体内药物分析方法的建立与验证.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,PPT,文档演模板,Office,PPT,体内药物分析措施的建立与验证,2026/9/26,分析措施的设计根据,分析措施建立的一般环节,分析措施验证的内容与规定,体内药物分析应用示例,本章内容提纲,第四章 分析措施的建立与验证,2026/9/26,2,2,第一节 分析措施的设计根据,建立分析检测措施的重要根据,待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况,分析测定的目的与规定,生物样品的类型与预处理措施,试验室条件,第四章 分析措施的建立与验证,2026/9/26,3,3,一、,待测药物的理化性质及体内存在状况,精确测定生物样品中的药物或其特定代谢物,预处理待测物从结合物或缀合物中释放,选择样品预处理措施首先应考虑,待测药物的理化性质,药物在生物体内的存在状况,药物在生物体内的生物转化(代谢)途径,第四章 分析措施的建立与验证,第一节 分析措施的设计根据,2026/9/26,4,4,(一),待测药物的理化性质,药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分派系数等预处理及检测措施,具有亲脂性在合适的pH值下用溶剂萃取,具有强极性或亲水性沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取等,具有挥发性GC测定法,具有光谱或电化学特性分析检测措施,药物的稳定性萃取浓缩技术,对酸碱不稳定防止使用强酸或强碱性溶剂,对热不稳定防止高温蒸发溶剂,第四章 分析措施的建立与验证,第一节 分析措施的设计根据,2026/9/26,5,5,(二)待测药物的体内存在状态,与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高下,分离萃取措施,蛋白结合较强不适宜直接采用溶剂萃取,体内浓度高下、代谢过程及其代谢产物,分析检测技术,浓度较低（尤其有代谢产物共存）,代谢产物的干扰与特定代谢产物的同步测定,采用LC-MS、EIA等分析检测技术,第四章 分析措施的建立与验证,第一节 分析措施的设计根据,2026/9/26,6,6,二、分析测定的目的与规定,体内药物分析的目的影响分析措施的应用,药代动力学研究药物在体内吸取、分布、代谢和排泄过程,血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物,规定同步测定原形药物和代谢产物,检测宽线性范围(CmaxCmax的1/20)、高敏捷度(10-9g/ml)和高专属,性(分离能力)(原形药物及其代谢产物的分离),措施不必强调措施的简便、迅速；,大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS,第四章 分析措施的建立与验证,第一节 分析措施的设计根据,2026/9/26,7,7,二、分析测定的目的与规定,临床治疗药物监测,有效治疗浓度范围内药物浓度,措施尽量简便、易行；合用于长期、批量样品的测定,大多采用UV、RIA或EIA等,中毒患者的临床急救,药物浓度极高,措施不必强调措施的敏捷度，强调措施的特异性和分析速度,大多采用色谱及其联用技术GC、GC-MS、RIA或EIA,第四章 分析措施的建立与验证,第一节 分析措施的设计根据,2026/9/26,8,8,三、生物样品的类型与预处理措施,生物样品的类型与预处理措施决定分析措施的应用,以血浆或血清为分析样品,采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术,分析样品较为“洁净”，可用HPLC检测,用RIA分析,样品的预处理措施可较为粗放,通过简朴的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定,第四章 分析措施的建立与验证,第一节 分析措施的设计根据,2026/9/26,9,9,四、试验室条件,在设计体内药物分析措施时，还应充足考虑到试验室既有的或有也许在其他试验室使用的仪器装备，合理选择可行的分析措施。,第四章 分析措施的建立与验证,第一节 分析措施的设计根据,2026/9/26,10,10,第二节 分析措施建立的一般环节,一、分析措施的选择,二、分析措施的建立,(一)检测条件的筛选,(二)分离条件的筛选,第四章 分析措施的建立与验证,2026/9/26,11,11,一、分析措施的选择,体内药物分析措施的设计,生物样品中的药物浓度决定分析措施的首要原因,生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少,难以通过增长取样量提高措施敏捷度,通过选择合适的分析措施适应样品分析需求,体内药物分析中常用分析措施特点见表4-1,第四章 分析措施的建立与验证,第二节 分析措施的建立环节,2026/9/26,12,12,二、分析措施的建立,分析措施建立之前,查阅文献资料充足理解药物在体内的动力学过程，使所确定的分析措施,防止受到代谢产物的干扰合用于实际生物样品测定,第四章 分析措施的建立与验证,第二节 分析措施的建立环节,2026/9/26,13,13,二、分析措施的建立,初步确定分析措施后,进行一系列试验工作选择最佳分析条件,同步验证分析措施的可行性确认与否合用于实际生物样品,分析措施的建立和验证过程是不可截然划分的,为便于讨论而分别论述,分析措施的建立环节,第一步：检测条件的筛选,第二步：分离条件的筛选,第四章 