代谢工程专题知识.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 微生物代谢调整和代谢工程,第一节 微生物代谢自我调整,第二节 代谢调控,第三节,次级代谢产物主要调控机制,第四节 代谢工程,代谢工程专题知识专家讲座,第1页,【,教学目标与要求,】掌握微生物本身代谢和次级代谢机理、相关概念及代谢调控，了解代谢工程设计方向。,【,教学重点与难点】,微生物本身代谢和次级代谢机理、相关概念及代谢调控。,代谢工程专题知识专家讲座,第2页,微生物生长繁殖和,新陈代谢,代谢类型：,主要依赖两种代谢路径：,分解代谢,合成代谢,代谢工程专题知识专家讲座,第3页,分解代谢,:指复杂有机物分子经过分解代谢酶系催化，产生简单分子、腺苷三磷酸（,ATP,）形式能量和还原力（或称还原当量，普通用,H,来表示）作用。,微生物经过分解代谢从环境中吸收各种碳源、氮源等物质降解，为生命活动提供能源和小分子中间体。,包含：中心路径如TCA、EMP、HMP及外围路径（指碳源、氮源经过分解进入中心路径）,代谢工程专题知识专家讲座,第4页,合成代谢,与分解代谢恰好相反，指在合成代谢酶系催化下，由简单小分子、,ATP,形式能量和,H,形式还原力一起合成复杂大分子过程。,或利用分解代谢能量和中间体合成氨基酸、核酸等单体物质及蛋白质、多糖等多聚物。,分解代谢与合成代谢是相互关联、相互制约，是生命活动基础。,正常微生物小分子物质合成和降解是本身调整。,代谢工程专题知识专家讲座,第5页,研究微生物代谢调整意义,十分主要，在工业上可经过对微生物代谢路径加以控制来满足生产需要。,如：谷氨酸发酵菌种：,代谢工程专题知识专家讲座,第6页,微生物代谢产物可分为：,初级代谢产物,定义：,微生物经过代谢活动所产生、本身生长和繁殖所必需物质。,举例：,氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。,特征,：,不一样微生物初级代谢产物基本相同；,初级代谢产物合成过程是连续不停，,与菌体生长呈平行关系。,代谢工程专题知识专家讲座,第7页,次级代谢产物,定义：,微生物生长到一定阶段才产生化学结构十分复杂、对该微生物无显著生理功效，或并非是微生物生长和繁殖所必需物质。,举例：,抗生物、毒素、激素、色素等。,特征,：,不一样微生物次级代谢产物不一样；,次级代谢产物通常在菌体生长后期合成，发酵分两个阶段进行，即营养增殖期和生产期。,在多数情况下，增加前体是有效,代谢工程专题知识专家讲座,第8页,两种代谢产物不一样：,1、次级代谢通常在,生长后期合成,。,不是微生物生长所必需，,不参加微生物生长和繁殖。,2、次级代谢对环境条件改变很敏感，其产物合成往往会因环境条件改变而停顿。,3、不一样微生物次级代谢产物有很大区分。,基于菌种特异性,4、催化次级代谢产物合成一些酶专,一性不强。,代谢工程专题知识专家讲座,第9页,第一节 微生物代谢自我调整,微生物有着一整套可塑性极强和极准确代谢调整系统，以确保上千种酶能正确无误、有条不紊地进行极其复杂新陈代谢反应。,代谢工程专题知识专家讲座,第10页,微生物细胞代谢调整方式很多，比如可调整营养物质透过细胞膜而进入细胞能力，经过酶定位以限制它与对应底物靠近，以及调整代谢流等。,其中以调整代谢流方式最为主要，它包含两个方面，一是“粗调”，即调整酶合成量，二是“细调”，即调整现成酶分子催化活力，二者往往亲密配合和协调，以到达最正确调整效果。,代谢工程专题知识专家讲座,第11页,微生物自我调整部位,1养分吸收和排泄 细胞膜,2限制基质与酶靠近,3控制通量：,调整现有酶量和改变酶分子活性,都包括到酶促反应调整,包含酶活性调整和和酶合成调整,代谢工程专题知识专家讲座,第12页,一、酶活性调整,酶活性调整：,指在酶分子水平上一个代谢调整，它是经过改变现成酶分子活性来调整新陈代谢速率。