微生物生长和环境.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,微生物生长和环境,微生物生长和环境微生物生长和环境一、获得纯培养的方法 在自然界总是混杂地生活，要想研究某一种微生物，必须把研究对象从混杂群体中分离出来。在实验条件下，从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养,通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；,一、获得纯培养的方法,在自然界总是混杂地生活，要想研究某一种微生物，必须把研究对象从混杂群体中分离出来。在实验条件下，从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养,一、获得纯培养的方法,稀释分离法,1.,稀释平皿分离法,2.,平皿划线分离法,单细胞挑取法,纯培养分离中选择性培养基的利用,富集培养的利用,1、稀释平皿分离法,由一个或少数几个细菌在固体培养基上形成的肉眼可见的集落,菌落,涂布平皿法,倾注平皿法,2、平皿划线分离法,分区划线法,连续划线法,划线分离,3、选择性培养基的利用,不同菌对营养的要求,分离真菌，用马丁氏培养基，pH偏酸,分离放线菌，用高氏1号，pH中性偏碱,不同菌对化学试剂的敏感性,分离放线菌，培养基中加10%酚，抑制细菌、真菌,从土壤中分离真菌，加孟加拉红，抑制细菌生长,根据分离对象的代谢特征：,分离能发酵纤维素的菌株，培养基以纤维素为唯一碳源；分离固氮菌，用无氮培养基,根据所要分离的菌种特性选用培养基，如：,4、富集培养,对自然界中很少的或难以获得的微生物用富集培养基使其在数量上占优势，再做平板分离获得纯培养,二、细菌群体生长的测定,细菌的生长和繁殖难以分开，因此，常以群体生长作为细菌生长的指标,细菌群体生长测定一般采用,细胞数量,和,生物量,两种方法,（一）细胞数量的测定,细胞总数的测定（包括活的和已丧失活力的细菌）,1、,显微直接计数法,2、,比浊法,3、,染色涂片计数法,1、,显微直接计数法,2、,比浊法,比浊法的原理是利用细菌细胞在溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中测定时所吸收的光线越多,3、,染色涂片计数法,取,0.01ml,的菌悬液放在,1cm,2,的玻片上，让其干燥，然后固定染色，再置显微镜下计数每一视野中的菌数，算出视野面积，按下列公式即可求出每,ml,原菌液中的含菌数。,每,ml,原菌液中的含菌数,=,视野中的平均菌数,1cm,2,/,视野面积,100,稀释倍数,活菌数量的测定,1、稀释平板测数法,2、最大概率法（MPN法）,3、浓缩法,1、稀释平板测数法,2、最大概率法,方法是：将待测菌液于液体中作十倍系列稀释，每稀释度做35个重复，经培养后，检查细菌的生长，以有细菌生长的最后三个稀释度的管数作数量指标，由数理统计表查出近似值，再乘以数量指标第一位的稀释倍数，即为原菌液中的菌数。,例如：某细菌在稀释培养法中生长情况如下：,稀释度：10,3,，10,4,，10,5,，10,6,，10,7,，10,8,重复数：5 5 5 5 5 5,有菌生长管数：5 5 5 4 1 0,根据上述结果，数量指标为“541”，查表得近似值为17，乘以第一位数的稀释倍数，得出原始培养物的活菌数=1710,5,个,3、,薄膜过滤计数法,此法用于计数空气中的含菌数,测定细胞干重法,单位体积培养物中细胞物质的干重,含氮量测定法,微生物细胞中蛋白质的含量是比较稳定的，测出微生物细胞中的含,N,量后再换算出蛋白质的含量，,可用凯氏定N法,。