分析措施的建立与验证,第二节 分析措施的建立环节,2026/9/26,14,14,(一)检测条件的筛选,原则物质 照确定的分析措施(不包括生物基质的预处理)测定,确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测敏捷度,HPLC 调整检测器(类型、条件),色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度),流动相(组分及其配比)及其流速,柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等,使各物质具有足够的措施敏捷度(LOQ),良好的色谱参数(n、R、T),合适的保留时间(tR),第四章 分析措施的建立与验证,第二节 分析措施的建立环节,2026/9/26,15,15,(二)分离条件的筛选,在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，环节如下：,1空白溶剂试验 溶剂(措施特异性),2空白生物基质试验 endogenous compounds(措施特异性),3模拟生物样品试验 措施效能指标,4实际生物样品测试 代谢产物(措施特异性),第四章 分析措施的建立与验证,第二节 分析措施的建立环节,2026/9/26,16,16,1空白溶剂试验,待测药物的非生物基质溶液（一般为水溶液）,采用确定的分析措施进行衍生化反应、萃取分离等,样品预处理（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等）,测定响应信号（如HPLC峰面积或峰高）,考察目的,措施的特异性,空白值应尽量小，并能有效校正,第四章 分析措施的建立与验证,第二节 分析措施的建立环节,2026/9/26,17,17,色谱分析法,可通过变化反应条件、萃取措施或萃取条件（萃取溶剂的极性、混合溶剂的配比，固相萃取填料性质、冲洗剂与洗脱剂及其用量等），甚至检测器类型,空白试剂信号应不干扰药物的测定（如R1.5）,本环节重要考察,需经化学反应的预处理过程，若预处理过程仅为生物样品的提取分离，则可不进行该环节，直接进行空白生物基质试验,第四章 分析措施的建立与验证,第二节 分析措施的建立环节,2026/9/26,18,18,2.空白生物基质试验,空白生物基质(blank biological matrix),如空白血浆,照“1.空白溶剂试验”项下措施操作,考察目的,生物基质中内源性物质对测定的干扰（措施特异性）,在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗”（信号附近的有限范围）内不应出现内源性物质信号,第四章 分析措施的建立与验证,第二节 分析措施的建立环节,2026/9/26,19,19,3.模拟生物样品试验,模拟生物样品(质量控制,QC样品)空白生物基质中加入待测药物,照“1.空白溶剂试验”项下措施操作,考察目的,措施的线性范围、精密度与精确度、敏捷度,药物的萃取回收率等各项技术指标,同步深入检查生物基质中内源性物质以及也许共同使用的其他药物对测定的干扰程度，即措施特异性,第四章 分析措施的建立与验证,第二节 分析措施的建立环节,2026/9/26,20,20,色谱分析法,深入考察待测药物(或内标物)与内源性物质(或其他药物)的分离状况,色谱峰的 tR、n 和 T 与否与水溶液的一致,色谱峰与否为单一成分,原则曲线的截距与否明显偏离零点等,内源性物质与否看待测药物或内标物质构成干扰,第四章 分析措施的建立与验证,第二节 分析措施的建立环节,2026/9/26,21,21,4.实际生物样品的测试,空白生物基质和模拟生物样品试验确定的分析措施及其条件,不能完全确认与否适合于实际生物样品的测定,药物在体内也许与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物),或代谢生成数个代谢产物及其深入的结合物(或缀合物),实际生物样品确立分析措施后，尚需进行实际生物样品的测试,考察目的代谢产物对药物、内标物质的干扰状况,深入验证措施的可行性,第四章 分析措施的建立与验证,第二节 分析措施的建立环节,2026/9/26,22,22,第三节 分析措施验证的内容与规定,用于实际生物样品分析之前,验证(validation)分析措施的可行性与可靠性,措施验证时应考虑影响分析措施,所有可变原因(采样,样品制备,色谱分离,检测与数据评价等),使用的技术指标,效能指标,使用的样品,一般采用模拟生物样品和用药后的实际生物样品,第四章 分析措施的建立与验证,2026/9/26,23,23,验证环节,首先为分析措施的验证,特异性、精密度与精确度、回收率,定量限与检测限、溶液稳定性,另一方面为生物基质中待测药物稳定性的验证,室温放置、冷冻（或冷藏）、冻-融循环,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,24,24,验证的效能指标与基本规定,1特异性防止干扰,2原则曲线与线性范围覆盖所有浓度范围,3精确度与实际状况相符,4精密度成果可重现,5定量限到达峰浓度的1/101/20,6稳定性保证所有样品精确测定,7提取回收率保证精确度,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,25,25,一、措施特异性(专属性或选择性),措施的特异性(specificity),又称专属性或专一性，一般与选择性(selectivity)互用,系指当有内源性物质存在时，措施精确测定待测物质的能力,专属性表达所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有的,选择性系指将待测物质与其代谢物及同服的其他药物加以辨别(分离)的能力,特异性函盖两者，以验证所测定的物质与待测药物的同一性,考察一种分析措施与否具有特异性，应着重考虑如下几点：,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,26,26,1.