复合磁性纳米粒子用于食源性致病菌特异性检测及灭活.pdf

食品研究与开发圆园23 年 11 月第 44 卷第 21 期DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2023.21.017基金项目：天津中医药大学中西医结合学院 2022 年度教师科研启动基金（ZXYQDLX202202）作者简介：郭寒琼（1998），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品安全。*通信作者：方远（1989），男（汉），讲师，博士，研究方向：食品安全；王晓敏（1988），女（汉），助理研究员，博士，研究方向：生物材料。复合磁性纳米粒子用于食源性致病菌特异性检测及灭活郭寒琼1，吴浩天1，齐畅1，方远1*，王晓敏2*（1.天津科技大学 食品科学与工程学院 食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457；2.天津中医药大学 中西医结合学院，天津 301617）摘要：该实验合成具有光热转换性能的万古霉素修饰的磁性氧化铁纳米粒子（Fe3O4Van），建立一种基于化学发光的革兰氏阳性菌快速检测与光热灭活一体化平台。万古霉素的羰基和氨基可以与革兰氏阳性菌细胞壁的肽聚糖形成氢键，使 Fe3O4Van 与细菌发生特异性结合生成复合物，通过磁分离从复杂基质中捕获和提取细菌。细菌分泌的过氧化氢酶对鲁米诺-过氧化氢化学发光体系具有抑制作用，随着溶液中细菌数量的增加，化学发光强度逐渐降低，该方法对金黄色葡萄球菌（S.aureus）的检测范围为 10105CFU/mL。同时，因 Fe3O4Van 具有出色的光热转换能力，用 808 nm 激光照射检测后的 Fe3O4Van 与细菌复合物可实现细菌的高温灭活，对 S.aureus 的抗菌效率高达98.6%。该文基于 Fe3O4Van 构建的新平台为准确、高效地检测和灭活致病菌提供新的思路。关键词：食源性致病菌；光热杀菌；高效抗菌；检测；生物传感器Composite Magnetic Nanoparticles for the Specific Detection and Inactivation ofFoodborne Pathogenic BacteriaGUO Hanqiong1，WU Haotian1，QI Chang1，FANG Yuan1*，WANG Xiaomin2*（1.State Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，College of Food Science and Engineering，TianjinUniversity of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.School of Integrative Medicine，TianjinUniversity of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301617，China）粤遭泽贼则葬糟贼：Vancomycin-modified magnetic iron oxide nanoparticles（Fe3O4Van）with photothermal conversionproperties were synthesized to establish an integrated platform for rapid detection and photothermal inactivation ofGram-positive bacteria based on chemiluminescence.The carbonyl and amino groups of vancomycin can formhydrogenbondswithpeptidoglycaninthecellwallofGram-positivebacteria，making Fe3O4Vanform complexeswithbacteria，which can be captured and extracted from the complexes through magnetic separation.The catalasesecreted by bacteria inhibited the luminol-hydrogen peroxide chemiluminescence system.As the number ofbacteria in the system increased，the chemiluminescence