β地中海贫血基因检测荧光PCR熔解曲线法下午.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,地中海贫血是指,链的合成受部分或完全抑制的一组血红蛋白病。因本病多为点突变，故常用荧光,PCR,熔解曲线法确定突变类型。我国各民族的,地贫基因突变情况有一定差异，南方汉族的突变基因以,CD41-42(-TCTT),、,CDL7(AT),、,IVS-654(CT),和,TATAbox-28(AG),为主，占,85%,90%,。,1.,掌握,PCR,技术原理及方法，熟悉其注意事项,2.,掌握荧光,PCR,熔解曲线法原理及方法，熟悉其应用,【,目的,】,PCR,技术，即聚合酶链反应（,polymerase chain reaction,，,PCR,）是由美国,PE Cetus,公司的,Kary Mullis,在,1983,年（,1993,年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的,DNA,片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单 一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是,DNA,分析最常用的技术，而且在,DNA,重组与表达、基 因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。,【,原理,】,PCR,技术原理,该技术是在模板,DNA,、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于,DNA,聚合酶的酶促合成反应。,DNA,聚合酶以单链,DNA,为模板，借助一小段双链,DNA,来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链,DNA,模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，,DNA,聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物,3-OH,末端，并以此为起始点，沿模板,53,方向延伸，合成一条新的,DNA,互补链。而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需,2,4,分钟，,2,3,小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,模板,DNA(,待扩增,DNA),引物,4,种脱氧核苷酸,(dNTPs),DNA,聚合酶,适宜的缓冲液,PCR,反应的基本成分包括：,PCR,由变性,-,退火,-,延伸三个基本反应步骤构成：,模板,DNA,的高温变性：,93,双链,DNA,解离成为单链,模板,DNA,与引物的低温退火,(,复性,),：引物与模板,DNA,单链的互补序列配对结合,引物的适温延伸：合成一条新的与模板,DNA,链互补链,每完成一个循环需,2,4,分钟，,2,3,小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,在,连续加热使,DNA,变性的过程中以温度对,DNA,溶液的,A,260,值作图，可得一条“,S”,形曲线，称为解链曲线,（熔解曲线）,。,解链曲线（熔解曲线）：,DNA,解链曲线中吸光度值达到最大吸光度值的,50%,时的温度称为解链温度，也称为融解温度。此时,DNA,分子中,50%,的双链被解开。,解链温度（,Tm,）：,荧光,PCR,熔解曲线法原理,荧光,PCR,熔解曲线法原理,野生型与突变型,DNA,的碱基组成不同，因此他们的,Tm,值和熔解曲线不同，通过比较野生型与突变型,DNA,的,Tm,值和熔解曲线，并与标准,Tm,值对照，可以确定,-,基因突变型。,【,操作步骤,】,1.DNA,获取（已准备好了）,2.PCR,扩增：,反应液,A,管（做好记号）,5000rpm,，,2,秒,加入,5ul DNA,溶液,总体积,25,微升,反应液,B,管（做好记号）,5000rpm,，,2,秒,加入,2.5ul DNA,溶液,总体积,25,微升,PCR,扩增条件,50,，,2min,95,，,10min,95,，,15s,55,，,15s,76,，,20s,55cycles,3.,熔解曲线分析：,95,，,1min,35,，,3min,40-80,（,0.4,/5s,）升温,4.,检查结果的判断：,