,蛋白质的含量,=,氮量,6.25,DNA含量的测定,ATP含量的测定,代谢活性法,（二）细胞生物量的测定,7.2 细菌群体的生长,批量培养是实验室常采用的方法，即细菌在一定体积的培养基中生长，经历了消长的生活周期,以少量的纯培养细菌接种有限的液体培养基，并在培养过程中定时取样测数，可以发现细菌群体的生长有一定的规律。若以时间为横坐标，以活菌数的对数为纵坐标，可以绘出一条类似于S形的曲线，该曲线称为细菌纯培养的生长曲线,菌数的对数,细菌纯培养的生长曲线,延缓期,对数期,稳定期,衰亡期,Growth Cycle of Populations,一个典型的生长曲线分为延缓期，对数期，稳定期和衰亡期四个时期,在这个时期内,菌体体积增长较快,如巨大芽孢杆菌可以从3.4m增长到9.119.8m。细胞内原生质比较均匀一致，贮藏物质消耗，DNA含量提高，产生各种诱导酶，,在这个时期的后阶段，菌体细胞逐步进入生理活跃期，少量菌体开始分裂，曲线稍有上升。,滞留期的长短，因菌种和培养条件不同而异，几分钟到几小时不等。不同微生物的适应期不同,延缓期,在该时期，细胞代谢活性最强，细胞的数量呈几何级数上升，生长曲线表现为一条上升的直线,对数期,细菌在对数期每分裂一次所需要的时间称为世代时间，简称代时，用,G,表示,N,t,=N,0,2,n,（,N,t,=,对数期,t,时,细菌数,；,N,0,=,对数期开始细胞数；,n=,繁殖世代数,.,）,n=(log,N,t,log N,0,)/log 2,=3.3(log,N,t,log N,0,),G=t/n=t/3.3(log,N,t,log N,0,),=0.301 t/(log,N,t,log N,0,),代时的计算,在衰亡期，有的细胞开始自溶，产生或释放出一些产物，如aa、抗生素、转化酶、短肽酶等。菌体形状呈多形态，大小不一，甚至畸形，细胞质内多液泡，有些G,+,变为G,。,稳定生长期,特点：细菌分裂间隔时间延长，曲线上升缓慢，随后新生细胞与死亡细胞的速率处于动态平衡，菌数达到最高水平，随后细胞死亡速度超过新生速度，曲线开始下降,衰亡期,7.3,真菌的生长,丝状真菌在固体培养基上的生长,常以菌丝长度、菌落直径或面积来表示,真菌在液体培养基中的生长,以时间为横坐标，菌体干重为纵坐标，可绘出与细菌相似的曲线，区分为三个不同的生长阶段：延滞期、迅速生长期和衰退期,丝状菌的生长繁殖,1、菌丝断裂繁殖,2、无性孢子繁殖,3、有性孢子繁殖,真菌的有性生殖包括质配核配减数分裂真菌的有性孢子有卵孢子、接合孢子、子囊孢子和担孢子,酵母菌的生长繁殖,酵母菌的繁殖方式多种多样，主要的方式归结为：,无性繁殖,裂殖,（,fission,）：少数酵母菌的繁殖方式,芽殖,（,budding,）：多数酵母菌的繁殖方式,有性繁殖：,产生无性孢子,：掷孢子（掷孢酵母属）,节孢子（地）,厚垣孢子（白假丝酵母）,形成子囊孢子,（,ascospore,）：酿酒酵母,7.4 二次生长、同步生长,在培养基中存在两种能为微生物利用的主要营养物时，微生物将首先利用其中较易利用的营养物开始生长，进入稳定期后经过短暂的适应后将利用第二种营养物再次开始新的对数生长并进入新的稳定期，表现为二阶式的双峰生长曲线,采用物理或化学的方法使培养微生物的生长处于相同的生长阶段并保持同时分裂的生长方式称为同步生长,用同步培养法获得的培养物叫同步培养物。同步培养法有如下几种：,利用代谢抑制剂控制DNA合成,Ecoli胸腺嘧啶缺陷型菌株，停止胸腺,嘧啶供给，DNA不合成，但蛋白质合成，,30分钟后加入胸腺嘧啶，DNA合成恢复，,细胞分裂。