intensity gradually decreased.This method showed thedetection range of 10-105CFU/mL for Staphylococcus aureus.Meanwhile，due to the excellent photothermalconversion ability of Fe3O4Van，the laser irradiation at 808 nm can achieve high-temperature inactivation ofbacteria in the Fe3O4Van-bacteria complexes，with the inhibition rate of 98.6%against S.aureus.The novelFe3O4Van-based platform provided a new idea for the accurate and efficient detection and inactivation ofpathogenic bacteria.运藻赠 憎燥则凿泽：foodborne pathogenic bacteria；photothermal sterilization；efficient inhibition of bacteria；detec原tion；biosensor引文格式：郭寒琼，吴浩天，齐畅，等.复合磁性纳米粒子用于食源性致病菌特异性检测及灭活J.食品研究与开发，2023，44（21）：123-130.GUO Hanqiong，WU Haotian，QI Chang，et al.Composite Magnetic Nanoparticles for the Specific Detection and Inactivation ofFoodbornePathogenicBacteriaJ.Food Research and Development，2023，44（21）：123-130.检测分析123食品研究与开发圆园23 年 11 月第 44 卷第 21 期糖之间形成氢键，形成 Fe3O4Van-S.aureus 复合物，S.aureus 所分泌的过氧化氢酶可有效降低溶液体系中的化学发光强度，以化学发光强度作为输出信号实现对致病菌的灵敏检测。同时，因 Fe3O4Van 在近红外区域具有宽广的吸收，用 808 nm 激光照射磁分离后的Fe3O4Van 与细菌复合物产生大量热能，从而实现对致病菌的杀死，可有效防止检测完成后的二次污染。1材料与方法1.1材料与试剂牛奶、矿泉水：市售。FeCl3 6H2O、H2O2、聚乙二醇、醋酸钠、N-（3-二甲基氨基丙基）-N-乙基碳二亚胺盐酸盐N-（3-dimethylaminopropyl）-N-ethylcarbodiimidehydrochloride，EDC、N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxy原succinimide，NHS）、吗啉乙磺酸（2-morpholinoethane原sulphonic acid，MES）：国药集团化学试剂有限公司；乙二醇：天津江天化工技术股份有限公司；牛血清蛋白、鲁米诺、万古霉素：上海阿拉丁试剂有限公司；金黄色葡萄球菌及其他种类的对照细菌：广东省微生物菌种保藏中心；胰蛋白胨、琼脂、酵母提取液：北京索莱宝科技有限公司；牛肉膏：赛默飞世尔科技（中国）有限公司。所用试剂均为分析纯。1.2仪器与设备电子分析天平（BT25S）：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；离心机（H1650-W）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；808 nm 激光器（220VAC）：海特光电有限责任公司；恒温培养箱（DHP-2042 BS）：美国Thermo 有限公司；紫外可见分光光度计（UV-2600）：日本 SHIMADZU 公司；超微弱化学发光检测仪（RFL-1）：西安瑞迈分析仪器有限公司；红外热成像仪（Fotric食源性致病菌可以通过污染空气、水和食物等方式与人类接触，由其导致的感染会引起各种疾病，如恶心、呕吐、腹痛和腹泻等急性胃肠炎症，重者可出现呼吸、循环、神经等系统并发症1。因此，构建一个简单有效的细菌即时检测（point-of-care testing，POCT）和消除平台具有重要意义。目前，大多数已开发的策略仅专注于对食源性致病菌的灵敏检测而没有后续的细菌灭活功能，或者仅专注于对病原菌的高效灭活而没有早期预警功能，这些独立的检测和灭菌方法可能会造成细菌的二次传播2-5。