制备液相色谱技术学习教案.pptx

,#,单击此处编辑母版标题样式,会计学,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,会计学,1,制备液相色谱技术,高效制备液相色谱的原理：,色谱分离原理无论是分析型色谱还是制备型色谱都是相似的，那就是色谱理论。,不过在理论的遵照上，制备型有时需打折扣。,这是由于两种类型的色谱最终的目的是不一样的。,分析型色谱：分离度高，敏捷度高，以含量测定为目的。,制备型色谱：规定纯度、产量和收益。,第1页/共68页,经典的制备色谱措施与高效制备液相色谱的异同及优缺陷：,相似：目的相似；某些措施原理也相似。,不一样：自动化程度不一样，效率不一样，分离复杂化合物的能力不一样。,经典制备色谱措施：柱色谱、薄层色谱 ,第2页/共68页,第3页/共68页,第4页/共68页,第5页/共68页,高效制备液相色谱,长处：效率高，收率相对较高，尤其适合复杂样品、性质靠近化合物的纯化。纯化效果理想。,缺陷：设备复杂昂贵，投资大，运行费用较高。,经典制备色谱措施,长处：设备简朴，投资小，见效快。能满足一般样品的 纯化规定。,缺陷：效率低下，收率低，对于过于复杂的化合物，纯化效果不理想。,第6页/共68页,制备液相色谱又称纯化系统，是目前高效率制备纯化合物最有力的措施，广泛应用于：,1.天然产物的分离与纯化,2.合成药物的纯化,3.合成反应中间产物或副产物的制备,4.手性药物的分离与纯化,5.药物杂质的分离制备,.,第7页/共68页,第8页/共68页,重复性,第9页/共68页,选择性规定,第10页/共68页,色谱柱吸附等温线,正常载荷,(loading),：,第11页/共68页,色谱柱吸附等温线,超载,(overloading),：,第12页/共68页,纯度（,purity),、产量（,throughput,）,和收益（,yield,）（,PTY,）三者的关系,第13页/共68页,浓度过载和体积过载,浓度过载,体积过载,决定于流动相中的溶解度；,位于吸附等温线的,“,制备,”,区域；,产量由选择性决定；,固定相颗粒大小影响较低。,决定于进样体积；,位于吸附等温线的,“,分析,”,区域；,产量由柱子的直径决定；,固定相颗粒需要小一些。,通常浓度过载和体积过载结合着使用。而由于产量较高的缘故，因而更喜欢使用浓度过载。,第14页/共68页,浓度过载和体积过载色谱示意图,第15页/共68页,什么时候使用浓度过载,?,什么时候使用体积过载,?,一般状况下，由于需要有较大的throughput，因此浓度过载使用较多，但当样品浓度过稀，又没有合适的措施浓缩时或流动相溶解样品的能力较弱时，这时就应当使用体积过载。,第16页/共68页,由分析型色谱怎样扩展到制备型色谱？,扩展计算,第17页/共68页,扩展计算,第18页/共68页,扩展计算举例,r1=1.5mm,r2=10.6mm,V1=0.6mL/min,V2=?计算成果：30mL/min,第19页/共68页,=30ml/min,扩展计算举例,?,计算结果,25mg,第20页/共68页,0.35mL/min,流速下的色谱图,（分析型）,第21页/共68页,经扩展计算，采用不一样的柱径、进样量和流速样品的色谱图,第22页/共68页,上述五种色谱状态的参数：,第23页/共68页,在分析型色谱柱上，不一样进样量的色谱图,第24页/共68页,在制备型色谱柱上的色谱图,第25页/共68页,制备液相馏分搜集的三种方式,1.基于时间（Time-based）,2.基于峰（peak-based）,3.基于质量（Mass-based）,第26页/共68页,基于时间（,Time-based,）,根据馏分的保留时间及其色谱峰宽，以时间作为馏分搜集器动作的指令参数。,特点：,参数设置以便，样品收益高、损失少。,色谱保留时间的不稳定会影响到馏分的纯度和收益。,第27页/共68页,Time-based,用峰的时间分割，按峰搜集馏分,色谱峰重叠严重，重叠面积很大，搜集到的两个馏分将明显不纯。