有机酸发酵微生物过量合成丙酮酸及代谢网络分析.ppt

博士学位论文,*,微生物过量合成丙酮酸及代谢网络分析,1,研究背景,为什么要研究发酵法生产丙酮酸,?,本研究的立题意义何在,?,关于丙酮酸的生物合成，国外的研究进展如何,?,2,丙酮酸是糖代谢中最重要的中间产物。,它位于合成代谢与分解代谢的转折点，在生物能量代谢中具有十分重要的作用。,在化工、制药和农用化学品等工业及科学研究中有着广泛的用途。,为什么要对发酵法生产丙酮酸进行,研究,?,3,丙酮酸的主要用途,4,丙酮酸的化学法生产工艺,酒石酸脱水脱羧法目前用的主要生产方法：将酒石酸与硫酸氢钾混合物在,220,下蒸馏，馏出物再经真空精馏即可得到丙酮酸。,其主要缺点是,(1),丙酮酸产率较低,(,对酒石酸质量产率为,0.29,0.30 g/g),；,(2),得到,1 g,丙酮酸需要消耗,5 g,硫酸氢钾,以目前酒石酸,(1.5,万元,/t),和硫酸氢钾,(0.6,万元,/t),的市场价格计算，仅原料成本就至少需要,8,万元,/t,导致丙酮酸的价格居高不下。,5,丙酮酸的发酵法生产,发酵法生产丙酮酸在成本上具有明显优势。,问题是丙酮酸高产菌株的选育非常困难。,日本已经实现了发酵法丙酮酸的工业化生产，但在我国，尚未见到任何专利或研究报告。,6,酵母直接发酵法生产丙酮酸,国外,研究水平,细菌或放线菌直接发酵法生产丙酮酸,休止细胞法生产丙酮酸,完整细胞,(,或酶法,),生产丙酮酸,7,酵母直接发酵法生产丙酮酸,丙酮酸脱羧酶,(PDC),转氨酶,(PT),丙酮酸羧化酶,(PC),丙酮酸脱氢酶系,(PDH),烟酸,(NA),维生素,B,1,(B,1,),维生素,B,6,(B,6,),生物素,(Bio),8,酵母直接发酵法生产丙酮酸,(,表,1),9,酵母直接发酵法生产丙酮酸,(,表,2),10,细菌或放线菌直接发酵法生产丙酮酸,11,休止细胞法生产丙酮酸,12,完整细胞或酶法生产丙酮酸,13,以获得丙酮酸高产率、高产量和高生产强度的相对统一为目标。,尽量减少丙酮酸的 降解或转化,。,本研究的学术思想是什么,?,尽量加快由葡萄糖到 丙酮酸的代谢速度,。,14,国外同类研究有哪些问题,?,具有多种遗传标记的,Torulopsis glabrata,在摇瓶培养中丙酮酸产量和产率已分别达到,56.8 g/L,和,0.58 g/g (,日本,),在,3 L,发酵罐流加培养中，丙酮酸产量可达,67.8/L,，其代价是丙酮酸产率,(,Y,p/s,),仅为,0.49 g/g,15,找出对发酵过程最重要的影响因素。,对一种产品，怎样获得高产率、高产量和高生产强度的相对统一,?,提出相应的控制方法或策略。,对这些因素的影响规律进行生理学分析。,16,T.glabrata,生产丙酮酸存在的问题,(1),均以蛋白胨为氮源，产率最高仅为,0.58 g/g,。,(2),所缺陷的维生素在丙酮酸过量合成中的调控作用及影响次序如何,?,(3),发酵过程中，溶氧控制在什么水平好，应当怎样控制,?,(4),怎样全面提高丙酮酸的发酵水平,?,17,本研究目标,学术目标,透彻分析球拟酵母发酵生产丙酮酸的生理学本质，采用一系列控制策略实现丙酮酸的过量合成。,应用目标,确定可放大的发酵工艺，完成,300 L,规模的发酵试验，为实现工业化奠定基础。