抗生素作为治疗细菌感染的传统药物在保护人类健康方面发挥着重要的作用6-8。然而，抗生素的过量和超范围使用往往会导致耐药细菌菌株的出现，给人类健康带来了极大的风险9-10。近年来，基于高温的光热疗法（photothermal therapy，PTT）因其系统毒性低、产生耐药性的可能性较小而被认为是一种有前途的灭活细菌的新方法11-13。另一方面，基于比色法14、荧光15和电化学发光16的各种生物传感器已经被构建用于细菌检测。然而，比色法和荧光法通常需要外部光源或电源，不利于现场的快速检测。相比之下，依赖于化学反应的化学发光（chemiluminescence，CL）可以不受激发光源的影响，能够显著提高信噪比，从而提高了检测灵敏度17-19。因此，本研究开发一种集化学发光检测和光热灭活于一体的食源性致病菌检测及灭活平台。以革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为研究对象，对实验过程中 H2O2浓度、实验温度以及孵育时间进行优化，从而获得反应的最佳条件。在此条件下，基于 Fe3O4Van-S.aureus 复合物对鲁米诺-过氧化氢（luminol-H2O2）化学发光体系的抑制作用对 S.aureus 进行检测。原理如图 1 所示。如图 1 所示，Fe3O4Van 与 S.aureus 细胞壁肽聚Fe3O4VanFe3O4NPsVan死细菌活细菌温度升高ii）基于光热疗法的食源性致病菌灭活i）基于化学发光的食源性致病菌检测盂手机传感器于暗室淤样品放置台图 1Fe3O4Van 检测及杀菌原理示意图Fig.1Schematic diagram of detection and sterilization of Fe3O4Van检测分析124食品研究与开发圆园23 年 11 月第 44 卷第 21 期225S）：美国 FOTRIC 公司。1.3方法1.3.1Fe3O4NPs 和 Fe3O4Van 的制备Fe3O4NPs 的制备参考文献20的方法，稍作修改。将 FeCl3 6H2O（1.35 g）溶解于含有乙二醇溶液（40 mL）的烧杯中，搅拌 5 min。随后将醋酸钠（1.8 g）和聚乙二醇（0.5 g）加入烧杯中并在室温下搅拌 30 min。随后将烧杯中的液体转移到反应釜中，置于 200 益的烘箱中加热 6 h。待液体冷却后，使用超纯水和乙醇分别洗涤3 次，获得 Fe3O4NPs。将 1 mL 的 Fe3O4NPs（2 mg/mL）溶液用 MES 缓冲液（pH5.5）洗涤 3 次，加入 EDC（4 mg）和 NHS（4 mg）后于室温下振荡 30 min，然后加入万古霉素（1 mg）振荡孵育 12 h，最后通过 MES 缓冲液（pH7.4）洗涤 3 次，置于 4 益冰箱备用。1.3.2Fe3O4NPs 和 Fe3O4Van 的表征将 Fe3O4Van 滴到硅片上，在室温下进行干燥。将干燥后的硅片转移至粘有导电胶的载物台上，溅射镀金，使用扫描电子显微镜观察 Fe3O4Van 形貌。将 Fe3O4NPs 和 Fe3O4Van 溶液（350 滋L）分别置于紫外分光光度计中，记录其在 200900 nm 的吸收光谱。利用 Zeta 电位纳米粒度分析仪记录 Fe3O4NPs、Fe3O4Van 和万古霉素的电位分布状况。1.3.3Fe3O4Van 的光热性能分析将 Fe3O4Van 置于 48 孔板中，在距离孔板 1 cm的位置利用 808 nm 激发器添加一束功率密度为 1 W/cm2的激光。利用红外热成像仪实时监测溶液温度的变化，随激光辐照时间延长，溶液温度不断上升并逐渐到达峰值。然后关闭激发器，记录溶液的降温数据。将Fe3O4Van 溶液在 808 nm 激光辐照/关闭各 5 min，循环 5 次，通过热学成像仪每隔 30 s 记录温度数据并绘制温度循环曲线图。1.3.4致病菌检测原理验证将稀释至不同浓度的 S.aureus 菌液（1 mL）与Fe3O4Van 孵育 3 min，待细菌与 Fe3O4Van 充分结合后加入 H2O2继续孵育 10 min。随后吸取 0.5 mL 上述混合溶液添加至含有鲁米诺的化学发光体系中，利用超微弱化学发光检测仪记录对应化学发光强度。1.3.5条件优化1.3.5.1H2O2浓度优化选取 H2O2浓度为 0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 mmol/L，固定孵育时间为 10 min、实验温度为 25 益进行实验。使用超微弱化学发光检测仪记录每组化学发光强度，以化学发光强度的比值为评价标准确定 H2O2的最佳使用量，每组实验重复 3 次。