,选择法,诱导法,离心沉降法,过滤分离法,硝酸纤维薄膜法,将不同大小细胞分开培养,温度调整法,沙门氏菌25只合成细胞,物质，37细胞进行分裂,7.5 连续培养,在一个恒定容积的流动系统中，一方面以一定的速度不断地加入新的培养基，另一方面以相同的速度流出培养物，这样可以使容器中微生物的数量和营养状态保持恒定，使微生物长期处于旺盛生长阶段,连续培养的方法有两类：,恒浊,连续培养,恒化,连续培养,恒浊,连续培养,通过光电装置自动测定并籍以调节加入培养基的流速来保持培养物浊度，即菌数恒定的方法,恒化,连续培养,通过控制培养液的流速来保持培养物的恒定生长速度和养料成分的培养方法,在培养需要一种低浓度的限制营养因子，通过调节其浓度的方法来获得具有不同生长速度的培养物，常用于模拟和研究微生物在自然状态养料稀薄下的生长规律,分批培养中限制性营养物与生长速率（实线）、生长量（虚线）之间的关系；限制性营养物在低浓度时对微生物的生长带来影响,稀释率由流速和培养器容量决定，因此，用1000ml 的容器，流速控制在500ml/hr，稀释率则为0.5hr-1,稀释度过高时，由于培养物被冲走，生长不能维持在平衡态,恒化培养中稀释率、与细胞浓度限制性养料的关系.,7.6 环境对微生物生长的影响,微生物的生活条件是环境因素的综合，只有各种因素配合适当时，微生物才能旺盛的生长发育，影响微生物生长的因子有：,温度,水分和渗透压,pH,值,氧气和,Eh,值,光线、射线、超声波,化学药剂,一、温度对微生物生长的影响,不同的微生物以及同一种微生物在生长发育的不同阶段，对温度的要求不一样。,根据微生物所适应的最适生长温度通常把微生物分为高温型、中温型和低温型,同一种微生物在生长发育的不同阶段，对温度的要求不一样。如：,青霉素产生菌菌体的最适生长温度为,30,度，而产生青霉素的最适温度为,23,度,黑曲霉菌体的最适生长温度为,37,度，而产酶的最适温度为,28,度,食用菌菌丝的生长温度为,25,度，子实体分化温度则多在,18,度左右,灰色链霉菌的菌体最适生长温度为,37,度，而产生链霉素的最适生长温度为,28,度,不同的微生物对高温的敏感性不同：,多数细菌，酵母，霉菌的营养细胞和病毒：5065 10分,钟可致死,放线菌，霉菌的孢子比较耐热 7680 10分钟致死,细菌的芽孢有抗热性，致死温度和时间视菌而定：,炭疽芽孢杆菌 105 510分钟致死,枯草芽孢杆菌 100 617分钟致死,肉毒梭菌 120121 10分钟致死,高温对微生物生长的影响,同一个菌的不同菌龄其抗热性也不相同，一般幼龄菌比老龄菌对温度敏感,高温能杀死微生物，因此在微生物方法中常采用加热培养器皿和培养基方法灭菌,灼烧灭菌,干热灭菌,：用干热空气灭菌，,160170度/2小时,湿热灭菌,：用蒸汽灭菌，分为：,高压蒸汽灭菌：,121,度,/30,分钟,间歇灭菌：,100,度,/2,小时连续三天,巴氏灭菌：,62,63,度,/30,分钟或者,71,度,/15,分钟,高温灭菌分为：,湿热灭菌的工艺指标比干热灭菌的工艺指标低是因为：,蒸汽穿透力强，蛋白质有水时变性温度低，蒸汽有潜热,微生物的,致死温度,：在一定时间内（如10分钟）杀死微生物所需要的最低温度称为微生物的致死温度,微生物的,致死时间,：在一定温度下，杀死微生物所需要的时间；温度越高，致死时间越短,D值：在特定温度下使微生物菌数减少10倍所需的时间,灭菌：,杀死所有微生物的方法，包括细菌的芽胞,消毒:,杀死微生物的营养体，而不能杀死芽胞的方法,防腐：,抑制微生物的生长，但并不杀死微生物的方法,化疗：杀死寄主内的病原菌的方法,低温对微生物的影响,在低温下，微生物的代谢活动降低，但原生质结构并不破坏，当提高温度后仍可恢复其正常生命活动；低于冰点的温度可使微生物死亡，主要是由于细胞中的水转变为冰晶，造成细胞的机械损伤和脱水。