,18,本课题的主要研究内容,1.,营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响,2.,维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用,3.,丙酮酸分批发酵的供氧控制模式,5.,光滑球拟酵母过量合成丙酮酸的代谢特征,4.,丙酮酸发酵过程的代谢网络分析,19,1.,营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响,(1),维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用,(2),丙酮酸分批发酵的供氧控制模式,(4),光滑球拟酵母过量合成丙酮酸的代谢特征,(3),丙酮酸发酵过程的代谢网络分析,光滑球拟酵母,WSH-IP12,是一株多重维生素营养缺陷型,确定较佳的营养条件是优化发酵过程的基础性工作,研究思路,20,本部分主要研究内容,氮源种类,(,酵母粉、蛋白胨、豆饼水解液、无机氮源,),及其浓度的影响,供氧方式和碳氮比的影响,流加培养中氮有效供给的重要性,21,氮源种类及其浓度的影响,酵母粉添加量的影响,(g/L):,zero,；,1,；,3,；,5,；,8,；,10,22,蛋白胨添加量的影响,丙酮酸；乙醇；细胞干重；葡萄糖,23,豆饼水解液添加量的影响,丙酮酸；细胞干重,24,无机氮源的影响,25,氮源种类及其浓度的影响小结,1),酵母粉质量浓度大于,1 g/L,将导致丙酮酸产量大幅度减少。,2),虽然该菌株能够利用豆饼水解液和无 机氮源，但结果不如蛋白胨理想。,26,供氧方式的影响,and 0-39h,700 rpm,；,and 0-6h,，,400 rpm;6-14h,500 rpm;14-37h,600 rpm,供氧方式和碳氮比的影响,27,不同供氧方式控制的发酵过程参数比较,28,培养基碳氮比的影响,glucose 92 g/L,peptone 15 g/L,glucose 127 g/L,peptone 20 g/L,glucose 201 g/L,peptone 20 g/L,29,培养基中初始葡萄糖浓度和,/,或碳氮比的影响,30,供氧方式及碳氮比的影响小结,1),较高的溶氧水平下，细胞生长和葡萄糖消耗速度相对较慢，但丙酮酸产量,(39.0 g/L),和产率,(0.47 g/g),较高。,2)C/N,太高,(,如,42:1),，细胞消耗葡萄糖的能力被削弱，且丙酮酸产率下降。在,C/N,适宜的条件下,(25:1),，丙酮酸发酵能正常进行。,31,在摇瓶发酵中补加葡萄糖的影响,补加葡萄糖；,不补加葡萄糖,流加培养中氮有效供给的重要性,32,典型的流加培养过程曲线,丙酮酸；葡萄糖；细胞干重；乙醇,33,丙酮酸；葡萄糖；细胞干重；乙醇,以氨水代替,KOH,控制,pH,的流加培养过程曲线,34,营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响,维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用,丙酮酸分批发酵的供氧控制模式,光滑球拟酵母过量合成丙酮酸的代谢特征,丙酮酸发酵过程的代谢网络分析,本课题的主要研究内容,35,已有的研究没有阐明光滑球拟酵母的维生素营养缺陷型对维生素的确切需求,其原因可能是培养基成分较为复杂,开发简单的培养基，是研究维生素在丙酮酸过量合成中作用的基础性工作,WSH-IP12,菌株对无机氮源的同化能力不强，需要改进,研究思路,本部分主要研究内容,突变株,WSH-IP303,的获得及其对无机氮源的同化能力,维生素在突变株,WSH-IP303,过量合成丙酮酸中的重要作用,36,突变株,WSH-IP303,的获得方法,EMS,处理后的细胞涂布,CM,平板，挑取,CM,平板上透明圈大的菌落，对应点种,CM,和,MM,。,挑取,CM,平板上生长良好而,MM,平板上不生长或生长很弱的菌落，进行初筛。,复筛前，先确认突变株的维生素营养缺陷型遗传标记。,根据丙酮酸产量高低和产酸稳定性，确定研究用菌株。