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,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,课题,2,土壤中分解尿素细菌分离与计数,专项,2,微生物培养与应用,第1页,第1页,一、课题背景,1,、尿素利用,尿素,是一个主要,农业氮肥。,尿素,不能直接,被农作物,吸取。,土壤中细菌将尿素,分解成氨,之后才干被植物利用。,2,、细菌利用尿素原因,土壤中细菌分解尿素是由于它们,能合成脲酶,CO(NH,2,),脲酶,+H,2,O,+CO,2,NH,3,第2页,第2页,3,、常见分解尿素微生物,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，一些真菌和放线菌也能分解尿素。,4、课题目,从土壤中分离出能够分解尿素细菌,统计每克土壤样品中终归含有多少这样细菌,一,.,研究思绪,.,筛选菌株,.,统计菌落数目,.,设置对照,第3页,第3页,1,、实例：,启示：,寻找目的菌种时要依据它对生存环境要求，到相应环境中去寻找。,原因：,由于热泉温度,70,80,0,C,，淘汰了绝大多数微生物只有,Taq,细菌被筛选出来。,DNA,多聚酶链式反应,是一个在体外将,少许,DNA,大量复制,技术，此项技术要求使用,耐高温（,93,0,C,）,DNA,聚合酶。,第4页,第4页,要分离一个微生物，必须依据该微生物特点，,包括营养、生理、生长条件等；,办法：,克制大多数微生物不能生长,造成有助于该菌生长环境，,结果：,培养一定期间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等办法对它进行纯化培养分离。,2,、试验室中微生物筛选原理：,人为提供有助于,目的菌株,生长条件,(,包括营养、温度、,pH,等,),，同时克制或制止其它微生物生长。,第5页,第5页,15.0g,琼脂,1.0g,尿素,10.0g,葡萄糖,0.2g,MgSO,4,7H,2,O,2.1g,NaH,2,PO,4,1.4g,KH,2,PO,4,3,、土壤中分解尿素细菌分离与计数所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体培养基,第6页,第6页,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：,葡萄糖、尿素,氮源：,尿素,培养基,氮源为尿素,，只有能合成,脲酶,微生物才干分解尿素，以尿素作为氮源。,缺乏,脲酶微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到克制，因此用此培养基就能够选择出分解尿素微生物。,5,、培养基选择分解尿素微生物原理,第7页,第7页,1,、显微镜直接计数：,利用,血球计数板,，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物数量。,.,统计菌落数目：,不能区别死菌与活菌；,不适于对运动细菌计数；,需要相对高细菌浓度；,个体小细菌在显微镜下难以观测；,缺点,第8页,第8页,2.,间接计数法（,活菌计数法）,原理：,在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成一个菌落是由一个单细胞繁殖而成，即一个菌落代表原先一个单细胞。,惯用办法：稀释涂布平板法。,每克样品中菌落数,(CV)M,其中，,C,代表某一稀释度下平板上生长平均菌落数，,V,代表涂布平板时所用稀释液体积,(ml),，,M,代表稀释倍数。,第9页,第9页,注意事项,为了确保结果准确，普通选择菌落数在,30300,平板上进行计数。,为使结果靠近真实值可将,同一稀释度加到三个或三个以上平皿中,，经涂布，培养计算出菌落平均数。,统计菌落往往比活菌实际数目低。,涂布平板法所选择稀释度很主要，普通以三个稀释度中第二个稀释度所出现平均菌落数在,50,个左右为最好。,第10页,第10页,计数法,直接计数法、,平板计数法、,比浊法、,膜过滤法,第11页,第11页,例题：统计菌落数目办法有 （）,A.B.,C.D.,D,涂布平板法 重量法 直接计数法 比浊法 生理指标法 膜过滤法,第12页,第12页,设置对照主要目的,是排除试验组中非测试原因对试验结果影响，提升试验结果可信度。,.,设置对照：,实例：在做分解尿素细菌筛选与统计菌落数目的试验时，,A,同窗从相应,10,6,倍稀释培养基中筛选出大约,150,个菌落，但是其它同窗在同样稀释度下只选择出大约,50,个菌落。分析其原因。,原因：土样不同，培养基污染或操作失误(或者是混入了其它含氮物质),第13页,第13页,小结：通过这个事例能够看出，试验结果要有说服力，对照设置是必不可少。,方案一：,由其它同窗用与,A,同窗相同土样进行试验,方案二：,将,A,同窗配制培养基在不加土样情况下进行培养，作为空白对照，以证实培养基是否受到污染。,结果预测：假如结果与A同学一致，则证实A无误；假如结果不同，则证实A同学存在操作失误或培养基配制有问题。,第14页,第14页,二,.,试验详细操作,.,土壤取样,从肥沃、湿润土壤中取样。先铲去表层土,3cm,左右，再取样，将样品装入事先准备好信封中。,取土样用小铁铲和盛土样信封在使用前都要灭菌。,.,制备培养基：,制备以尿素为唯一氮源,选择培养基,。,第15页,第15页,应在火焰旁称取土壤,10g,。,在稀释土壤溶液过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同微生物采取不同稀释度,原因：不同微生物在土壤中含量不同,目标：确保获得菌落数在30300之间、适于计数平板,三,样品稀释,第16页,第16页,为何分离不同微生物要采取不同稀释度？测定土壤中细菌总量和测定土壤中能分解尿素细菌数量，选取稀释范围相同吗？,原因：土壤中各类微生物数量（单位：株/kg）是不同。