,所以人们常用低温来保藏菌种，并用低温保藏食品不被微生物腐败,二、水份和渗透压,1、水份与干燥,水是微生物生活的必要条件，微生物生长所需要的水份用水活度来表示，即在一定的温度和压力条件下，溶液中的蒸汽压与纯水蒸汽压之比,a,w,=P,solution,/P,water,微生物生长的最低aw值：,细菌,aw,酵母,霉菌,耐盐细菌和耐旱真菌,大部分的细菌，藻类和一些真菌，如毛霉，根霉，担子菌类为,0.9,0.99,嗜盐细菌、曲霉,为,0.76,地衣和丝状真菌及一些酵母种类为,0.60,微生物生长的,aw,值在,0.660.99之间,2.,渗透压,一般微生物生长所适应的溶液渗透压在36大气压之间,微生物在等渗溶液中生长时，维持细胞形态不变（0.850.9%NaCl溶液）,微生物在高渗溶液中生长时，会出现质壁分离现象，严重时会引起细胞死亡；日常生活中常用高渗溶液（1015的盐浓度和5070%的糖浓度）来保藏食品,微生物在低渗溶液中生长时，细胞会吸水膨胀，至破裂死亡,三、氢离子浓度（pH值）,几乎所有的微生物在pH4.09.0之间都可以生长，但不同的微生物都有其最适的生长pH值范围,细菌、藻类、原生动物最适pH6.57.5，但pH4.010.0,也可以生长，特殊的硫化菌在,pH1.2.0下生长，硝化菌在pH11生长,放线菌最适pH7.58.0，pH5.010也可生长,霉菌、酵母最适pH5.06.0，pH1.510都可生长,pH值影响微生物生长的主要作用在于：,引起细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物质的吸收。,影响代谢过程中酶的活性。,改变生长环境中营养物质的可给性以及有害物质的毒性。,另一方面，微生物代谢活动常改变氢离子浓度,如：乳酸菌分解葡萄糖产生乳酸，,pH,值下降，基质被酸化。尿素细菌分解尿素产氨使,pH,上升。,为了防止基质中的,pH,值发生过大的变化影响微生物生长，在配制培养基时通常加入缓冲剂,黑曲霉在pH 23的环境中发酵蔗糖以产柠檬酸为主，产草酸极少。,在pH近中性时发酵蔗糖产生大量的草酸，柠檬酸产量很低,酵母菌在pH4.55.0生长进行乙醇发酵，不产甘油和醋酸,在pH8时生长发酵产物除乙醇外，还有甘油和醋酸。,在生产实践中还可利用pH值防止杂菌生长。,如生产面包时加丙酸钙作防腐剂，抑制细菌生长,微生物生长繁殖的最适,pH,与其合成某种代谢产物的,pH,通常是不一样的。,例如：丙酮丁醇梭菌生长繁殖最适pH是5.57.0,丙酮 丁醇梭菌合成丙酮丁醇的最适pH是4.35.3,微生物在不同的,pH,下积累的代谢产物不一样，如：,四、氧气和氧化还原电位,氧气与微生物的生长,根据微生物与氧的关系，将微生物分成四类：,（1）专性好氧微生物,（2）专性厌氧微生物,（3）兼性好氧微生物,（4）微需氧微生物,好氧微生物要求,Eh,值在,0.1,伏以上，以,0.3,0.4,为宜,兼性好氧微生物,Eh,值在,0.1,伏以上好氧性呼吸，,Eh,值在,0.1,伏以下，厌氧性呼吸,专性厌氧微生物,Eh,值在,0.1,伏以下为宜,微需氧微生物,Eh,值在,0.1,和,0.1,伏之间,氧化还原电位（Eh）,培养基中的溶氧和氧化还原态物质影响培养基的Eh值,不同的微生物对氧化还原电位的要求不一样,五、光、辐射和超声波,光并不是所有微生物都需要的，只有光能营养型的微生物才需要光，光能营养菌吸收400800nm可见光进行光合作用。,有的微生物不是光合微生物，但对光有趋光性，如闪光须霉。药用真菌灵芝形成子实体也需要散射光的照射。