,酶活性,抑制,激活,是微生物代谢中存在两种矛盾过程。,代谢工程专题知识专家讲座,第13页,酶活性激活系指在分解代谢路径中，后面反应可被较前面中间产物所促进。,酶活性抑制主要是反馈抑制，它主要表现在某代谢路径末端产物（即终产物）过量时，这个产物可反过来直接抑制该路径中第一个酶活性，促使整个反应过程减慢或停顿，从而防止了末端产物过多累积。,代谢工程专题知识专家讲座,第14页,图：大肠杆菌代谢过程抑制剂和激活剂,代谢工程专题知识专家讲座,第15页,（一）酶活性激活,常见酶活性激活是前体激活，多发生在分支代谢路径，即代谢路径中后面反应可被较前面一个代谢中间产物所促进。,如：粗糙脉胞酶异柠檬酸脱氢酶活性受到柠檬酸激活。,代谢工程专题知识专家讲座,第16页,（二）酶活性抑制,酶活性抑制包含：,竞争性抑制 反馈抑制,反馈抑制：指反应路径中一些中间产物或末端产物对该路径中前面反应影响。,凡是反应加速地称为正反馈；,凡是反应减速称为负反馈。,末端产物反馈抑制普遍存在于合成路径中。,反馈抑制：直链式,分支代谢路径：两种以上末端产物,代谢工程专题知识专家讲座,第17页,反馈抑制类型,1,直线式代谢路径中反馈抑制,代谢工程专题知识专家讲座,第18页,2分支代谢路径中反馈抑制。,反馈抑制情况较为复杂。,为防止在一个分支上产物过多时不致同时影响另一分支上产物供给，微生物已发展出各种调整方式。,代谢工程专题知识专家讲座,第19页,（1）同功酶调整,同功酶是指能催化相同生化反应，但酶蛋白分子结构有差异一类酶，它们虽同存于一个个体或同一组织中，但在生理、免疫和理化特征上却存在着差异。,同功酶主要功效在于其代谢调整。,代谢工程专题知识专家讲座,第20页,在一个分支代谢路径中，假如在分支点以前一个较早反应是由几个同功酶所催化时，则分支代谢几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用。,如：大肠杆菌,天冬氨族氨基酸合成路径中，有三个同工酶天冬氨酸激酶 分别受赖氨酸、苏氨酸、硫氨酸反馈调整,代谢工程专题知识专家讲座,第21页,（2）协同反馈抑制：,指分支代谢路径中几个末端产物,同时过量,时才能抑制共同路径中第一个酶一个反馈调整方式。,如：谷氨酸棒杆菌合整天冬氨族氨基酸时，天冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸协同反馈抑制。,代谢工程专题知识专家讲座,第22页,（3）累积反馈抑制：催化分支合成路径第一步反应酶有几个末端产物抑制物，但每一个如过量，按一定百分率单独抑制共同路径中第一个酶活性，总抑制效果是累加，各末端产物所起抑制作用互不影响，只影响这个酶促反应速率。,两种末端产物同时存在时，能够起着比一个末端产物大得多反馈抑制作用。,代谢工程专题知识专家讲座,第23页,（4）增效反馈抑制：代谢路径中任何一个末端产物过量时，仅部分抑制共同路径中第一个酶活性，但两个末端产物同时过量时，其抑制作用可超出各产物存在抑制能力总和。如6-氨基嘌呤核苷酸和6-酮基嘌呤核苷酸合成路径。,代谢工程专题知识专家讲座,第24页,（5）次序反馈抑制：每个分支末端产物抑制分支后第一个酶，产生部分抑制作用。经过逐步有次序方式到达调整。,如枯草芽孢杆菌芳香族氨基酸合成路径和球型红假单胞菌苏氨酸合成路径。,代谢工程专题知识专家讲座,第25页,当E过多时，可抑制CD，这时因为C浓度过大而促使反应向F、G方向进行，结果又造成了另一末端产物G浓度增高。因为G过多就抑制了CF，结果造成C浓度深入增高。C过多又对AB间酶发生抑制，从而到达了反馈抑制效果。这种经过逐步有次序方式到达调整，称为次序反馈抑制。,代谢工程专题知识专家讲座,第26页,二、酶合成调整（酶量）,酶合成调整是一个经过调整酶合成量进而调整微生物代谢速率。