,37,初筛得到的,54,株菌合成丙酮酸能力,38,8,株较优突变株的传代稳定性,39,突变株,WSH-IP303,利用不同氮源生产丙酮酸的能力,peptone,；,(NH,4,),2,SO,4,；,(NH,4,),2,HPO,4,；,Urea,；,NH,4,Cl,40,突变株,WSH-IP303,的获得及其,对氮源的同化能力小结,1)EMS,诱变后有,8,株菌，丙酮酸产量提高,30%,以上。,WSH-IP303,生产丙酮酸的能力强且稳定，其丙酮酸产量,(35.1 g/L),比出发菌株提高了,64%,。,2)WSH-IP303,菌株以,NH,4,Cl,或尿素为唯一氮源时的丙酮酸产量高于蛋白胨。,3),成本降低；可以透彻分析维生素的影响。,41,本部分主要研究内容,突变株,WSH-IP303,的获得及其对无机氮源的同化能力,维生素在突变株,WSH-IP303,过量合成丙酮酸中的重要作用,42,维生素对突变株,WSH-IP303,生产丙酮酸的单因素影响,43,正交试验维生素水平表,44,正交试验设计及具体实验结果,45,正交试验直观分析,pyruvate;growth;Glucose consumption;Yield,46,由正交试验得到的维生素浓度优化组合,1,Combination for getting high yield of pyruvate to glucose.,2,Combination for getting high concentration of pyruvate.,47,维生素浓度优化组合的实验验证,48,烟酸和硫胺素较优浓度的确定,得到了维生素浓度优化组合,NA 8 mg/L,，,B,1,0.015 mg/L,，,B,6,0.4 mg/L,，,Bio 0.04 mg/L,，,B,2,0.1 mg/L,。,49,采用实验得到的维生素浓度优化组合在,5 L,罐上进行分批发酵试验,Glucose Pyruvate,NH,4,Cl DCW,1,DOT 2,ethanol,Yp/s;Yx/s.,50,丙酮酸脱羧酶,转氨酶,丙酮酸羧化酶,丙酮酸脱氢酶系,维生素浓度的优化是提高丙酮酸发酵水平的先决条件,51,维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用小结,1),B,1,是影响丙酮酸生产最重要的因素。,2),增大,NA,质量浓度可促进葡萄糖消耗。,3),得到了,维生素浓度优化组合,NA 8 mg/L,，,B,1,0.015 mg/L,，,B,6,0.4 mg/L,，,Bio 0.04 mg/L,，,B,2,0.1 mg/L,，为进一步研究奠定了基础。,52,营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响,维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用,丙酮酸分批发酵的供氧控制模式,光滑球拟酵母过量合成丙酮酸的代谢特征,丙酮酸发酵过程的代谢网络分析,本课题的主要研究内容,53,较高的溶氧有利于丙酮酸的积累,溶氧高到什么程度好,?,在发酵过程中怎样对溶氧实施控制,?,维生素限量供给后溶氧的影响会不会出现特殊性,?,研究思路,本部分主要研究内容,分析不同,k,L,a,下突变株,WSH-IP303,分批发酵的动力学特征,根据主要动力学参数的变化特性，提出了分阶段供氧控制模式,54,不同,k,L,a,下发酵过程中溶氧的变化,k,L,a,(h,-1,):1450;2300;3200,55,不同,k,L,a,下发酵过程动力学曲线,k,L,a,(h,-1,):,and 1 450,and 2 300,and 3 200,56,不同,k,L,a,下丙酮酸产率和细胞产率的变化,k,L,a,(h,-1,):1450;2300;3200,57,不同供氧控制模式下发酵过程参数比较,58,高,k,L,a,(450 h,-1,),下，丙酮酸产率较高,(0.724 g/g),，但葡萄糖消耗速度较慢,(1.14 g/(L,h),。