高效液相色谱分析技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,高效液相色谱分析技术,2026/10/1,HPLC,是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间,分配系数,的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。,A,B,C,A,B,C,进样,流动相,流动相,固定相,流动相,一,.,基本原理,2026/10/1,按,溶质,（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类：,分配色谱：,分配系数,亲和色谱：,亲和力,吸附色谱：,吸附力,离子交换色谱：,离子交换能力,凝胶色谱（体积排阻色谱）：,分子大小而引起的体积排阻,2026/10/1,分配色谱,又可分为：,正相色谱,：固定相为极性，流动相为非极性。,反相色谱,：固定相为非极性，流动相为极性。,用的最多，约占,60,70,。,固定相,又分为两类：,一类是使用最多的,微粒硅胶,；,另一类是使用较少的,高分子微球,;,优点是,强度大、化学惰性、使用,pH,范围大,(,pH=1,14),；,缺点是,柱效较小，常用于离子交换色谱和,凝胶色谱。,2026/10/1,微粒硅胶,占所有柱填料的,80,它是近代高效液相色谱技术中最重要的柱填料类型。,使用,微粒硅胶,注意事项：,pH,使用范围是,，,若过碱（,pH,8,），硅胶会粉碎或溶解；,若过酸（,pH,1,），键合相的化学键会断裂。,硅胶键合相的,优点,：,硅胶的强度大,化学稳定性好,微粒硅胶的了孔结构和表面积易人为控制,2026/10/1,按键合到微粒硅胶基质上的官能团可分为：,正相柱,：填料为,极性,，官能团为,CN,、,NH,2,等,反相柱,：填料为,非极性,，官能团为烷烃，例如：,C18,(ODS),、,C8,、,C4,等。,“,C18,”,柱,“万能柱”填料,“,C18,”,柱,即,十八烷基硅烷键合硅胶,填料（,Octadecylsilyl,简称,ODS,），为最常用的“万能柱”填料，可完成高效液相色谱,7080,的分析任务。,2026/10/1,流动相：,1.,正相色谱,常用的流动相及其冲洗强度的顺序是：,正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇,2.,反相色谱,最常用的流动相及其冲洗强度如下：,H,2,O,甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃,最常用的流动相组成是：“甲醇,H,2,O”,和“乙腈,H,2,O”,，由于乙腈的剧毒性，通常优先考虑“甲醇,H,2,O”,流动相。,2026/10/1,流动相的选择原则是：,样品易溶，且溶解度尽可能大,化学性质稳定，不损坏柱子,不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收,粘度低，流动性好,易于从其中回收样品,无毒或低毒，易于操作,易于制成高纯度，即色谱纯,废液易处理，不污染环境,2026/10/1,HPLC,的组成,Pump,泵,Injector/Autosampler,进样器,/,自动进样器,Column,色谱柱,Detector,检测器,Data System/Integrator,数据系统,/,积分仪表,All of these components can have problems and require troubleshooting.,所有这些部件都可能出现故障而需要检修。,二、,HPLC,故障诊断,2026/10/1,HPLC,出现故障可以从多方面入手,1.,从部件的运转情况推测，如压力、流速的变化,2.,从色谱图的异常情况推测，如出峰时间、峰形,3.,从数据结果中分析,2026/10/1,1.,从压力变化判断,（,Pressure,）,压力无,压力高,压力低,压力不稳定,2026/10/1,现象,判断,故障排除,面版灯不亮,电源不通,检查电源,接头松脱,拧紧接头,泵头,漏液,接口太松,拧紧泵头螺丝,泵密封垫磨损,更换密封垫,泵不送溶剂,泵头有气泡,排气泡，溶剂需脱气,使用的溶剂黏性太高,换低黏性溶剂,溶剂贮液器中过滤器脏,清洗贮液瓶、过滤器，,排空阀打开,关闭排空阀,控制器设定不正确,设置正确,流动相不够,补足流动相,1.,1,压力无,2026/10/1,现象,判断,故障排除,压力值高,滤头污染,清洗,连接管路进样阀阻塞,冲洗，必要时更换,泵流速设定太高,设定正确的流速,流动相使用不恰当,使用恰当的流动相,缓冲结晶盐沉淀,冲洗,样品与流动相不互溶,稀释或改变流动相,柱温太低,升高温度,色谱柱性能下降,换柱,1.2,压力高,2026/10/1,现象,判断,故障排除,压力值低,泵流速设定太低,设定正确的流速,色谱柱选择不恰当,更换恰当的色谱柱,柱温过高,降低柱温,系统漏液,检查漏液位置并维修,流动相使用不当,改变流动相,1.3,压力低,2026/10/1,压力不稳定,现象,判断,故障排除,压力变化重现性好,采用梯度洗脱,所引起的压力是正常,泵内有气泡,溶剂脱气不适当,排气泡，溶剂需脱气,压力波动,泵密封垫损坏,更换密