,这是一个在基因水平上（在原核生物中主要在转录水平上）代谢调整。,有诱导调整和阻遏调整。,依据酶生成是否与环境中所存在该酶底物或其相关物关系，可把酶划分成,组成酶,和,诱导酶,两类。,代谢工程专题知识专家讲座,第27页,有些酶合成不依赖于环境中物质存在（如糖酵解路径中各种酶），称为组合酶。,另一些酶只有在它们催化底物（或底物结构类似物）存在时才能合成，此种酶称为诱导酶。,凡能促进酶生物合成现象，称为诱导。,能妨碍酶生物合成现象，则称为阻遏。,代谢工程专题知识专家讲座,第28页,与上述调整酶活性反馈抑制等相比，调整酶合成（即产酶量）而实当代谢调整方式是一类,较间接而迟缓,调整方式。,其优点则是经过阻止酶过量合成，有利于节约生物合成原料和能量。,在正常代谢路径中，酶活性调整和酶合成调整二者是同时存在且亲密配合、协调进行。,代谢工程专题知识专家讲座,第29页,（一）酶合成调整类型,1,诱导,诱导酶：,另一些酶只有在它们催化底物（或底物结构类似物）存在时才能合成，此种酶称为诱导酶。,诱导酶是细胞为适应外来底物或其结构类似物而暂时合成一类酶。,代谢工程专题知识专家讲座,第30页,能促进诱导酶产生物质称为诱导物，它能够是该酶底物，也能够是难以代谢底物类似物或是底物前体物质。,外源诱导物：外源加入。,内源诱导物：菌体代谢路径一些中间产物也能诱导该路径一些酶系合成，这些中间产物称为内源诱导物。,代谢工程专题知识专家讲座,第31页,代谢工程专题知识专家讲座,第32页,酶诱导合成类型,同时诱导,:当诱导物加入后，微生物能同时或几乎同时诱导几个酶合成，它主要存在于短代谢路径中。比如，将乳糖加入到Ecoli培养基中后，即可同时诱导出-半乳糖苷透性酶、-半乳糖苷酶和半乳糖苷转乙酰酶合成；,次序诱导,:先合成能分解底物酶，再依次合成份解各中间代谢物酶，以到达对较复杂代谢路径分段调整。,代谢工程专题知识专家讲座,第33页,2,阻遏,在微生物代谢过程中，当代谢路径中某末端产物过量时，除用反馈抑制方式来抑制该路径中关键酶活性以降低末端产物生成外，,经过阻遏作用来妨碍代谢路径中包含关键酶在内一系列酶生物合成，从而更彻底地控制代谢和降低末端产物合成。,代谢工程专题知识专家讲座,第34页,反馈阻遏：指代谢终产物到达一定浓度时，反馈阻遏该代谢路径一个或几个酶生物合成。,阻遏作用有利于生物体节约有限养料和能量。,阻遏类型主要有两种:,末端代谢产物阻遏,分解代谢产物阻遏,。,代谢工程专题知识专家讲座,第35页,（1）末端产物阻遏,定义：指由某代谢路径末端产物过量累积而引发阻遏。,对直线式反应路径，末端产物阻遏情况较为简单，即,产物作用于代谢路径中各种酶，使之合成受阻遏。,代谢工程专题知识专家讲座,第36页,对分支代谢路径来说，情况就较复杂。,每种末端产物仅专一地阻遏合成它那条分支路径酶。,多价阻遏,：,有两种或两种以上末端产物分支代谢路径中，当分支代谢路径中几个末端产物同时过量就反馈阻遏其分支点以前共同路径“公共酶”合成，仅一个产物过量无阻遏作用,。,末端产物阻遏在代谢调整中有着主要作用，它可确保细胞内各种物质维持适当浓度。,代谢工程专题知识专家讲座,第37页,代谢工程专题知识专家讲座,第38页,（,2,）分解代谢产物阻遏,定义：指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）或其分解产物存在时，被菌体快速利用那种分解底物会阻遏利用慢底物相关酶合成现象,。,分解代谢物阻遏作用，并非因为快速利用碳源本身直接作用结果，而是经过碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生中间代谢物所引发阻遏作用。,所以，分解代谢物阻遏作用，就是指代谢反应链中，一些中间代谢物或末端代谢物过量累积而阻遏代谢路径中一些酶合成现象。