,日光中的,紫外线,对微生物有杀伤作用，UV的波长在136400nm之间，以波长为,265266nm,的杀菌力最强,UV的杀菌作用主要是由于UV引起核酸形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰了核酸的复制，另外UV使O,2,O,3,（臭氧），O,3,放出氧化能力强的新生态氧O，O也有杀菌作用,X射线波长为0.0613.6nm,射线波长为0.010.14nm,均为高能电磁波，对微生物有显,著的杀菌作用，常用作罐头灭菌,超声波频率在2万赫兹以上，其作用是使细胞破裂，引起M死亡,超声波,紫外线,六、化学杀菌剂和抑菌剂,重金属离子带正电荷，易与带负电荷的菌体蛋白质结合，使蛋白质变性，有较强的杀菌作用,升汞（HgCl,2,）：0.050.1%用于非金属器皿的消毒,红汞：2%水溶液用于皮肤，粘膜及小伤口的消毒,硫柳汞：0.01-0.1%用于皮肤及手术部位的消毒,生物制品防腐。,铜盐：波多液含CuSO,4,用来杀真菌，防治植物病害,1.重金属盐：,高锰酸钾，H,2,O,2,，过氧乙酸等能使菌体酶蛋白中的SH氧化成SS，使酶失活,高锰酸钾,：0.1%用于皮肤，尿道及蔬菜，水果消毒。,H,2,O,2,：,13%用于表面消毒如伤口消毒。,过氧乙酸,：0.20.5%用于皮肤、塑料、玻璃、人造纤维消毒,2RSH+2X RSSR+2XH,2、氧化剂：,3.卤素化合物,：,以Cl，I为常用，例如用作饮水消毒的漂白粉为次亚氯酸盐，主要成份是CaCl,2,Ca(OH),2,及Ca(Ocl),2,，次亚氯酸盐分解放出新生态氧，具有强烈的氧化作用而杀菌,漂白粉：1020%用于地面和厕所消毒,0.51%的上清液用于空气及物体表面消毒，亦可作饮 水消毒剂,Cl,2,：0.20.5ppm可作饮水及游泳池水消毒剂,I,2,：2.5%的碘酒用于皮肤消毒,4.表面活性剂：,具有降低表面张力效应的物质叫做表面活性剂，如新洁尔灭，在较低浓度有抑菌作用，在较高浓度有杀菌作用。,新洁尔灭：,0.05,0.1%,用于皮肤，粘膜及外科手术器械浸泡消毒,5.有机化合物：,酚、醇、醛是常用的杀菌剂，它们能损伤细胞膜和壁，抑制某些酶系统，（如脱H酶和氧化酶），并能使蛋白质变性,酚（石炭酸）：35%用于桌面，地面及玻璃器皿的消毒，0.51%用于皮肤消毒。,煤酚皂：2%用于皮肤消毒，35%亦可用于桌面，地面和器皿消毒。,乙醇：7075%用于皮肤及器械消毒。,甲醛：2%的福尔马林用于浸泡器械及物品表面消毒。10%的甲醛溶液重蒸可消毒无菌室及病房。也可用36%的甲醛溶液6ml/米,3,+高锰酸钾适量产气熏蒸。,6.染料：,碱性染料有显著的抑菌作用，该类染料的阳离子与菌体的羧基或磷酸基作用，形成弱电离的化合物，防碍菌体的正常代谢，扰乱菌体的氧化还原作用，并阻碍芽孢的形成。,结晶紫：1/10万的浓度在根瘤菌培养中可抑制G,+,菌的生长。,孔雀绿：1/10万可抑制金黄色葡萄球菌生长，,1/3万抑制E.coli生长,龙胆紫：24%用于皮肤和伤口消毒,。,化学治疗剂,磺胺,磺胺可阻止叶酸的合成。由于磺胺与细菌生长所必须的对氨基苯甲酸（,PABA,）的结构非常相似，在一定条件下它们竟争性的与二氢叶酸合成酶结合，阻止或取代了,PABA,进入叶酸分子中，从而阻止了叶酸的合成。,人类不需要自身合成叶酸，故磺胺对人无毒,抗生素,A抑制细胞壁的形成,青霉素抑制细菌是因为其结构中的内酰胺结构与胞壁酸中短肽末端的D丙aa结构很相似，能占据D丙氨酸的位置与转肽E结合，将E灭活，使侧肽链无法连接，因而抑制了细胞壁的合成,多粘菌素，短杆菌肽是多肽类抗菌素，它们引起细菌细胞膜损伤，导致细胞质外漏，致使菌体死亡。,制霉菌素、两性霉素是多烯类抗生素，它们能与真菌细胞膜中的固醇结合，从而破坏膜结构，使细胞物质外漏，使真菌菌体死亡，但对细菌无效（因其壁中无固醇）,B.影响细胞膜的功能,卡那霉素、链霉素、春霉霉素作用于蛋白质合成场所核糖体的30S亚基；氯霉素、红霉素、林可霉素等，则作用于核糖体50S亚基，抑制了核糖体的活性。,C.干扰蛋白质合成,谢谢,谢谢！,