1.3.5.2实验温度优化在 Fe3O4Van-S.aureus 复合物中添加 H2O2后，将上述混合溶液分别置于 4、25、37、45、50 益下固定孵育时间为 10 min。随后使用超微弱化学发光检测仪记录每组化学发光强度，以化学发光强度的比值为评价标准确定最适宜的实验温度，每组实验重复 3 次。1.3.5.3孵育时间优化将 Fe3O4Van 与 S.aureus 振荡孵育后，将上述Fe3O4Van-S.aureus 复合物与 H2O2分别孵育 1、2、5、10、15 min。随后使用超微弱化学发光检测仪记录每组化学发光强度，以化学发光强度的比值为评价标准确定最佳孵育时间，每组实验重复 3 次。1.3.6细菌的检测通过对实验体系中 H2O2浓度、实验温度以及孵育时间进行优化，确立反应的最优条件。固定 H2O2浓度为 0.8 mmol/L，实验温度为 25 益，孵育时间为 10 min。在该反应条件下，Fe3O4Van 分别与不同浓度（10、50、102、5伊102、103、5伊103、104、5伊104、105CFU/mL）的S.aureus 孵育。将 Fe3O4Van-S.aureus 复合物与 H2O2在室温下孵育 10 min 后，吸取上述混合溶液添加至化学发光体系中，利用超微弱化学发光检测仪记录对应化学发光强度。重复上述操作 3 次，确定化学发光强度与细菌浓度的关系，实现对 S.aureus 的定量检测。1.3.7实际样品的加标回收实验取 5 mL 无菌牛奶于离心管中，离心 10 min（8 000 r/min），离心后弃去上层的乳脂肪泡沫，此过程重复 3 次。随后将离心管中剩余液体混合均匀进行稀释处理；矿泉水样品预处理：取 1 mL 市售矿泉水过膜，然后用超纯水稀释 100 倍待使用。所有样品均预先经高压灭菌（121 益，20 min），再进行样品加标实验。通过测量菌悬液在 600 nm 处的吸光度确定菌液浓度。对培养至对数期的菌悬液进行梯度稀释，使得待测样液中所含细菌数量分别为 1伊103、1伊104、1伊105CFU/mL。随后使用超微弱化学发光检测仪记录混合溶液的化学发光强度，将实际样品中加标回收的检测值与线性范围内 S.aureus 的理论值进行数据分析，最后根据公式计算样品加标回收率，重复上述操作 3 次。1.3.8光热抗菌利用涂布平板法来探究 Fe3O4Van 在 808 nm 激光照射下的光热抗菌能力，通过计算细菌菌落存活数量来评估 Fe3O4Van 对 S.aureus 的破坏效果。实验过程按以下 4 组方式进行处理：1）超纯水处理的菌体不加激光照射；2）超纯水处理的菌体加激光照射（808nm，1.0 W/cm2）；3）经磁分离后 Fe3O4Van 偶联的菌体加激光照射（808 nm，1.0 W/cm2）；4）经磁分离后 Fe3O4Van偶联的菌体不加激光照射。以上 4 组经过不同处理检测分析125食品研究与开发圆园23 年 11 月第 44 卷第 21 期后，取适量菌悬液于固体营养琼脂培养基上，用灭菌涂布棒进行涂布，随后置于 37 益恒温恒湿培养箱中培养 12 h，通过平板菌落计数法计算 4 种处理方式中Fe3O4Van 的抗菌效率。1.4数据处理定量数据以平均数依标准差表示，每组样本不低于 3 个。统计学比较采用方差分析和独立样本 t 检验。P0.05 表示统计学上差异显著。2结果与分析2.1材料表征实验材料合成后，使用扫描电子显微镜以及 Zeta电位纳米粒度分析仪来验证 Fe3O4Van 的成功制备，结果见图 2。由图 2A 可知，Fe3O4Van 在扫描电子显微镜图像中显示出了饱满的球状形态，经统计平均粒径为499.8nm。由图 2B 可知，Fe3O4NPs 和万古霉素的表面分别携带负电和正电，由于 Fe3O4NPs 与万古霉素发生电位中和反应，Fe3O4Van 表面的负电荷低于 Fe3O4NPs。以上数据证实了 Fe3O4Van 的成功制备。随后使用紫外可见分光光度计分别对 Fe3O4NPs和 Fe3O4Van 进行表征，验证 Fe3O4NPs 和 Fe3O4Van的光学性质，结果见图 3。Fe3O4NPs 和 Fe3O4Van 的紫外可见吸收光谱在400900 nm 范围内均显示出了强烈的宽吸收，表明两者均具有出色的光热转换潜力，可高效杀灭细菌。2.2实验原理验证S.aureus 是一种常见的革兰氏阳性菌，使用超微弱化学发光检测仪对 Fe3O4Van 在检测 S.aureus 过程中的化学发光强度进行监测，对 Fe3O4Van 的检测原理进行了验证。细菌数量与化学发光强度的对应关系见图 4。由图 4 可知，随着实验体系中细菌数量的增加，所分泌的过氧化氢酶逐渐增加，对含有 H2O2和 luminol化学发光体系的抑制作用就越强。2.3Fe3O4Van 光热性能研究通过近红外的激光（808 nm）照射研究 Fe3O4Van的光热性能，结果见图 5。