,代谢工程专题知识专家讲座,第39页,两种调整对比,酶合成调整,酶活性调整,不一样点,调整对象,经过酶量改变控制代谢速率,控制酶活性，不包括酶量改变,调整效果,相对迟缓,快速、精细,调整机制,基因水平调整，调整控制酶合成,酶分子水平调整，调整酶活性,相同点,细胞内两种方式同时存在，亲密配合，高效、准确控制代谢正常进行。,代谢工程专题知识专家讲座,第40页,三、能荷调整,能荷指细胞中ATP、ADP、AMP系统中可供利用高能磷酸键量度。,能荷调整（或称腺苷酸调整）：指细胞经过改变ATP、ADP、AMP三者百分比来调整其代谢活动。,细胞内3种腺苷酸含量不一样，细胞能荷状态不一样。能荷状态用“能荷”表示,代谢工程专题知识专家讲座,第41页,当细胞内全部为ATP，能荷为100%,当细胞内全部为ADP，能荷为50%,ATP能够认为是糖分解代谢末端产物，当ATP过量就对糖分解代谢产生反馈抑制，当ATP降解为ADP，能量释放于其它生化反应，反馈抑制被解除。,代谢工程专题知识专家讲座,第42页,R曲线合成系统，如磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶等。,U曲线消耗ATP酶系，柠檬酸裂解酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPP)等。,当能荷0.75，合成受到抑制，酶活性急速下降，消耗ATP酶活性急速上升。两系统在0.85处交叉，酶系到达平衡。,这种现象存在于许多生长状态细胞中。细胞经过调整腺苷酸百分比，来协调分解代谢与合成代谢代谢速率。,代谢工程专题知识专家讲座,第43页,第二节 代谢调控,微生物在正常生长条件下，能够经过自我调整使机体内代谢路径与代谢类型相互协调与平衡，通常不会过量积累初级代谢产物。在某种条件下，过量积累中间代谢产物也能够被诱导酶转化为次级代谢产物。但在人为条件控制下，能够使微生物过量产生各种初级代谢产物和次级代谢产物。,初级代谢产物控制比较简单。它形成普通只需要营养条件即可生成。经过改变发酵工艺条件如pH、温度、培养基组成和微生物遗传特征等，到达改变菌体内代谢平衡，过量产生所需要产物目标,。,代谢工程专题知识专家讲座,第44页,可经过发酵条件控制,改变细胞渗透性,改变菌种遗传特征,代谢工程专题知识专家讲座,第45页,一、,发酵条件控制,1,各种发酵条件对微生物代谢影响,同一个微生物在一样培养基中进行培养时，只要控制不一样发酵条件。就可能取得不一样代谢产物。,如：啤酒酵母在中性和酸性条件下培养，可将葡萄糖氧化生成乙醇和二氧化碳；当在培养基中加入亚硫酸氢钠或在碱性条件下培养时，则并不产生乙醇，而是产生甘油。,代谢工程专题知识专家讲座,第46页,代谢工程专题知识专家讲座,第47页,控制不一样发酵条件，实际上是影响微生物本身代谢调整系统，而改变其代谢方向，使之按人们所需要方向进行，进而到达,取得高浓度积累所需要产物,目标。,代谢工程专题知识专家讲座,第48页,2,使用诱导物,许多与蛋白质、糖类或其它物质降解相关酶类都是诱导酶，在发酵过程中加入对应底物作为诱导物，能够有效地增加这些酶产量。,如：在木霉发酵生产纤维素酶中，加入槐糖能够诱导纤维素酶产生；木糖能够诱导半纤维素酶生成。青霉素酰化酶可用苯乙酸为诱导物。乙内酰胺酶发酵时，能够底物类似物为诱导物增加酶产量。,代谢工程专题知识专家讲座,第49页,3,添加生物合成前体,仅参加色氨酸最终阶段合成，假如在发酵中加入邻氨基苯甲酸，即使色氨酸对第一个酶反馈抑制依然存在，但对由邻氨基苯甲酸合成色氨酸并无影响，使色氨酸合成能够不停进行，从而大幅度提升了发酵产量。,色氨酸生物合成路径,代谢工程专题知识专家讲座,第50页,4,培养基成份和浓度控制,培养基即要确保微生物机体生长需要，又要利于代谢产物合成，须考虑其组成和浓度，尽可能防止培养基使用不妥引发分解代谢阻遏。