,低,k,L,a,(200 h,-1,),下，细胞消耗葡萄糖的速度加快,(1.97 g/(L,h),，然而丙酮酸产率,(0.483 g/g),却明显下降。,不同,k,L,a,下突变株,WSH-IP303,分批发酵的动力学特征小结,59,本章主要研究内容,分析不同,k,L,a,下突变株,WSH-IP303,分批发酵的动力学特征,根据主要动力学参数的变化特性，提出了分阶段供氧控制模式,60,不同,k,L,a,下发酵过程动力学曲线,k,L,a,(h,-1,):,and 1 450,and 2 300,and 3 200,61,恒定,k,L,a,发酵过程中不同阶段的碳平衡,分阶段供氧控制模式发酵,0-16 h,控制,k,L,a,为,450 h,-1,，,16 h,后将,k,L,a,降低至200 h,-1,。,62,分阶段供氧控制模式下的发酵过程曲线,Glucose,Pyruvate,Biomass,1 DOT,2 Ethanol,63,分阶段供氧控制模式下的碳平衡,恒定,k,L,a,发酵过程中不同阶段的碳平衡,64,分阶段供氧控制模式，实现了高产量,(69.4 g/L),、高产率,(0.636 g/g),和高葡萄糖消耗速度,(1.95 g/(L,h),的相对统一。,分阶段供氧控制模式小结,生产强度,(1.24 g/(L,h),比,k,L,a,恒定为,450,、,300,和,200 h,-1,的分批发酵过程分别提高了,36%,、,23%,和,31%,。,意义,可以用于指导放大过程。,65,66,供氧良好状态下,(DOT50%),，细胞产丙酮酸性能出现的差异，可能是由于,:,培养基中维生素浓度处于亚适量水平时，酵解途径产生的,NADH,去路不同，导致细胞处于不同的能量水平而引起的。,67,营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响,维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用,丙酮酸分批发酵的供氧控制模式,光滑球拟酵母过量合成丙酮酸的代谢特征,丙酮酸发酵过程的代谢网络分析,本课题的主要研究内容,68,维生素和溶氧对丙酮酸发酵的影响非常大,如何解释维生素限量的情况下，不同,DOT(50%),下丙酮酸合成性能的差异,?,代谢通量分析方法,(MFA),提供了一个很好的手段,利用代谢网络分析可以揭示丙酮酸发酵过程的本质,为什么要进行代谢网络分析,?,69,本部分主要研究内容,代谢网络的构建,不同维生素和溶氧水平对,WSH-IP303,发酵生产丙酮酸的影响,基于代谢通量分析，探讨不同营养条件下丙酮酸发酵的生理学本质,70,71,本部分主要研究内容,代谢网络的构建,不同维生素和溶氧水平对,WSH-IP303,发酵生产丙酮酸的影响,基于代谢通量分析，探讨不同营养条件下丙酮酸发酵的生理学本质,为什么要把维生素和溶氧结合起来研究,?,在维生素限量供给、供氧充分,(DOT 50%),的条件下，细胞生产丙酮酸的性能对溶氧的变化非常敏感。,这种敏感是菌株自身特性引起的,?,还是由于维生素限量供给引起的,?,因此，要研究维生素限量或不限量情况下，溶氧对丙酮酸发酵的影响。,72,A:B,1,=0.03 mg/L,B:B,1,=0.015 mg/L,glucose,pyruvate,biomass,ethanol,glycerol,73,不同维生素和溶氧水平下发酵过程碳平衡,74,本部分主要研究内容,代谢网络的构建,不同维生素和溶氧水平对,WSH-IP303,发酵生产丙酮酸的影响,基于代谢通量分析，探讨不同营养条件下丙酮酸发酵的生理学本质,75,不同维生素和溶氧水平下胞内代谢通量分配,76,不同培养条件下,NADPH,的产生与消耗,细胞能够自动调节,NADPH,产生途径的比例，以满足生物合成对,NADPH,的需求,77,不同培养条件下,NADH,的产生与消耗,78,硫胺素为,0.03 mg/L,时，随着溶氧的下降，NADH通过呼吸链氧化的比例降低，多余部分NADH通过形成乙醇得以氧化。