A1 滋m图 2验证 Fe3O4Van 的成功制备Fig.2Verification of Fe3O4Van preparation1.00.80.60.40.20200300900波长/nm400500600700800Fe3O4VanFe3O4NPs图 3Fe3O4NPs 和 Fe3O4Van 的紫外特征吸收光谱Fig.3Characteristic UV absorption spectra of Fe3O4NPs andFe3O4Van图 4细菌数量与化学发光强度的对应关系Fig.4Changes in chemiluminescence intensity with the numberof bacteria1.0伊1048.0伊1036.0伊1034.0伊1032.0伊1030050100000细菌数量/（CFU/mL）1005001000 5000 10000 50000A70 益25 益Fe3O4VanFe3O4NPsPBS5 min43210检测分析150-15-30-45Fe3O4VanFe3O4NPsVanBA.Fe3O4Van 的扫描电子显微镜图像；B.Fe3O4Van、Fe3O4NPs 以及万古霉素的 Zeta 电位分析。126食品研究与开发圆园23 年 11 月第 44 卷第 21 期8070605040302001060时间/min20304050B从图 5A 中可以看出，Fe3O4NPs 和 Fe3O4Van 的温度随着激光照射时间的延长而增加。所制备的Fe3O4Van 可以抵抗长时间的激光照射，在 5 个加热/冷却过程的循环后溶液的最高温度并未发生明显变化（图 5B），表明其具有优异的光热稳定性。2.4条件优化为了提高实验体系的灵敏度，以金黄色葡萄球菌为代表，在其添加量为 103CFU/mL 时对 H2O2浓度、实验温度以及复合物与 H2O2的孵育时间进行了优化。2.4.1H2O2浓度优化由于细菌分泌的过氧化氢酶会分解溶液中的H2O2，外源加入 H2O2的浓度会影响实验体系的化学发光强度，因此对实验中外源 H2O2浓度进行优化，结果见图 6。由图 6 可知，当 H2O2浓度为 0.8 mmol/L 时，检测体系中化学发光强度的比值达到最大值，此时检测效果最佳。因此，选用 H2O2浓度为 0.8 mmol/L 开展后续实验。化学发光强度比值用 1-（I/I0）来表示，其中 I 表示在含有不同浓度 H2O2的检测体系中加入浓度为103CFU/mL 的金黄色葡萄球菌时，所对应的化学发光强度值；I0则表示在含有不同浓度 H2O2的检测体系中未添加细菌时所对应的化学发光强度值。2.4.2实验温度优化由于实验过程中涉及了活细菌和不同的材料，进一步考察实验温度对检测过程的影响，结果见图 7。从图 7 可以看出，在不同实验温度下溶液中的化学发光强度比值接近，说明实验温度对于细菌检测的影响并不明显。因此为了检测过程的方便及快速，最终选择接近于室温的 25 益作为检测时的实验温度。化学发光强度比值用 1-（I/I0）来表示，其中 I 表示在不同温度下，当检测体系中含有浓度为 103CFU/mL 的金黄色葡萄球菌时所对应的化学发光强度值；I0则表示在不同温度下，当检测体系中未添加细菌时所对应的化学发光强度值。2.4.3孵育时间优化Fe3O4Van 与细菌形成巨大的复合物后，复合物中的细菌仍会逐步分解 H2O2，复合物与 H2O2的孵育时间也会影响实验的化学发光强度。孵育时间优化的结果见图 8。从图 8 可以看出，化学发光强度比值随着孵育时A.PBS、Fe3O4NPs 以及 Fe3O4Van 在不同时间的近红外激光照射下溶液的红外热成像图；B.Fe3O4Van 溶液的升温和冷却曲线。图 5Fe3O4Van 溶液的光热性能Fig.5Photothermal properties of Fe3O4Van solution图 6H2O2浓度优化Fig.6Optimization of H2O2concentration0.60.50.40.30.20.100.11.5H2O2浓度/（mmol/L）0.20.50.81.0图 7实验温度优化Fig.7Optimization of test temperature0.70.60.50.40.30.20.10450温度/益253745图 8孵育时间优化Fig.8Optimization of incubation time0.70.60.50.40.30.20.10115孵育时间/min2510检测分析127食品研究与开发圆园23 年 11 月第 44 卷第 21 期间的延长，整体呈现上升趋势。在 10 min 时到达平台期，为了保证最佳的检测效果，同时节省实验时间，因此本实验选用的孵育时间为 10 min。