,在发酵培养基中通常采取适量速效和迟效碳源、氮源配比，来满足机体生长需要和防止速效碳、氮源可能引发分解代谢阻遏。,比如，用甘油代替果糖作为碳源培养嗜热脂肪酵母，能够使淀粉酶产量提升,25,倍以上；,用甘露糖代替乳糖作为培养荧光假单胞菌碳源，使纤维素酶产量提升,1500,倍以上。,代谢工程专题知识专家讲座,第51页,改变细胞透性,在发酵过程中，能够控制使用那些影响细胞膜通透性物质作为培养基成份，有利于代谢产物分泌出来，防止了末端产物反馈调整,。,比如，利用棒状杆菌,-,酮戊二酸脱氢酶缺失突变株，在葡萄糖培养基中发酵生产谷氨酸，当谷氨酸浓度到达,50mg,/,g(,干细胞,),时，因为反馈调整作用，谷氨酸合成便终止。若将细胞中谷氨酸释放出细胞，而使胞内谷氨酸浓度降低，就能够解除反馈抑制，使谷氨酸继续合成。,代谢工程专题知识专家讲座,第52页,改变细胞通透性方法：,1、限制培养基中生物素浓度在15mg/L，控制细胞膜中脂质合成；,2、加入青霉素，抑制细胞壁肽聚糖合成中肽链交联,；,3、还可加入表面活性剂如吐温80或阳离子表面活性剂，将脂类从细胞壁中溶解出来，使细胞壁疏松，通透性增加；,4、控制,Mn,2+,、,Zn,2+,浓度，干扰细胞膜或细胞壁形成。,另外，还能够经过诱变育种方法，筛选细胞透性突变株。,代谢工程专题知识专家讲座,第53页,一样增加细胞壁或细胞膜通透性，对一些胞外酶分泌也有一定作用。如在里氏木霉发酵过程中加入吐温,80,，可提升纤维素酶产量。,代谢工程专题知识专家讲座,第54页,改变菌种遗传特征,反馈调整是微生物预防合成代谢产物过量产生主要机制，解除反馈调整作用能够确保高水平积累各种代谢产物，除上所述外，改变微生物遗传特征，即改变酶活性或酶合成系统，使之对反馈调整不敏感，也能够到达过量生产代谢产物目标。,代谢工程专题知识专家讲座,第55页,筛选抗反馈调整突变株,：,经过诱变育种方法取得。包含营养缺点型突变株、抗反馈调整突变株、组成型突变株、抗性突变株等应用。,比如，在分支合成路径中，利用黄色短杆菌抗,-,氨基-,-羟戊酸,(,苏氨酸一个结构类似物,),突变株发酵生产苏氨酸，因为该菌株同型丝氨酸脱氢酶对苏氨酸反馈抑制不敏感，能够使发酵液中苏氨酸浓度高达,14g,/L。,代谢工程专题知识专家讲座,第56页,代谢工程专题知识专家讲座,第57页,在分支合成路径中能够利用营养缺点型突变株生产其中一个末端产物。,选择高丝氨酸脱氢酶营养缺点型。大量生产赖氨酸。,代谢工程专题知识专家讲座,第58页,在直链式合成路径中，不能利用营养缺点型突变株生产该路径中末端产物，但能够利用这种菌株生产中间产物。,比如，利用谷氨酸棒状杆菌营养缺点型,(,转氨甲酰酶缺点,),能够大量积累鸟氨酸。,分支合成路径中，也能够利用双重营养缺点型生产某种代谢产物。,比如利用谷氨酸棒状杆菌苏氨酸、甲硫氨酸双重营养缺点型进行发酵，能够过量合成赖氨酸，赖氨酸浓度可达,50g,/L。,A B C D E,代谢工程专题知识专家讲座,第59页,除了利用抗反馈调整突变株和营养缺点型菌株生产外，还能够利用既是抗反馈调整突变株，又是营养缺点型菌株双重突变株进行氨基酸发酵。,比如，利用甲硫氨酸营养缺点型和抗,-氨基-,羟戊酸黄色短杆菌过量合成苏氨酸；,利用酪氨酸营养缺点型和抗对氨基苯丙氨酸谷氨酸棒杆菌高水平积累苯丙氨酸。,代谢工程专题知识专家讲座,第60页,天冬氨酸,人工控制黄色短杆菌代谢过程生产赖氨酸？,中间产物,天冬氨酸激酶,中间产物,甲硫氨酸,苏氨酸,高丝氨酸,赖 氨 酸,营养缺点,代谢工程专题知识专家讲座,第61页,第三节,次级代谢产物主要调控机制,次级代谢是存在于一些生物如植物和一些微生物中一类特殊代谢类型，次级代谢产物与人类生活和健康长寿有着亲密关系，所以对其研究受到了广泛地重视。研究最多、最著名是抗生素，其它包含生长刺激素、生物碱、维生素、色素、毒素等。