这时应考虑使用Time-based。,第28页/共68页,Time-based,第29页/共68页,基于峰（,Peak-based,）,根据色谱峰的正负斜率，触发馏分搜集器，以色谱峰正负斜率作为馏分搜集器动作的指令参数。,特点：,馏分纯度高。,馏分保留时间的不稳定不会影响到馏分的纯度。,参数设置不以便（斜率参数需计算）；受色谱峰峰形变化的影响较大。,样品收益低。,第30页/共68页,运用正、负斜率按峰进行馏分搜集。,Peak-based,正、负斜率和阈值可预先设置。,当色谱信号都超过预先设置的正斜率和阈值两个参数时，将触发峰的搜集信号；,当色谱信号低于阈值或低于预先设置的负斜率时，将触发停止搜集信号。,设置阈值的目的是为了消除噪声的影响。,第31页/共68页,第32页/共68页,Peak-based实例（只搜集背面这一组分）,第33页/共68页,基于质量（,Mass-based,）,根据馏分的质量作为指令参数，触发馏分搜集器。,特点：,馏分纯度高、且收益高；,馏分保留时间以及色谱峰峰形变化都不会影响到馏分的纯度；,参数设置以便；,需配置MS检测器，设备费用投入较大。,第34页/共68页,Mass-based,当使用按质量进行馏分搜集时，只有当MSD检测到色谱峰具有目的质量数，且该目的质量数的强度超过特定的阈值时，馏分搜集才被触发。这就保证了在每次进样中只搜集含目的化合物的馏分。大部分状况下只有一种馏分。,局限性之处是注入的其他样品组分不能回收。,第35页/共68页,按质量数进行馏分搜集的成果,第36页/共68页,三种馏分搜集方式的比较,X-Based,馏分纯度,馏分收益,Time,不高,高,Peak,高,不高,Mass,高,高,第37页/共68页,它们与纯度、产量和收益（,PTY,）的关系怎样？,结合实际需求合理选择,。,三种馏分搜集方式怎样选择？,第38页/共68页,第39页/共68页,第40页/共68页,第41页/共68页,第42页/共68页,第43页/共68页,高效制备液相色谱流路示意图,第44页/共68页,1,、延迟体积校正,2,、扩散影响,两个问题：,第45页/共68页,什么是延迟体积？,理想状况下，当检测器检测到组分信号时，同一时刻，组分也被馏分搜集器搜集到。,实际状况下，这是做不到的，由于存在一种延迟体积。,延迟体积：检测池到馏分搜集器之间管路的体积。,第46页/共68页,高效制备液相色谱流路示意图,第47页/共68页,延迟体积校正,后运行时间：是指分析物组分从检测池到馏分搜集器所用的时间。,为了精确地触发馏分搜集器的启动和停止，必须测定后运行时间。后运行时间可以转换成与流速无关的延迟体积。,后运行时间测定措施之一：,通过在流路内注射一种染料，当馏分搜集器针尖出现该染料时记录时间。,后运行时间t馏分搜集器-t检测器,第48页/共68页,后运行时间测定措施之二：,在馏分搜集器内装入一种检测器，该检测器称为延迟传感器。将延迟校正物注入流路，两个检测器都记录信号。两个检测器之间的时间差就是后运行时间。,根据校正时所用的流速，系统将自动计算出精确的延迟体积，并保留，同步也能计算出每个流速下的后运行时间，当流速变化时，不需要再校正后运行时间。,第49页/共68页,扩散,扩散使峰（谱带）变宽，严重减弱了色谱的辨别（分离）能力。,谱带变宽与流速成反比，与管线长度和管线内径成正比。,第50页/共68页,三种不一样管径的扩散影响,因此，制备液相色谱中更应注意缩短管路的长度，减少不必要的死体积。,第51页/共68页,多种类型的制备液相展示,第52页/共68页,第53页/共68页,第54页/共68页,第55页/共68页,第56页/共68页,第57页/共68页,应用实例：,第58页/共68页,第59页/共68页,第60页/共68页,人参皂甙Re、Rg1的HPLC制备,第61页/共68页,第62页/共68页,第63页/共68页,第64页/共68页,第65页/共68页,第66页/共68页,结束,第67页/共68页,