,NADH,的去路影响丙酮酸的产率,硫胺素为,0.015 mg/L,时，随着溶氧的下降，由于乙醇脱氢酶活性受限，细胞启动甘油途径完成NADH的再生。,高溶氧下能够获得相对较高的丙酮酸产率，因为大部分NADH通过呼吸链氧化。,溶氧水平越高越好,?,对于丙酮酸发酵而言,由于,NADH,的氧化方式与,ATP,的获得直接相关，因此，还必须对,ATP,的影响进行深入分析。,79,不同培养条件下,ATP,的产生与消耗,80,硫胺素为,0.015 mg/L,时，随着溶氧的下降，由于甘油途径启动，细胞表观能量水平下降，葡萄糖消耗速度随之加快。,细胞表观能量水平及,ATP,周转速度影响葡萄糖的消耗速度,硫胺素为,0.03 mg/L,时，不同溶氧下(50%)细胞的表观能量水平很高，但由于胞内ATP周转速度较快，因此，葡萄糖消耗速度也较高。,降低细胞的表观能量水平,。,如何加快葡萄糖的消耗速度,?,加快胞内,ATP,的周转速度。,81,细胞量多，胞内,ATP,的周转速度快，葡萄糖消耗速度快，但丙酮酸产率必然下降；,实际研究中的矛盾,细胞量少，胞内,ATP,的周转速度慢，丙酮酸产率虽然很高，但葡萄糖消耗速度下降。,如何获得高产率、高产量和高生产强度,(,葡萄糖消耗速度,),的统一,?,82,维生素,(,特别是硫胺素,),的浓度控制在亚适量水平；,对应策略,使细胞先在高溶氧水平下生长，这样胞内,ATP,通量可达到较高的水平；,然后，适度降低溶氧水平，其目的是,(1),启动甘油生成途径，降低能量水平；,(2),适度增大,TCA,循环通量，使细胞通量增加，加速胞内,ATP,周转速度,达到高产率、高产量和高生产强度的相对统一。,策略,0-16 h,控制溶氧为,85%,，,16 h,后将溶氧降至60%,实际应用,培养基中硫胺素浓度为,0.015 mg/L,83,不同维生素和溶氧水平下胞内代谢通量分配,84,代谢通量分析揭示了不同培养条件下微生物过量合成丙酮酸过程中的代谢途径变化。,根据代谢通量分析实施的分阶段溶氧控制模式，能够取得高产率,(0.65 C-mol,丙酮酸,/C-mol,葡萄糖,),和高葡萄糖消耗速度,(1.80 g/(L,h),的相对统一。,本章小结,85,营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响,维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用,丙酮酸分批发酵的供氧控制模式,光滑球拟酵母过量合成丙酮酸的代谢特征,丙酮酸发酵过程的代谢网络分析,本课题,的主要研究内容,86,光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸中的问题,为什么摇瓶培养中葡萄糖消耗速度更快，但丙酮酸产量和产率却不及发酵罐培养,?,是否存在措施，在保证高产率的前提下，通过降低细胞的能量水平来提高丙酮酸的生产强度,?,无机磷在丙酮酸发酵过程中的作用,?,流加培养是否一定能提高丙酮酸发酵水平,?,87,本部分研究的主要目的,基于代谢网络分析，对丙酮酸发酵过程出现的一些特有,的重要代谢特征进行初步解释。,基于代谢网络分析，探讨进一步提高丙酮酸发酵水平的可能性。,基于实验室研究结果，将丙酮酸发酵逐级放大至,300 L,规模。