化学发光强度比值用 1-（I/I0）来表示，其中 I 表示在不同孵育时间下，当检测体系中含有浓度为 103CFU/mL 的金黄色葡萄球菌时所对应的化学发光强度值；I0则表示在不同孵育时间下，当检测体系中未添加细菌时所对应的化学发光强度值。综上所述，选用 H2O2浓度为 0.8 mmol/L、实验温度为 25 益和孵育时间为 10 min 进行后续的细菌检测和灭活实验。2.5细菌检测不同浓度的细菌分泌的过氧化氢酶也有所差异，通过化学发光监测降解 H2O2的速度可以间接计算细菌的数量。化学发光强度与 S.aureus 数量的线性关系见图 9。将 Fe3O4Van 与不同浓度的 S.aureus 孵育，随后将 Fe3O4Van-S.aureus 的复合沉淀物分散在 H2O2中。细菌所分泌的过氧化氢酶可分解体系中的 H2O2，待反应完全后，吸取上述混合溶液加入化学发光体系中，利用超微弱化学发光检测仪记录对应化学发光强度。在一定范围内，细菌数量越多，所产生的过氧化氢酶就越多，对化学发光体系的抑制作用就越强。因此，可以根据此变化建立化学发光强度与细菌浓度的变化关系。如图 9A 所示，S.aureus 浓度在 10105CFU/mL 之间与化学发光强度存在良好的线性关系，其 R2=0.985 6。同时可使用智能手机记录化学发光的变化情况，对应细菌数量下的化学发光强度变化（图 9B）。随后考察了该检测方法对于不同菌种的特异性。细菌特异性检测见图 10。由图 10 可知，只有当 S.aureus、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）等革兰氏阳性菌存在时才会使得化学发光强度明显降低，而当大肠杆菌（E.coli）、耐卡那霉素大肠杆菌（KREC）以及沙门氏菌（Salmonella）等革兰氏阴性菌存在时对化学发光强度的影响并不明显。这是由于 Fe3O4Van 中所修饰的万古霉素对革兰氏阳性菌具有特异性识别能力，在实际检测过程中可有效区分革兰氏阴性与阳性细菌，实现对革兰氏阳性细菌的特异性检测。2.6实际样品中的细菌检测为了进一步评估 Fe3O4Van 在实际样品中检测 S.aureus 的准确性和可靠性，对牛奶以及矿泉水进行加标回收实验，结果见表 1。由表 1 可知，Fe3O4Van 对牛奶中 S.aureus 的回收率为 93%103%，对矿泉水中 S.aureus 的回收率为98%103%。以上实验数据表明本方法对检测牛奶以及101102105103104B10 0008 0006 0004 0002 0000101102105细菌数量/（CFU/mL）103104y=-20.60 x+103.08R2=0.985 6AA.化学发光强度与 S.aureus 数量的标准曲线；B.对应细菌数量下的化学发光图。图 9化学发光强度与 S.aureus 数量的线性关系Fig.9Linear relationship between chemiluminescence intensityand the number of S.aureus图 10细菌特异性检测Fig.10Bacterial specificity10 0008 0006 0004 0002 0000表 1牛奶和矿泉水中 S.aureus 的检测Table 1Detection of S.aureus in milk and mineral water样品添加量/（CFU/mL）检测值/（CFU/mL）回收率/%相对标准偏差/%牛奶001伊1031.03伊1031039.421伊1040.93伊104938.691伊1050.95伊105956.61矿泉水001伊1031.02伊1031026.311伊1040.98伊104987.131伊1051.03伊1051036.54检测分析128食品研究与开发圆园23 年 11 月第 44 卷第 21 期矿泉水等实际样品中的 S.aureus 具有较好的可行性。2.7光热杀菌为了检验 Fe3O4Van 的光热杀菌效果，采用传统的平板涂布法通过菌落计数的方式探究其对 S.au原reus 的抗菌能力。Fe3O4Van 对 S.aureus 的抗菌能力见图 11。由图 11A 可知，S.aureus 在有/无近红外 808 nm激光照射下，其菌落数量并无明显差异，说明实验条件温和，激光照射本身并不影响 S.aureus 的生物活性。在无近红外 808 nm 激光照射的情况下，经磁分离得到的 S.aureus+Fe3O4Van 复合物经培养后可以在营养琼脂平板上观察到大量的菌落，其菌落数量与空白组相差无几，表明 Fe3O4Van 对 S.aureus 的生长几乎没有抑制作用。