,代谢工程专题知识专家讲座,第62页,一、次级代谢调整类型,因为次级代谢产物种类在不一样微生物中非常不一样，所以次级代谢路径远比初级代谢复杂，其代谢调整类型多样亦可想而知。已知抗生素等次级代谢产物生物合成调控类型包含诱导调整、碳分解产物调整、氮分解产物调整、磷酸盐调整、反馈调整、生长速度调整等。,代谢工程专题知识专家讲座,第63页,酶合成诱导调整,在次级代谢路径中，一些酶也是诱导酶，在底物或底物结构类似物存在时才会产生。,比如，卡那霉素-乙酰转移酶是在,6,-氨基葡萄糖-,2,-脱氧链霉胺（底物）诱导下才能合成。,参加展开青霉棒曲霉素合成酶是被生物合成中,中间产物,6,-氨基水杨酸,、,龙胆酰醇和龙胆酰醛次序诱导合成,。,代谢工程专题知识专家讲座,第64页,反馈调整,反馈调整在次级代谢产物生物合成中有着主要作用，包含,次级代谢产物本身反馈调整、,分解代谢产物调整、,初级代谢产物反馈调整。,代谢工程专题知识专家讲座,第65页,1、次级代谢产物本身反馈抑制和反馈阻遏,在各种次级代谢产物发酵中，如青霉素、链霉素、卡那霉素、氯霉素、嘌呤霉素、霉酚酸、杀真菌素、麦角碱等生物合成路径中，都发觉了末端产物反馈调整作用。,代谢工程专题知识专家讲座,第66页,比如：,嘌呤霉素合成路径中,，嘌呤霉素能够反馈抑制其生物合成路径中催化最终一步反应酶甲基转移酶活性；,卡那霉素合成路径中,，卡那霉素能够反馈抑制其合成路径中催化最终一步反应酶,N-,乙酰卡那霉素转移酶活性；,麦角碱合成路径中,，麦角碱能抑制合成路径中二甲基丙烯色氨酸合成酶和裸麦素碱环化酶活性；,氯霉素合成路径中,，氯霉素能反馈阻遏其合成路径中第一个酶芳香胺合成酶活性，但不影响产生菌体内其它芳香化酶活性。,代谢工程专题知识专家讲座,第67页,抗生素生产菌生产能力与本身抑制所需抗生素浓度呈正相关性，生产能力越高菌株，反馈抑制所需抗生素浓度也越高。,如产黄青霉,Q,176,生产能力为,420,g/ml,，受到抑制浓度为,2mg/ml,；,产黄青霉菌株,RL,1951,生产能力为,125,g/ml,，受到抑制浓度为,200,g/ml,。,代谢工程专题知识专家讲座,第68页,2分解代谢产物调整,定义：指易被菌体快速利用碳源和氮源及其分解产物对其它代谢路径酶类调整作用。,代谢工程专题知识专家讲座,第69页,在许多抗生素发酵中，都发觉了葡萄糖抑制作用，如青霉素、盐霉素、春日霉素、吲哚霉素、放线菌素、卡那霉素、新霉素、杆菌肽等。,次级代谢产物生物合成，普通是在葡萄糖等速效碳源耗至一定浓度才开始。除了葡萄糖外，凡能促进产生菌生长速度碳源，对次级代谢产物生物合成都表现出抑制作用。次级代谢产物合成速率与产生菌生长速率呈相反关系。,比如，在放线菌素生物合成中氧化酚嗯嗪合成酶，受葡萄糖阻遏。短杆菌肽合成中，葡萄糖分解生成乙酸和丙酸，在低,pH,条件下对短杆菌肽合成产生阻遏作用。,代谢工程专题知识专家讲座,第70页,氮分解代谢产物调整也存在于次级代谢中。,比如，以铵盐作为链霉素产生菌唯一氮源时，能够抑制链霉素合成；,在利用烟曲霉生产三羟甲苯中，无机氮源有利于菌体生长，但不利于三羟甲苯合成；,氮分解代谢产物阻遏作用也存在于头孢霉素生物合成中。,代谢工程专题知识专家讲座,第71页,3初级代谢产物调整,一些初级代谢产物能够调整次级代谢产物合成，有两种情况：,1,初级代谢产物和次级代谢产物合成有一条共同合成路径,，当初级代谢产物积累时，反馈抑制了某一步反应进行，而最终抑制了次级代谢产物合成。,2,初级代谢产物直接参加次级代谢产物生物合成,，,即初级代谢产物是次级代谢产物生物合成前体,，当此种初级代谢产物因为积累，反馈抑制了它本身合成时，必定也同时影响了次级代谢产物合成。