封垫,溶剂混合器故障,清洗或更换混合器,漏液,连接口太松,拧紧接口,管路损坏,更换,2026/10/1,基线漂移、噪声,峰形异常,（前沿、拖尾、变宽、分叉、无峰、负峰、鬼峰）,保留时间变化,2.,从色谱图的异常情况推测,2026/10/1,现象,判断,故障排除,基线漂移,测定的波长选择有误,流动相含有紫外吸收化合物导致基线漂移,检测器污染,清洗检测器,溶剂贮槽污染,清洗贮槽更换新流动相冲洗柱子,前次分析的样品中有强保留的物质,用强度合适的溶剂清洗色谱柱,2.1,基线漂移、噪声,2026/10/1,现象,判断,故障排除,无规则基线噪音,系统不稳或未达到平衡,延长平衡时间,系统泄漏,检查并进行维修,流动相污染或分解,清洗溶剂贮液瓶、过滤器、使用,HPLC,级试剂,流动相混合不均,维修或更换混合器,柱污染、填料流失或阻塞,冲洗柱或更换柱,检测池被污染或系统内有气泡,用甲醇或其他强极性的溶剂冲洗流通池,检测器灯能量不足,更换灯,2.1,基线漂移、噪声,2026/10/1,现象,判断,故障排除,规则基线噪音,流动相、检测器或泵内有气泡,流动相脱气，冲洗系统除去检测器或泵内的空气,室温不稳,使用柱温箱、将系统置于恒温、空气对流小的环境,泵入口管路松或阻塞,检查泵入口管路,在同一水平上有其他设备,关掉仪器，检查干扰是否来自于外部,流动相混合不完全,使流动相混合均匀或使用低黏度的溶剂,2.1,基线漂移、噪声,2026/10/1,峰前沿,现象,判断,故障排除,峰前沿,柱性能下降,更换色谱柱,保护柱失效,换柱芯,进样体积太大或样品浓度太高,降低进样体积或稀释样品浓度,2026/10/1,2.,2.2,峰拖尾,现象,判断,故障排除,峰拖尾,定量环与阀连接处出现死区,更换定量环,进样量太大,减少进样量,色谱柱或保护柱被污染,清洗，必要时更换,色谱柱选择不当，试样与固定相间有作用,选择恰当的色谱柱,样品在流动相中溶解度小,选择恰当的流动相,2026/10/1,2.2.3,峰展宽,现象,判断,故障排除,峰展宽,进样体积或浓度过大,减小进样体积、稀释样品,流动相流速太低,调节流速,柱、流动相选择不当,选择恰当的色谱柱或流动相,缓冲液浓度太低,增加浓度,漏夜,检查漏夜的位置并维修,出现两个或多个未被完全分离的物质的峰,选择其它色谱条件以改善分离效果,检测器时间常数太大,使用较小的时间常数,2026/10/1,2.2.4,峰分叉,现象,判断,故障排除,峰分叉,柱性能下降,更换色普柱,保护柱失效,换柱芯,色谱柱或保护柱被污染,清洗，必要时更换,进样体积太大或样品浓度太高,降低进样体积或降低样品浓度,样品不稳定有部分分解,防止试样组分的分解,样品溶剂不溶于流动相,改变溶剂或采用流动相溶解样品,2026/10/1,2.2.5,无峰,现象,判断,故障排除,无峰,检测器选择或参数设置不当，样品无吸收,正确选择检测器，如样品无紫外吸收就不应选,UV,检测器,样品降解,检查样品配制过程,进样器故障，如注射器泄漏，定量环堵塞,检查进样器,样品浓度太低，而检测灵敏度不高,适当提高样品浓度和进样量，并提高检测灵敏度,检测器与数据处理装置连接故障,检查并正确连接,2026/10/1,2.2.6,负峰,现象,判断,故障排除,出现所有负峰,连接数据处理系统信号线接反,正确连接,记录仪或检测器信号极性相反,改变极性设置,出现一个或几个负峰,使用的流动相吸收高,使用流动相稀释样品,自动进样器注射,进空气,清洗自动进样器,2026/10/1,2.2.7,鬼峰,现象,判断,故障排除,色谱图出现鬼峰,样品中未知物,处理样品,样品前处理时产生降解或混入杂质,用标准品对照、检查样品处理过程，换新样品,前一次进样的洗脱物,增加分析时间或梯度洗脱、提高流速、两次进样间用强溶剂冲洗色谱柱,流动相中含有稳定剂或稳定剂变化,使用无防腐溶剂,注射器、六通阀、柱子、检测器或管路污染,清洗,2026/10/1,现象,判断,故障排除,保留时间不重复,系统不同或更换流动相时未达到平衡,分析之前应有足够的时间使系统平衡,溶剂配比不合适,调节溶剂配比,流速变化,重新设定流速,检查泵是否正常工作,室温波动大,使用柱温箱,柱被污染,冲洗柱或更换柱,2.3,保留时间变化,2026/10/1,3.,从数据结果中分析,3.1,定量结果,现象,判断,故障排除,精密度降低,样品预处理时样品降解或混入杂质,用标准品对照、检查样品处理过程，换新样品,保留时间改变，峰形不正常,见“峰形不正常”的故障排除方法,检测器响应故障,检查检测器,2026/10/1,现象,判断,故障排除,精密度降低,峰积分不正确,重新设置参数,进样问题（对外标法）,（,1,）如使用注射器的手动进样器，需确保进样操作的重复性,（,2,）如使用自动进样器需确保正确的进样体积，注射器不含空气，样品瓶有足够的样品，系统不泄漏,准确度降低,样品蒸发,样品密封保存在适当的温度下,样品前处理不当,检查样品的处理过程,内标物配置不当,配置新的内标物,3.1,定量结果,2026/10/1,现象,判断,故障排除,峰不能分辨,改变保留时间,见“保留时间改变”的故障排除,数据处理装置的参数不正确,适当输入参数，进标准样，提高准确度,无峰,改变保留时间,故障排除方法,数据处理装置的参数不正确,重新适当输入参数，进标准样，提高准确度,鬼峰,见“鬼峰”可能的原因,见“鬼峰”的故障排除方法,3.2,定性结果,2026/10/1,温度：,10,30,；相对湿度,80,；最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施。