内源性物质的干扰,比较待测药物或其活性代谢产物检测信号,对照品（或原则品）,空白生物基质,模拟生物样品（空白生物基质中添加对照品）,如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 与否一致,及与内源性物质色谱峰的 R,确证内源性物质对分析措施有无干扰,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,27,27,2.代谢产物的干扰,比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号,与代谢产物(在实际样品中 tR 随时间延长而增长)的 R,如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 或变化色谱条件(色谱柱)再比较,确证其他代谢产物对分析措施有无干扰,构造已知的特定活性代谢物的测定,必要时通过HPLC-DAD和LC-MS确证色谱峰的单纯性和同一性,对于构造未知的代谢产物的测定,可采用LC-LC-NMR进行构造的初步推测后，考察其干扰状况,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,28,28,3.伍用药物的干扰,TDM 时,还要考虑患者也许同步服用药物(一般为数有限)的干扰,比较待测药物及也许同步服用药物的模拟生物样品的检测信号,如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 与否一致,确证同步服用药物对分析措施的干扰状况,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,29,29,4.与参比措施的有关性,除上述措施外，有时还可使用参比措施对照,参比措施一般选用特异性强、精确度高、线性关系良好的色谱法,如在TDM中使用UV(或RIA)时,可以HPLC(或GC)为参比,参比措施测定成果为横坐标(X);确定措施成果为纵坐标(Y),用最小二乘法计算回归方程 YabX (坐标标度相等),有关系数(r)表达两种措施测得成果的一致性,若 r 1，表达确定措施为非线性，如 RIA 中抗血清滴度选择不妥,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,30,30,4.与参比措施的有关性,YabX,截距(a)表达确定措施受到恒定干扰的程度内源性物质(UV),斜率(b)表达确定措施受到比例干扰的程度标识抗原不纯(RIA),与参比措施的有关性比较除显示分析措施的特异性外,斜率b表达两种措施测得成果的一致性,若参比措施精确度良好,若截距a0,则确定措施的精确度(回收率)为100b(%),第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,31,31,二、原则曲线与线性范围,原则曲线（standard curve）calibration curve or working curve,生物样品中所测定药物浓度与响应的有关性（比例的程度）,一般用回归分析措施所得的回归方程来评价,除少数措施（免疫分析法）外，原则曲线一般为线性模式,回归分析法为最小二乘法（least squares）,或加权最小二乘法（weighted least squares）,线性范围（linear rang）原则曲线的最高与最低浓度的区间,模拟生物样品的测定成果应到达试验规定的精密度和精确度,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,32,32,二、原则曲线与线性范围(续),原则曲线用模拟生物样品建立,线性范围(不包括零点)应能覆盖所有生物样品中的药物浓度,不能使用外推的措施求算未知生物样品中的药物浓度,建立原则曲线所使用的模拟生物样品,应使用与待测的含药生物样品相似的生物基质制备,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,33,33,原则曲线的一般建立措施,1.原则系列溶液(非生物基质溶液)的制备,溶剂水或甲醇（或其他合适溶剂）,浓度原则模拟生物样品中药物浓度的 50倍以上,加入量为生物样品总体积的 2%如下,防止原则模拟生物样品与实际样品存在较大差异,浓度较低应除去溶剂后再加入生物基质,否则,在实际样品测定期应加入等体积的溶剂并涡旋混匀,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,34,34,2.原则系列溶液的浓度范围,至少含58个浓度点(不包括零点,即空白),可覆盖所有待测生物样品中的药物浓度,如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式比例常数约为 2),若体内平均达峰浓度为50，其1/20为2.5,设定最高浓度为100，最低浓度为1(个体差异),实际制备时：500、250、100、50、20、10,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,35,35,3.