,代谢工程专题知识专家讲座,第72页,如：青霉素合成中，赖氨酸过量抑制了同型,(,高异,),柠檬酸合成，进而抑制了-氨基己二酸形成，这么即抑制了赖氨酸合成，也抑制了青霉素合成，因为赖氨酸与青霉素合成有一段共同合成路径,代谢工程专题知识专家讲座,第73页,(三)磷酸盐调整,在抗生素等各种次级代谢产物合成中，高浓度磷酸盐表现出较强抑制作用，称为磷酸盐调整。磷是微生物生长繁殖必需元素，浓度为,0.3,300mmol,/,L,时，能支持微生物细胞生长，但当浓度超出,10mmol,/,L,时，就能抑制许多抗生素生物合成。所以，磷酸盐是一些次级代谢限制原因。,代谢工程专题知识专家讲座,第74页,微生物合成次级代谢产物路径不一样，磷酸盐表现调整机制也不一样,。,代谢工程专题知识专家讲座,第75页,1、磷酸盐能促进初级代谢，抑制菌体次级代谢,在微生物代谢中，磷酸盐除影响糖代谢、细胞呼吸及细胞内,ATP,水平外，还控制着产生菌,DNA,、,RNA,、蛋白质和次级代谢产物合成。,如：向正在合成杀假丝菌素灰色链霉菌培养液中添加,5mmol,磷酸盐，产生菌对氧需要量显著增加，抗生素合成马上停顿，同时细胞内,RNA,、,DNA,和蛋白质合成速率恢复到菌体生长时期速率。当磷酸盐被耗尽时，菌体呼吸强度，,DNA,、,RNA,和蛋白质合成速率又降至抗生素合成期状态，抗生素重新开始合成。,代谢工程专题知识专家讲座,第76页,2过量磷酸盐抑制次级代谢产物前体生物合成,在链霉素合成中，肌醇是合成链霉胍前体,(,链霉胍是组成链霉素亚单位,),，是由葡萄糖衍生来。过量磷酸盐能引发菌体内焦磷酸浓度增高，焦磷酸是催化,6,-磷酸葡萄糖向,1,-磷酸肌醇转化,6,-磷酸葡萄糖环化醛缩酶竞争性抑制剂。所以，培养液中磷酸盐浓度高时就抑制肌醇形成，则必定影响链霉素产量。,代谢工程专题知识专家讲座,第77页,3磷酸盐阻抑次级代谢中磷酸酯酶,在链霉素等生物合成路径最终一个中间体，是无生物活性磷酸化产物,链霉素磷酸酯,。此酯在磷酸酯酶作用下生成对应链霉素和磷酸。另外在链霉素生物合成中有三步是在磷酸酯酶作用下去磷酸反应。上述磷酸酯酶受到无机磷酸盐调整。所以在链霉素等氨基糖苷类抗生素发酵生产时，要很好控制发酵培养基中磷酸盐浓度。,代谢工程专题知识专家讲座,第78页,(四)ATP调整作用,在研究四环素生物合成过程中发觉，产生菌体内,ATP,水平调整着四环素合成。,代谢工程专题知识专家讲座,第79页,丙二酰CoA是四环素合成前体。在菌体生长旺盛期，乙酰,CoA,羧化酶活性高，而磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和羧基转移酶活力很低，在四环素合成期与其相反。,菌体生长时期，过量无机磷和ATP对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶抑制作用沿左侧路径进行，合成时期沿绿色路径进行。,代谢工程专题知识专家讲座,第80页,(五)产生菌生长速率调整,在丰富培养基中进行分批发酵动力学研究表明，大多数发酵过程都分为生长久和生产期。在生长久次级代谢产物合成酶受到阻抑作用，次级代谢产物不被合成。主要是一些抗生素合成酶受到抑制或阻遏。,代谢工程专题知识专家讲座,第81页,代谢工程专题知识专家讲座,第82页,用恒化器培养法研究短杆菌肽,S,合成酶合成时发觉，调整短杆菌肽,S,合成酶合成是菌体生长速率。当稀释率高时,(0,.,45,0,.,5,/,h),，合成酶量极少，降低稀释率，酶量就增加。限制不一样营养成份，出现最高酶活稀释率是不一样。限碳源时，酶比活最高。由此提出调整次级代谢产物生物合成因子是菌体比生长速率，而不是某种营养物质，,在青霉素、四环素等发酵生产过程中，控制菌体比生长速率，能提升发酵水平，可能与调整菌体比生长速率相关,。,代谢工程专题知识专家讲座,第83页,次级代谢调整：,1酶合成诱导调整,2反馈调整：,次级代谢产物本身，,分解代谢产物调整,初级代谢产物调整,3磷酸盐调整：,促进初级代谢，抑制次级代谢；,过量抑制次级代谢前体；,阻抑次级代谢磷酸酯酶。