,88,本部分章主要内容,丙酮酸发酵过程中,-,酮戊二酸的代谢特征,解偶联剂对丙酮酸过量合成的影响,无机磷对丙酮酸过量合成的影响,葡萄糖对丙酮酸发酵的影响,300 L,罐发酵试验,89,B,1,=0.03 mg/L,Bio=0.04 mg/L;B,1,=0.02 mg/L,Bio=0.04 mg/L,B,1,=0.01 mg/L,Bio=0.04 mg/L;B,1,=0.01 mg/L,Bio=0.02 mg/L,不同维生素水平下摇瓶装液量对丙酮酸发酵的影响,90,从图可以看出三点,(1),(B,1,)=0.01 mg/L,时，随着装液量的增加，葡萄糖消耗加速，甘油（,GOH,）浓度迅速增加。相对而言，细胞生长和乙醇积累受到的影响较小；而当,(B,1,)0.01 mg/L,时，随着装液量的增加，细胞干重不断下降，乙醇质量浓度显著提高，葡萄糖消耗几乎不受影响；,(2),不同维生素水平下，丙酮酸产量在装液量为,30,50 mL,时达到最高；,(3),-KG,质量浓度随着装液量的增加及,B,1,和,Bio,质量浓度的下降而不断下降；装液量,50 mL,后，不同维生素水平下,-KG,质量浓度没有显著差别。,91,本部分章主要内容,丙酮酸发酵过程中,-,酮戊二酸的代谢特征,解偶联剂对丙酮酸过量合成的影响,无机磷对丙酮酸过量合成的影响,葡萄糖对丙酮酸发酵的影响,300 L,罐发酵试验,92,发酵罐和摇瓶培养中与酮戊二酸相关的代谢通量,在摇瓶培养条件下，通过,r,6,和,r,7,的通量均有所增加。在装液量较低的情况下,(20,50 mL),，,r,7,流量增加得尤为显著。由此可以认为在摇瓶培养中，由丙酮酸羧化酶,(PC),控制的丙酮酸羧化反应较为活跃，可能是造成培养体系中,-KG,质量浓度升高的主要原因,93,不同装液量下碳酸钙加量对丙酮酸发酵的影响,如果不加碳酸钙，由于,pH,很低，细胞生长微弱，几乎不消耗葡萄糖也不积累代谢产物。在碳酸钙质量浓度由,20 g/L,增加到,40 g/L,的过程中，丙酮酸质量浓度仅略有提高，甚至减少,(,装液量为,20 mL,时,),；此时，细胞所消耗的葡萄糖更多地用于积累,-KG,。也就是说，在维生素质量浓度并未改变且供氧较为充分的前提下，增加培养基中的碳酸钙质量浓度，其结果是将细胞积累丙酮酸转向形成,-KG,。,94,本部分主要研究内容,丙酮酸发酵过程中,-,酮戊二酸的代谢特征,解偶联剂对丙酮酸过量合成的影响,无机磷对丙酮酸过量合成的影响,葡萄糖对丙酮酸发酵的影响,300 L,罐发酵试验,研究思路,降低能量水平可加速葡萄糖代谢速度,解偶联剂可将电子传递与磷酸化解偶联，这样,ATP,产生减少，但电子传递正常进行。,95,2,4-,二硝基苯酚（,2,4-DNP,）对丙酮酸发酵的影响,DNP,是氧化磷酸化的解偶联剂，可抑制,ATP,的形成，使能量以热的形式释放，对降低细胞的能量水平应当很有效。然而，在发酵过程中直接添加,2,4-DNP,的实验数据却表明,(,见表,),，所期望的添加,DNP,加速丙酮酸积累的目标并没有实现。相反，在培养的不同时刻添加不同浓度的,DNP,还对丙酮酸发酵产生了不同程度的抑制作用。,96,本章主要内容,丙酮酸发酵过程中,-,酮戊二酸的代谢特征,解偶联剂对丙酮酸过量合成的影响,无机磷对丙酮酸过量合成的影响,葡萄糖对丙酮酸发酵的影响,300 L,罐发酵试验,97,在发酵培养基中初始,KH,2,PO,4,浓度,(,(IP),为,0,时，细胞的代谢活动非常微弱，发酵,48 h,细胞干重、丙酮酸产量和,-KG,质量浓度仅为,5 g/L,左右；,(IP),达到,0.3 g/L,后，细胞量开始大幅度增加；,(IP),增大到,1 g/L,后，细胞生长基本恒定,(,图,C),。在,(IP),由,0,增大至,5 g/L,的过程中，丙酮酸产量表现出先升高再降低的正常趋势,(,图,E),；而,-KG,质量浓度却表现出先升高、后降低、再升高的趋势,(,图,D),，令人费解。