原则系列模拟生物样品的制备,空白生物基质(如血浆)加入原则系列溶液适量，涡旋混匀,为防止在原则溶液加入及涡旋混合时导致的损失,先加入原则溶液 ,再加入空白生物基质,涡旋混匀 ,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,36,36,4.原则曲线的绘制,以待测药物的检测响应(如色谱峰面积或峰高)或与内标物质的检测响应的比值(内标法)(因变量,y)对模拟血药浓度(自变量,x),求得回归方程(yabx)及其有关系数(),在一组由至少7个浓度(不包括零点)构成的原则曲线中，至多可有2个浓度点数据，可予剔除。但应有确切原因，如：,样品处理有损失、色谱图有问题，或,明显偏离原则曲线该数据参与原则曲线回归后，计算QC样品或返算该点浓度时明显偏离其标称浓度(配制浓度),其他应有至少5个浓度点在原则曲线上,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,37,37,5.,加权最小二乘法,最小二乘法每个浓度点绝对误差(yiyi)赋予同等的重要性,原则曲线上的高下浓度相差悬殊(范围达102),低浓度区的计算值相对误差过大，难以满足规定规定,加权最小二乘法回归计算时增长一种权重因子(w),各浓度的响应值与回归值的相对离差平方和到达最小,式中，wi为原则曲线上第i个浓度点的权重因子,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,38,38,1）回归方程(,y,=a+b,x,)参数的计算,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,39,39,2）权重因子的选择,加权赋予低浓度点以更大的权重,在实际工作中的一般措施,当wi=1/(yi)2时，则,而yi与xi成正比,因此，令wi=1/(bxi)2=k/xi2(一般取wi=1/C2),当高浓度点测量值的精确度下降过大,低浓度点权重过大，减少低浓度点的权重，wi=k/xi,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,40,40,原则曲线的程度规定,药代动力学或生物运用度研究,原则曲线至少包括5个浓度(一般为58个浓度,不包括零点),最高浓度应高于达峰浓度(Cmax)；最低浓度应低于Cmax的10%5%，并应为措施的LOQ(非LOD),回归方程的截距应靠近于零,有关系数规定 0.99(色谱法)或0.98(生物学措施),若非线性，可分为高下两个浓度区间(每个区间不少于5个浓度)，分别加权回归如1、2、5、10、20和10、20、50、100、200,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,41,41,三、精确度,措施精确度(accuracy),系指用该措施测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的靠近程度,应使用实际生物样品测定，但实际生物样品的浓度是未知的因此，一般使用模拟生物样品测定,一般用相对回收率(relative recovery，RR)或 相对误差(relative error，RE)表达,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,42,42,1.,测定法,取空白生物基质（如血浆）数份，照原则曲线项下措施操作，用原则曲线计算,在原则曲线范围内制备质控(quality control，QC)样品,高(靠近上限)、中、低(靠近LOQ)3个浓度,每一浓度至少5个样本,与随行的原则曲线同法测定、计算，每个样品分析测定1次,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,43,43,2.成果计算与程度规定,计算,测定值M(measured)平均值与理论浓度(加入值)A(added)比值,相对回收率,相对误差,程度规定,相对回收率应在85%115%(LOQ附近80%120%),RE在15%(LOQ附近为20%),第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,44,44,四、精密度,措施精密度(precision),系指每次测定成果与多次测定的平均值的偏离程度,表达该分析措施的可反复性(reproducibility),反应分析措施的可操作性，是措施验证的基本要点之一,实际生物样品的量有限(如血浆，一般为0.52ml),使用模拟生物样品测定,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,45,45,1.表达措施,措施精密度一般用原则偏差(standard deviation，SD)或相对原则偏差(relative standard deviation，RSD)表达,SD=,RSD=,包括批内(within-run或intra-assay)RSD日内(within-day),和批间(between-run或inter-assay)RSD日间(between-day，day-to-day),第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,46,46,2.