,4ATP调整,5产生菌生长速率调整,代谢工程专题知识专家讲座,第84页,第四节 代谢工程,代谢工程系指利用基因工程技术，定向地对细胞代谢路径进行修饰、改造，以改变微生物代谢特征，并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，构建新代谢路径，生产新代谢产物工程技术领域。,在代谢工程设计中，主要有改变代谢流、扩展代谢路径和构建新代谢路径三种.,代谢工程专题知识专家讲座,第85页,一、改变代谢路径,改变代谢路径是指改变分支代谢路径流向，阻断其它代谢产物合成，以到达提升目标产物目标。,改变代谢路径有各种方法，如加速限速反应、改变分支代谢路径流向、构建代谢旁路、改变能量代谢路径等不一样方法,代谢工程专题知识专家讲座,第86页,1,加速限速反应,最成功一个例子是头孢霉素,C,代谢工程菌构建，头孢霉素,C,合成路径。,青霉素,N,是头孢霉素合成中间体。当用顶头孢发酵时，发觉了青霉素,N,积累，这表明下一步酶反应是头孢霉素合成代谢中限速步骤。所以克隆了编码脱乙酰氧基头孢霉素,C,合成酶基因,cefEF,，并导入顶头孢中，所得转化子头孢霉素,C,产量提升了,25,，而青霉素,N,积累量降低至原来,1,/,16,。,代谢工程专题知识专家讲座,第87页,-氨基己二酸,头孢霉素,C,代谢工程菌构建,中间产物,克隆了编码脱乙酰氧基头孢霉素C合成酶基因cefEF,青霉素N,头孢霉素C,限速步骤,所得转化子头孢霉素C产量提升了25，而青霉素N积累量降低至原来1/16。,代谢工程专题知识专家讲座,第88页,2、改变分支代谢路径流向,是指提升代谢分支点某一代谢路径酶系活性，在与另外分支代谢路径竞争中占据优势，亦可提升目标末端代谢产物产量。,代谢工程专题知识专家讲座,第89页,如：赖氨酸合成，选育解除反馈抑制和缺失高丝氨酸脱氢酶突变株，提升了赖氨酸产量。而为了取得苏氨酸高产菌株，以解除了反馈抑制赖氨酸产生菌棒状杆菌为宿主，转入高丝氨酸脱氢酶基因，结果使原来不产生苏氨酸赖氨酸产生菌赖氨酸产量由,65g,/L下降至,4g,/L，而苏氨酸产量增加到,52g/L,，使赖氨酸产生菌转变成苏氨酸产生菌。,代谢工程专题知识专家讲座,第90页,高丝氨酸脱氢酶基因,赖氨酸产生菌棒状杆菌,产生菌赖氨酸产量由65g/L下降至4g/L，,苏氨酸产量增加到52g/L，,赖氨酸产生菌转变成苏氨酸产生菌。,代谢工程专题知识专家讲座,第91页,3、构建旁路代谢,4、改变能量代谢路径,代谢工程专题知识专家讲座,第92页,二、扩展代谢路径,定义：指在引入外援基因后，使原来代谢路径向后延伸，产生新末端产物。或使原来代谢路径向前延伸，能够利用新原料合成代谢产物。,代谢工程专题知识专家讲座,第93页,三、转移或构建新代谢路径,指将催化一系列反应多个酶基因，克隆到不能产生某种新化学结构代谢产物微生物中，使之取得产生新化合物能力；或利用基因工程伎俩，克隆少数基因，使细胞原有没有关两条代谢路径联结起来，形成新路径，产生新代谢产物；或将催化某一代谢路径基因组克隆到另一位生物中，使之发生代谢转移，产生目标产物。,代谢工程专题知识专家讲座,第94页,代谢工程实际上是基于基因工程基础上，当前大多数还处于试验室研究阶段，研究前景十分辽阔，希望这方面研究结果，能为发酵工业带来实际经济效益。,代谢工程专题知识专家讲座,第95页,思索题：,1、概念：,分解代谢、合成代谢、能荷、反馈抑制、反馈阻遏、,协同反馈抑制、累积反馈抑制、增效反馈抑制、次序反馈抑制,2、什么是,初级代谢产物、次级代谢产物？二者异同？,3、微生物自我调整方式有那几个？,4、详细叙述分支路径反馈抑制类型？,5、详述微生物本身调整酶合成调整？,代谢工程专题知识专家讲座,第96页,