,三、,HPLC,的,日常维护与保养,HPLC,的日常操作条件：,2026/10/1,六通阀进样器的使用及保养,泵的保养,柱的保养,紫外灯的保养,HPLC,的日常维护与保养,2026/10/1,工作原理,手柄位进样,(Load),位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；,将手柄转动至进样,(Inject),位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。,六通阀进样器的使用及保养,2026/10/1,三、HPLC的日常维护与保养,按键合到微粒硅胶基质上的官能团可分为：,在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；,样品前处理时产生降解或混入杂质,若过酸（pH1），键合相的化学键会断裂。,适当提高样品浓度和进样量，并提高检测灵敏度,保留时间改变，峰形不正常,色谱柱选择不当，试样与固定相间有作用,（1）如使用注射器的手动进样器，需确保进样操作的重复性,使流动相混合均匀或使用低黏度的溶剂,微粒硅胶占所有柱填料的80,它是近代高效液相色谱技术中最重要的柱填料类型。,反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下：,按键合到微粒硅胶基质上的官能团可分为：,在分析完成后，马上关闭检测器,在分析完成后，马上关闭检测器,缺点是柱效较小，常用于离子交换色谱和,凝胶色谱（体积排阻色谱）：分子大小而引起的体积排阻,手柄转动要,快速,：,手柄处于,Load,和,Inject,之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。,部分装液法,进样时，进样量最多为定量环体积的,75,并且要求每次进样体积准确、相同；,完全装液法,进样时，进样量最少为定量环体积的,3,至,5,倍,，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。,六通阀进样器的使用及保养,2026/10/1,样品必须,过滤,，样品溶液均要用,0.45(0.22),m,的滤膜过滤,防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。,进样结束,冲洗,进样器：通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的,Load,和,Inject,位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。,六通阀进样器的使用及保养,2026/10/1,泵的保养：,使用流动相尽量要清洁,进液处的砂芯过滤头要经常清洗,流动相交换时要防止沉淀,避免泵内堵塞或有气泡,每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染,2026/10/1,柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动,当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净,要注意流动相的脱气,避免使用高粘度的溶剂作为流动相,进样样品要提纯；严格控制进样量,柱的保养：,2026/10/1,一类是使用最多的微粒硅胶；,色谱柱选择不当，试样与固定相间有作用,按键合到微粒硅胶基质上的官能团可分为：,适当提高样品浓度和进样量，并提高检测灵敏度,色谱柱选择不当，试样与固定相间有作用,按键合到微粒硅胶基质上的官能团可分为：,流动相脱气，冲洗系统除去检测器或泵内的空气,按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类：,流动相脱气，冲洗系统除去检测器或泵内的空气,增加分析时间或梯度洗脱、提高流速、两次进样间用强溶剂冲洗色谱柱,三、HPLC的日常维护与保养,记录仪或检测器信号极性相反,进样体积太大或样品浓度太高,记录仪或检测器信号极性相反,HPLC System Troubleshooting,每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品,每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱,若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭,柱的保养：,2026/10/1,紫外灯的保养：,在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器,样品池要保养,2026/10/1,请选择内容,结束,一、基本原理,Basic principle,二、故障诊断,HPLC System,Troubleshooting,三、日常维护,HPLC System,Maintenance,2026/10/1,