测定法,分别测定法(),照精确度项下措施，取空白生物基质(如血浆)数份，分别在同一批内和不一样批间制备高、中、低 3个浓度的QC样品，并分析测定,批内RSD,每一浓度56个样品，每个样品测定1次，用随行原则曲线分别计算3个浓度及每1浓度的RSD,批间RSD,每1分析批内每一浓度制备1个样品，每个样品测定1次；用随行原则曲线计算3个浓度(每一浓度56个分析批数据)的RSD,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,47,47,2.测定法持续测定法(),若实际样品测定所用的分析批次少于5批，也可进行3个批次的持续分析(每1浓度的每1批次为56个样本)方差分析法,批间RSD=,批内RSD=,=,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,48,48,3.程度规定,在药代动力学和生物运用度研究中,对g/ml级水平的RSD一般应10%,ng/ml级水平的RSD一般应15%,在LOQ附近RSD应20%。,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,49,49,五、定量限,措施定量限(limit of quantitation，LOQ),系指在保证具有一定可靠性(精确度与精密度符合规定)的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度,又称为措施敏捷度(sensitivity),原则曲线上的最低浓度点(最低浓度点LOQ),规定应能满足测定35个消除半衰期后生物样品中的药物浓度,精确度在80%120%(或RE在20%的范围内),RSD20%,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,50,50,六、稳定性与质量控制,稳定性包括措施稳定性和样品稳定性,措施稳定性措施的耐用性,样品稳定性生物样品的寄存条件和时间、冻-融循环,测定法QC样品穿插于实际样品测定全过程,模拟(或实际)生物样品及其预处理后的待测溶液进行考察,规定精确度85%115%(RE在15%范围内)，RSD15%,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,51,51,七、萃取回收率,生物样品的预处理措施,重点考虑措施精确度(或相对回收率)，操作简便、迅速,萃取回收率(绝对回收率，absolute recovery)，70%,萃取回收率与相对回收率的意义不一样,萃取回收率考察生物样品预处理过程导致的药物的程度损失,相对回收率采用原则曲线可精确计算生物样品中药物浓度,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,52,52,1,.,测定法,取空白生物基质(如血浆)，照精确度项下措施，制备高、中、低3个浓度的QC样品(每一浓度至少5个样品)，每个样品分析测定1次,另取等量的相似3个浓度的原则溶液，用溶解模拟生物样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定,AT经萃取后的QC样品的检测信号或比值(内标法),AS未经萃取的原则溶液的检测信号或比值(内标法),第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,53,53,2.程度规定,萃取回收率一般应50%,高、中浓度的,RSD,应15%,低浓度的,RSD,应20%。,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,54,54,第四节 体内药物分析措施应用示例,第三代喹诺酮类广谱抗菌药,盐酸环丙沙星片人体生物等效性,研究,一、文献调研,性质,在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中极微溶解，在氯仿中几乎不溶，在氢氧化钠试液中易溶；环丙沙星游离体在水中不溶，在乙醇、二氯甲烷中极微溶解，在稀醋酸中溶解。,第四章 分析措施的建立与验证,2026/9/26,55,55,药动学参数,吸取过程空腹口服后吸取迅速、人体生物运用度约为49%70%,Cmax 口服500mg后平均Cmax为2.42.6mg/L,Tmax 12h,T1/2 血中T1/2约为4h，肾功能减退时稍有延长至6h,蛋白结合率20%40%,代谢 口服给药24h内，40%50%原形、15%代谢物经肾排出,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,56,56,体内分析措施,RP-HPLC,色谱柱ODS色谱柱,流动相甲醇(乙腈)-磷酸(枸橼酸)缓冲液(三乙胺调整pH2.33.5)，或离子对色谱:溴化十六烷基三甲基铵(氢氧化四丁基铵),检测紫外或荧光检测,生物样品预处理,蛋白沉淀法甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接进样,溶剂萃取法二氯甲烷-异丙醇、氯仿-异丙醇混合溶剂,蛋白沉淀-溶剂萃取乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷-异丙醇提取,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,57,57,二、分析措施设计,1分析措施,血浆蛋白结合率低(20%40%)、以原形从肾排泄,生物等效性研究测定血浆中环丙沙星原形药物的浓度-时间曲线。