但经过近红外 808 nm 激光照射后，S.aureus+Fe3O4Van 组中的 S.aureus 几乎全部被杀死。由图 11B 可知，通过统计分析不同处理后的菌落数量，计算得出 Fe3O4Van 对 S.aureus 的光热抗菌效率为 98.6%，表明具备优异光热性能的 Fe3O4Van 可以实现对 S.aureus 的灭活，可有效避免细菌的二次污染。3结论本研究在 Fe3O4NPs 的基础上进一步修饰革兰氏阳性菌特异性识别分子万古霉素，形成 Fe3O4Van，从而增强 Fe3O4Van 与细菌的结合能力，通过优化 H2O2浓度、实验温度以及孵育时间确定了以 Fe3O4Van 的化学发光强度为信号对 S.aureus 检测的最佳条件，研究结果显示，Fe3O4Van 对 S.aureus 检测的最优条件：H2O2浓度为 0.8 mmol/L、实验温度为 25 益以及孵育时间 10 min。在该条件下，常见的食源性致病菌 S.aureus在浓度 10105CFU/mL 之间与化学发光强度存在良好的线性关系。在对牛奶以及矿泉水的加标回收实验中回收率为 93%103%，表明其在实际样品中具有较好的应用性。同时，具备优异光热性能的 Fe3O4Van 可实现对 S.aureus 的原位杀死，抗菌效率高达 98.6%。本平台的成功构建为食品安全检测与质量控制研究提供了新的策略。参考文献：1王紫璇,孙洁芳,邵兵.食物中典型致病菌的快速检测研究进展J.中国食品卫生杂志,2022,34(2):382-389.WANG Zixuan,SUN Jiefang,SHAO Bing.Research progress inrapid detection of typical pathogenic bacteria in food stuffJ.Chi原nese Journal of Food Hygiene,2022,34(2):382-389.2欧阳新华.食品加工中食源性致病菌的危害和预防措施J.现代食品,2023,29(3):147-150.OUYANG Xinhua.Hazards and preventive measures for foodbornepathogenic bacteria in food processingJ.Modern Food,2023,29(3):147-150.3BHARDWAJ N,BHARDWAJ S K,NAYAK M K,et al.Fluorescentnanobiosensors for the targeted detection of foodborne bacteriaJ.TrAC Trends in Analytical Chemistry,2017,97:120-135.4HYNEK J,ZELENKA J,RATHOUSKY J,et al.Designing porphy-rinic covalent organic frameworks for the photodynamic inactivationof bacteriaJ.ACS Applied Materials&Interfaces,2018,10(10):8527-8535.5LI D,KUMARI B,MAKABENTA J M,et al.Effective detectionof bacteria using metal nanoclustersJ.Nanoscale,2019,11(46):22172-22181.6XIONG M H,LI Y J,BAO Y,et al.Bacteria-responsive multifunc原tional nanogel for targeted antibiotic deliveryJ.Advanced Materials,2012,24(46):6175-6180.7黄亚妮,陈代杰,殷瑜.基于万古霉素荧光探针的原位标记及应用J.中国抗生素杂志,2022,47(8):760-765.HUANG Yani,CHEN Daijie,YIN Yu.In situ labeling based on flu原orescent vancomycin probe and its applicationsJ.Chinese Journalof Antibiotics,2022,47(8):760-765.8HAO Z,LIN X D,LI J J,et al.Multifunctional nanoplatform for du原al-mode sensitive detection of pathogenic bacteria and the 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