比如在干旱土壤中上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。,结论：为取得不同类型微生物，就需要按不同稀释度进行分离，同时还应该有针对性地提供选择培养条件。,第17页,第17页,.,取样涂布,试验时要对培养皿作好标识。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,假如得到了,2,个或,2,个以上菌落数目在,30300,平板，则阐明稀释操作比较成功，并能够进行菌落计数，假如,同一稀释倍数三个重复菌落数相差较大，表明试验不准确,，需要重新试验。,第18页,第18页,.,微生物培养与观测,在菌落计数时，每隔,24h,统计一次菌落数目。,选取菌落数目稳定期统计作为结果，,以预防因培养时间不足而造成漏掉菌落数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。,细菌：3037培养12d,放线菌：2528培养57d,霉菌：2528温度下培养34d。,第19页,第19页,微生物培养与观测,第20页,第20页,三.结果分析与评价,1.通过对照试验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素微生物。,2.提醒：选择每个平板上长有30300个菌落稀释倍计算每克样品菌数最适当。同一稀释倍数三个重复菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示试验不精确。,第21页,第21页,四、操作提醒,无菌操作,做好标识,规划时间,第22页,第22页,五,.,课外延伸,在以尿素为唯一氮源培养基中加入酚红批示剂。培养某种细菌后，假如,PH,升高，批示剂将变红，阐明该细菌能够分解尿素,。,测定饮水中大肠杆菌数量办法是将一定体积水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌,菌落呈现黑色,，通过记述得出水样中大肠杆菌数量。,第23页,第23页,大肠杆菌呈 黑色中心,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊,红美蓝琼脂,(EMB),上典型特性,第24页,第24页,本课题知识小结,:,第25页,第25页,六、例题解析,例,1,对细菌群体生长规律测定正确表述是,A,在液体培养基上进行,B,至少接种一个细菌,C,接种一个细菌,D,及时补充消耗营养物质,解析：细菌群体,生长规律测定,是人们在一定条件下进行。这些条件是：一,种细菌、恒定容积培养基，液体培养基、定期测定细菌总数,。在这些条件下，才干测定出细菌生长规律。测定期只能用一个细菌子细胞群体改变规律表示微生物生长；恒定容积是给微生物提供一定生存环境；液体培养基才干通过样品推测细菌总数。若接种各种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一个微生物生长规律。在接种时，要确保一定接种量。,答案：,A,第26页,第26页,例,2,在微生物群体生长规律测定中，种内斗争最明显最激烈时期是,A,调整期,B,对数期,C,稳定期,D,衰亡期,解析：种内斗争是一个生态原因。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源争夺。在生活空间富余，营养充足时候，种内斗争程度是比较低。伴随微生物个体数目的增长，每个个体生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在,稳定期,种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物数目已经开始减少，,pH,已经极度不适于微生物生存，次级代谢产物积累到很高程度，这时微生物生存斗争主要是与无机环境斗争。,答案：,C,第27页,第27页,1.,对细菌群体生长规律测定正确表述是（）,A.,在液体培养基上进行,B.,至少接种一个细菌,C.,接种一个细菌,D.,及时补充消耗营养物质,2.,使用选择培养基目的是（）,A.,培养细菌,B.,培养真菌,C.,使需要微生物大量繁殖,D.,表现某微生物特定性状与其它微生物加以区别,3.,能合成脲酶微生物所需要碳源和氮源分别是,(),A.CO,2,和,N,2,B.,葡萄糖和,NH,3,C.CO,2,和尿素,D.,葡萄糖和尿素,实践训练,A,C,D,第28页,第28页,4.,下列说法不正确是（）,A.,科学家从,70,80,度热泉中分离到耐高温,TaqDNA,聚合酶,B.,统计某一稀释度,5,个平板菌落数依次为,M1,、,M2,、,M3,、,M4,、,M5,，以,M3,作为该样品菌落数预计值,C.,设置对照试验主要目的是排除试验组中非测试原因对试验结果影响，提升试验结果可信度,D.,同其它生物环境相比，土壤中微生物数量最大，种类最多。,5.,为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）,A.,较多氮源物质,B.,较多碳源物质,C.,青霉素类药物,D.,高浓度食盐,B,C,第29页,第29页,例3（江苏）抗生素作为治疗细菌感染药物，其高效性和巨大经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素发觉和应用含有划时代意义。,青霉素发酵产生青霉素。青霉菌新陈代谢类型是 ，青霉素是青霉菌 代谢产物。,在生产和科研中，常选取处于 期青霉菌作为菌种或研究材料，由于此时青霉菌代谢旺盛，和 比较稳定。,对青霉菌菌体生长情况测定：取一定体积发酵液，经离心分离、重复洗涤后，再计算发酵罐中菌体总重量。,异养需氧型,次级,对数,个体形态,生理特性,称菌体湿重,（称烘干后重量）,第30页,第30页,下课了,第31页,第31页,
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