初步确定：采用RP-HPLC法,2检测措施,紫外敏捷度1ng，若取血浆0.5ml，采用3倍量乙腈沉淀蛋白，取上清液100l进样，则规定血浆中环丙沙星浓度在50ng/ml以上，当Cmax在2g/ml以上(口服500mg)时基本可满足生物等效性研究规定,荧光敏捷度0.1ng，能满足本试验规定,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,58,58,二、分析措施设计（续）,3样品制备措施,初步确定采用简便、迅速的乙腈沉淀蛋白后取上清液直接进样分析,预试含75%乙腈的提取液100l进样后，色谱峰理论板数、对称性下降(前沿峰)，进而导致检测敏捷度减少(峰高减少),经深入试验，确定为：,血浆0.5ml乙腈1ml沉淀蛋白二氯甲烷-异丙醇(95:5)5ml萃取 60氮气流吹干流动相200l溶解20l进样,敏捷度可达2ng/ml(血浆浓度)，符合规定(Cmax2g/ml),第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,59,59,三、试验方案,1给药方案,20名受试者随机分为两组，每组10人,第1次试验第一组口服受试制剂(相称于环丙沙星500mg)，第二组口服相似剂量的参比制剂,第2次试验第1次服药后第7天开始，两组互换给药,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,60,60,三、试验方案（续）,2血样的采集与处理,分别口服给药前和给药后0.25、0.5、1.0、1.5(tmax)、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0和24.0(57个t1/2)小时,由肘正中静脉取血 4 ml,立即移入经肝素处理的离心试管中，静置5分钟后，离心15分钟(3000rpm)，分离血浆,-20冰箱中保留待测,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,61,61,三、试验方案（续）,3血样分析法,色谱条件,高效液相色谱仪(包括LC-10AT,vp,泵，RF-530荧光检测器)；色谱柱为Kromasil ODS-AP(200mm4.6 mm，5,m),流动相为乙腈-0.025mol/L磷酸溶液(86,:,14)，流速1.0ml/min,检测波长为,ex,=277nm，,em,=445nm,柱温为40。,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,62,62,三、试验方案（续）,3血样分析法,血浆样品的预处理,取血浆0.5ml，加内标溶液(10,g/ml诺氟沙星甲醇溶液）50,l、乙腈1.0ml，涡旋混合30s，离心5min，取上清液1ml，加二氯甲烷-异丙醇(95,:,5)混合溶剂5ml，涡旋振荡1min，离心5min，弃去上层水相，吸取下层有机相，60下氮气流吹干，残渣加流动相200,l，涡旋溶解30s，离心5min，取上清液20,l进样,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,63,63,四、分析措施验证,1措施特异性,环丙沙星峰tR=12.4min，诺氟沙星(内标物质)tR=10.9min，各峰均获得完全分离，内源性物质峰(与空白血浆样品一致)tR=8.6min对测定无干扰,志愿者用药后的血浆样品色谱图中环丙沙星与内标物质峰与模拟血浆样品中环丙沙星与内标物质峰的tR、T、n和R均一致，峰形相似。故不认为代谢物有干扰,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,64,64,四、分析措施验证(续),2原则曲线,原则系列溶液取盐酸环丙沙星，加水制成1、2、5、10、20和50g/ml的原则系列溶液，冰箱保留,原则系列模拟血浆样品取空白血浆0.5ml，加环丙沙星原则系列溶液各50l，配制成相称于浓度为0.1，0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 g/ml的QC样品，冰冻(-20),测定法取QC样品，照“血浆样品的预处理”项下措施操作，以环丙沙星浓度C为横坐标，环丙沙星与内标物质的峰面积比值Y为纵坐标，用加权最小二乘法经Excel运算，求得的直线回归方程为：Y=1.33C-0.02583，R2=0.9951(C=0.15.0 g/ml),第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,2026/9/26,65,65,四、分析措施验证(续),3措施精密度与精确度,QC样品 浓度为 0.1、0.5 和 2.0 g/ml,分析批次3批，每批 5 样品,测得浓度0.0988、0.4537 和 2.128 g/ml,精确度,RE(%)-1.2%、-9.3%和 6.4%,精密度,批内(%)6.7%、4.6%和 3.9%,批间(%)8.9%、9.6%和 12.3%,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,表4-2 