深入分析图,B,E,可以发现，在,(IP),变化的过程中，若丙酮酸质量浓度高，,-KG,质量浓度就低，细胞量少，葡萄糖消耗速度较慢；而若,-KG,质量浓度高，丙酮酸质量浓度就低，细胞量多，葡萄糖消耗速度也快,不同,B,1,浓度下无机磷浓度的影响,B,1,=0.02 mg/L B,1,=0.01 mg/L,98,不同发酵时间无机磷浓度的影响,24-h 48-h,在,(B,1,)=0.02 mg/L,的条件下，发酵,24 h,和,48 h,时细胞生长、产物形成和底物消耗的特性基本相同,(,如图,B,E,所示,),。其中，最值得关注的代谢特征，仍然是细胞在低磷条件下合成更多的,-KG(,图,D),。此外，由图,A,可以判定，细胞对外界过量无机磷的摄取主要发生在,24 h,48 h,之间，这一现象与图,D,所示的,-KG,代谢特征可能存在某种联系,99,无机磷对丙酮酸发酵的影响,在无机磷限制的条件下，细胞以最节省无机磷的方式进行代谢。,在不同硫胺素水平下，无机磷受限时，细胞优先合成,-,酮戊二酸以降低对磷的需求。,100,本章主要内容,丙酮酸发酵过程中,-,酮戊二酸的代谢特征,解偶联剂对丙酮酸过量合成的影响,无机磷对丙酮酸过量合成的影响,葡萄糖对丙酮酸发酵的影响,300 L,罐发酵试验,101,116.4 g/L 85.3 g/L 53.4 g/L,30L,罐中不同初始葡萄糖浓度的影响,102,30L,罐中不同初始葡萄糖浓度下发酵过程比较,103,30L,罐中不同培养方式的影响,由于,WSH-IP303,能耐受相对较高浓度的葡萄糖，因此，简单的补料培养不能有效地提高丙酮酸生产水平。,104,不同初始丙酮酸浓度对丙酮酸生产的影响,高浓度丙酮酸对细胞活性的抑制，是制约丙酮酸水平进一步提高的重要原因。,105,本部分主要内容,丙酮酸发酵过程中,-,酮戊二酸的代谢特征,解偶联剂对丙酮酸过量合成的影响,无机磷对丙酮酸过量合成的影响,葡萄糖对丙酮酸发酵的影响,300 L,罐发酵试验,300 L,规模丙酮酸发酵试验结果,106,光滑球拟酵母过量合成丙酮酸的代谢特征,300 L,规模丙酮酸发酵过程曲线,丙酮酸；,葡萄糖；,细胞量,107,主要结论,(1),研究了营养条件,(,氮源、碳氮比,),对光滑球拟酵母,WSH-IP12,发酵生产丙酮酸的影响。发现氮的有效供给对丙酮酸发酵是很重要的。,(2),选育得到一株能以,NH,4,Cl,唯一氮源大量产酸的突变株,WSH-IP303,，在此基础上，透彻研究了该菌株所缺陷的维生素在丙酮酸过量合成过程中的重要作用及次序，并优化了其浓度。,108,(3),在维生素限量供给的条件下，采用两阶段供氧控制模式，可获得丙酮酸高产量、高产率和高生产强度的相对统一。,(4),根据文献数据和实际情况，构建了,WSH-IP303,的代谢网络，计算得到了不同培养条件下的代谢通量分配。,109,(5),在丙酮酸过量合成的过程中，,NADH,的去路关系到丙酮酸的产率；,ATP,的产生与消耗则与葡萄糖消耗速度密切相关。,(6),前期高溶氧、后期适当降低溶氧的两阶段溶氧控制模式之所以有效，其实质是由于胞内,ATP,周转速度加快，解除高能荷的抑制作用。,110,结 论,(7),摇瓶中产生大量酮戊二酸的原因主要是在摇瓶培养条件下，丙酮酸羧化反应较为活跃。,(8),在无机磷限制的情况下，细胞总是选择省磷的方式进行代谢。,111,结 论,(9)WSH-IP303,菌株耐高浓度葡萄糖的能力较强，但耐高浓度丙酮酸的能力较弱。这是制约丙酮酸产量进一步提高的重要原因。,(10),在,300 L,罐发酵试验中，丙酮酸产量和产率分别达到,55.8 g/L,和,0.553 g/g,，为实现工业化奠定了坚实的基础。,112,