验or换用Ab。,除上述对照结果分析之外，还必须从以下几,个方面综合评价：,1阳性染色特点,Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构,性。（非特异性细胞与组织无区别）,染色强度不同：颜色深浅不一（非特异性染,色 弥散性均匀）,2组织切片制作过程的影响,固定不良非特异性染色，显示不均。,边缘干燥非特异性染色（常见），加抗体,时勿干片。,3人工假象与特异性结果显示不在同一平面上。,阳性对照：,用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进,行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结,果，标为阳性对照,。,阴性对照,：,用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈,阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性,对照中的一种，阴性对照还应包括空白、,替代、吸收和抑制实验。,染色失败的几种原因：,（1）所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性,对照在内。全部（）原因可能：,染色未完全严格按照操作步骤进行；,漏加一种抗体，或抗体失效；,缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性；,底物中所加H,2,O,2,量少或失效；,复染或脱水剂使用不当,（2）所有切片均呈阳性反应，原因可能是：,切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了。,缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确，,洗涤不彻底。,使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应,时间过长。,抗体温育的时间过长。,H,2,O,2,浓度过高，呈色速度过快。粘附剂太,厚。,（3）,所有切片背景过深，原因可能是：,未加酶消化处理切片。,切片或涂片过厚。,漂洗不够。,底物呈色反应过久。,蛋白质封闭不够或所用血清溶血。,使用全血清抗体稀释不够。,（4）阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴,性反应。,最常见的原因是：标本的固定和处理不当。,二、免疫电镜技术,前言：,免疫电镜技术又称电子显微镜免疫细胞化学技术。是免疫细胞化学与电镜技术相结合的产物，即在电镜下对细胞内抗原做定性或定量的研究。其中免疫铁蛋白技术，免疫胶体金技术，免疫酶细胞化学技术等，皆为常用技术,免疫细胞化学技术细胞水平,（光镜分辨率）,电镜免疫细胞化学技术超微结构水平,（电镜分辨率）,（一）组织固定与取材,要求：即要求保持良好的超微结构，又要求保,持组织的Ag性，固定的选择不宜过强。,常用：1 4多聚甲醛+1戊二醛,2过碘酸赖氨酸多聚甲醛液,（PLP）,液,（二）免疫染色,1.包埋前染色：,即先行免疫染色，在解剖显微,镜下将免疫反应阳性部位取出，修整成小,块，按常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱,水、包埋。,优点：,抗原不易被破坏，易于获得良好的免,疫反应。,可在免疫反应阳性部位定位做超薄,切片，检出率。,缺点：,经过一系列染色步骤，易损伤结构。,应用,：特别适用于含抗原量较少的组织。,2.,包埋后染色,：,组织标本经过固定脱水及树脂包埋、制,成超薄切片后，再进行免疫组化染,色。由,于是以贴在网上的超薄切片进行免疫染色，,故又称载网染色（on,grid staining,）。,优点：,Ultrastructure 保存良好。,超薄切片易穿透，可标记细胞任何,部位。,方法简便，（+）结果高度可重复性。,同一张切片上可进行多重免疫染色。,缺点：,抗原活性可能减弱或消失。,树脂中的组织不易进行免疫反应。,3超薄冰冻切片：,T2.3mol/L（蔗糖）液氮速冻冰冻超薄切片上切片（厚于光镜片）,（三）包埋,1树脂包埋,2低温包埋 K,4,M ：,单体 ，17.3；,支联体，2.70g；,引发剂，0.10g。,（四）免疫电镜包埋前染色前法,4多聚甲醛（0.05MPBS，PH7.2）原位固,定，4，1h 0.05M PBS 充分洗前 处理,0.05M PBS 充分洗前处理。,PAP或ABC染色系列过程呈色。,PBS洗53次。,1戊二醛固定301h，PBS洗。,1锇酸固定301h 。,常规脱水，树脂包埋。,半薄切片定位，超薄切片。,切片复染。,电镜观察。,谢谢！再见！,