血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果,分析批次,加入量（ng/ml）,100.0,500.0,2000,1,100.8,457.1,2179.6,95.7,451.0,2212.1,105.4,438.0,2084.9,105.1,447.1,2129.3,104.3,449.0,2190.1,106.4,469.4,2135.2,2,96.9,465.7,2168.1,98.5,497.9,2192.6,95.7,468.1,2207.1,105.9,487.8,2251.3,95.8,456.8,2252.2,86.3,456.8,2240.9,3,97.6,450.7,1911.6,103.8,446.9,1993.0,99.5,436.6,2115.7,105.3,427.5,1990.5,82.4,416.2,1847.1,93.7,443.7,2203.6,N,18,18,18,（ng/ml）,98.8,453.7,2128.0,SD,6.8,19.7,118.7,RE,（%）,-1.2,-9.3,6.4,批内,RSD,（%）,6.7,4.6,3.9,批间,RSD,（%）,8.9,9.6,12.3,表4-2 血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果,分析批次,加入量（ng/ml）,100.0,500.0,2000,1,100.8,457.1,2179.6,95.7,451.0,2212.1,105.4,438.0,2084.9,105.1,447.1,2129.3,104.3,449.0,2190.1,106.4,469.4,2135.2,2,96.9,465.7,2168.1,98.5,497.9,2192.6,95.7,468.1,2207.1,105.9,487.8,2251.3,95.8,456.8,2252.2,86.3,456.8,2240.9,3,97.6,450.7,1911.6,103.8,446.9,1993.0,99.5,436.6,2115.7,105.3,427.5,1990.5,82.4,416.2,1847.1,93.7,443.7,2203.6,N,18,18,18,（ng/ml）,98.8,453.7,2128.0,SD,6.8,19.7,118.7,RE,（%）,-1.2,-9.3,6.4,批内,RSD,（%）,6.7,4.6,3.9,批间,RSD,（%）,8.9,9.6,12.3,2026/9/26,66,66,四、分析措施验证(续),4措施定量限,受试制剂和参比制剂的Cmax分别为,3.2020.496和3.3000.730 g/ml,措施的LOQ为0.1 g/ml 0.16 g/ml(Cmax的1/20),精确度和精密度均符合规定：RE为-1.2%,日内RSD为 6.7%,日间RSD为 8.9%,第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,表4-2 血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果,分析批次,加入量（ng/ml）,100.0,500.0,2000,1,100.8,457.1,2179.6,95.7,451.0,2212.1,105.4,438.0,2084.9,105.1,447.1,2129.3,104.3,449.0,2190.1,106.4,469.4,2135.2,2,96.9,465.7,2168.1,98.5,497.9,2192.6,95.7,468.1,2207.1,105.9,487.8,2251.3,95.8,456.8,2252.2,86.3,456.8,2240.9,3,97.6,450.7,1911.6,103.8,446.9,1993.0,99.5,436.6,2115.7,105.3,427.5,1990.5,82.4,416.2,1847.1,93.7,443.7,2203.6,N,18,18,18,（ng/ml）,98.8,453.7,2128.0,SD,6.8,19.7,118.7,RE,（%）,-1.2,-9.3,6.4,批内,RSD,（%）,6.7,4.6,3.9,批间,RSD,（%）,8.9,9.6,12.3,表4-2 血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果,分析批次,加入量（ng/ml）,100.0,500.0,2000,1,100.8,457.1,2179.6,95.7,451.0,2212.1,105.4,438.0,2084.9,105.1,447.1,2129.3,104.3,449.0,2190.1,106.4,469.4,2135.2,2,96.9,465.7,2168.1,98.5,497.9,2192.6,95.7,468.1,2207.1,105.9,487.8,2251.3,95.8,456.8,2252.2,86.3,456.8,2240.9,3,97.6,450.7,1911.6,103.8,446.9,1993.0,99.5,436.6,2115.7,105.3,427.5,1990.5,82.4,416.2,1847.1,93.7,443.7,2203.6,N,18,18,18,（ng/ml）,98.8,453.7,2128.0,SD,6.8,19.7,118.7,RE,（%）,-1.2,-9.3,6.4,批内,RSD,（%）,6.7,4.6,3.9,批间,RSD,（%）,8.9,9.6,12.3,2026/9/26,67,67,四、分析措施验证(续),第四章 分析措施的建立与验证,第三节 分析措施的验证与规定,表4-2 血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果,分析批次,加入量（ng/ml）,100.0,500.0,2000,1,100.8,457.1,2179.6,95.7,451.0,2212.1,105.4,438.0,208