第13章--生物合成核酸类药物.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第13章 生物合成核酸类药物,第13章 生物合成核酸类药物第13章 生物合成核酸类药物核酸类物质药物一般可分为两大类：,一类具天然结构的核酸类物质，,另一类是自然结构碱基、核苷、核苷酸的结构类似物或聚合物。,第一页，共35页。,核酸类物质药物一般可分为两大类：,一类具天然结构的核酸类物质，,另一类是自然结构碱基、核苷、核苷酸的结构类似物或聚合物。,第二页，共35页。,前者是生物体合成原料或蛋白质、脂肪、糖生物合成与降解以及能量代谢的辅酶，,这一类药物有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，促使缺氧组织恢复正常生理机能，,临床上已广泛使用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病、肌肉萎缩等病症的治疗，,包括肌苷、辅酶A、GTP、CTP、UTP、ATP、腺苷、辅酶I、辅酶等，,多数是生物体自身能够合成的物质，具有一定临床功能，毒副作用小，基本都可经微生物发酵或从生物资源中提取。,第三页，共35页。,后一类药物是治疗病毒感染性疾病、肿瘤的重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物。,正式用于临床的抗病毒核苷类药物有三氮唑核苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷等。,第四页，共35页。,核酸类物质生产方法有化学合成法、酶解法和发酵法三种。,化学合成法,生产，工艺比较复杂，设备条件要求较高；,酶解法,受到酶源及原材料的局限,；,发酵法,以糖质原料生产核苷酸类物质，符合食用习惯，生产成本低、效益高，特别是目前基因工程育种技术及高产优化控制技术的采用，使发酵法生产成本大大降低，优势更为明显。,第五页，共35页。,主要核酸类发酵产物及其应用,第六页，共35页。,13.1 肌苷的发酵法生产,1概述,肌苷是近年来生产发展较快的一种生化药品，对不同类型的心脏病及肝脏病都有较好疗效，并具有无毒、无副作用的特点。,另外，它还是唯一能代替人体内辅酶A功能的药物。,肌苷经磷酸酯化后生成5-肌苷酸，用作鲜味剂的前体物质。,主要生产国是日本，试验室产量已达80 g/L以上，我国实验室产量30 g/L左右，生产水平在20g/L左右。,第七页，共35页。,肌苷化学名是次黄嘌呤核苷，是次黄嘌呤和核糖的缩合物，其磷酸酯为肌苷酸。,在次黄嘌呤核苷中，核糖连在N-9位置上，以糖苷键的形式连接在以呋喃形式存在的核糖第一位碳原子上，分子式为C,10,H,12,N,4,O,5,，相对分子质量为268.23。,肌苷为白色结晶或呈无水粉末状，无嗅，味微苦，熔点约为218，易溶于水，pH近中性。,在饱和水溶液中约含肌苷15g/L，在稀盐酸或氢氧化钠溶液中易溶，在氯仿、乙醇中不溶。,第八页，共35页。,肌苷的结构式,第九页，共35页。,2生产菌种,主要为细菌，如枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产氨短杆菌、谷氨酸棒杆菌、谷氨酸小球菌、节杆菌、铜绿色假单胞菌、大肠杆菌等。,此外，一些酵母和霉菌也可产生肌苷。,第十页，共35页。,3培养基,斜面培养基：,葡萄糖1.0、牛肉膏1.4、蛋白胨1.0、酵母膏1.0、氯化钠0.5，pH7.07.2。,种子培养基：,葡萄糖1.0、酵母膏1.5%、蛋白胨1.0、玉米浆0.5、氯化钠0.5，pH7.07.2。,发酵培养基：,葡萄糖12、酵母粉1.4、硫酸铵1.3、玉米浆0.5、尿素0.2%、氯化钾0.6%、磷酸氢二钠0.5、硫酸镁0.22、碳酸钙2.0、pH 7.07.2。,灭菌条件：,斜面培养基0.1 MPa，20min，种子培养基及发酵培养基0.08MPa，15min。,第十一页，共35页。,4生产工艺,第十二页，共35页。,5发酵控制,碳源大多使用葡萄糖，在发酵生产中也可利用淀粉水解液。,常用氮源有氯化铵、硫酸铵或尿素等。,因肌苷的合氮量很高(20.9)，所以须供应足够的氮源，工业发酵常用氨水来调节pH，这样既可以供氮源，又可调节发酵液的pH。,第十三页，共35页。,磷酸盐对肌苷生成有很大影响。,采用短小芽孢杆菌的腺嘌呤缺陷型发酵时，可溶性磷酸盐如磷酸钾显著抑制肌苷累积，不溶性磷酸盐如磷酸钙可促进肌苷的生成。,采用产氨短杆菌变异株时，肌苷发酵不需要维持低水平无机磷，即使添加2磷酸盐，也能累积大量肌苷。,第十四页，共35页。,肌苷生产菌株一般为腺嘌呤缺陷型菌株，培养基中须加入适量腺嘌呤，如酵母膏等。,由于腺嘌呤是肌苷酸的前体，而腺苷酸又是控制IMP生物合成的主要因子，所以加入腺嘌呤的多少，不仅影响菌体的生长，更影响肌苷积累。,腺嘌呤对肌苷积累最适浓度比菌体生长所需要的最适浓度小一些，称为亚适量。,第十五页，共35页。,氨基酸促进肌苷积累、节约腺嘌呤用量。,其中组氨酸是必需的，异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸等8种氨基酸也有促进作用。,除组氨酸外的其他8种氨基酸可以用高浓度的苯丙氨酸一种来代替。,氨基酸可通过促进菌体生长使肌苷产量增加。,第十六页，共35页。,发酵条件，如pH值、温度、通气搅拌等都是影响肌苷积累的重要因素。,肌苷积累的最适pH值为6.06.2；,最适温度对枯草杆菌为30，对短小芽孢杆菌为32；,供氧不足可使肌苷生成受到显著的抑制，而积累一些副产物；,通气搅拌可减少CO,2,对肌苷发酵的抑制作用。,第十七页，共35页。,6肌苷的生理作用和药用价值,肌苷可直接透过细胞膜，进入人体细胞内，使处于低能缺氧状态下的细胞恢复正常水平，继续进行新陈代谢，并能活化丙酮酸氧化酶类，参与人体细胞蛋白质的合成，具有激活细胞、刺激代谢等作用。,第十八页，共35页。,当细胞内ATP含量显著或持续下降时，细胞功能低下，此时细胞进入低能状态，ATP的加入可以解除这种低能状态。,但ATP不能透过细胞膜，而肌苷对细胞有高度的渗透性，因此，肌苷是唯一代替人体增加ATP的药物。,肌苷进入细胞后生成丙酮酸，丙酮酸可转化为辅酶A和乳酸。,第十九页，共35页。,肌苷主要应用于心脏疾病、肝脏病、白细胞减少症、放射性照射病、贫血病、血吸虫病、视网膜炎、神经萎缩、毛地黄中毒等症。,肌苷可制成肌苷二醛、异丙肌，对精巢上皮瘤、麦粒细胞癌以及某些病毒性疾患都可以起缓解或抵抗作用，还可制造干扰素的诱导剂。,此外，肌苷磷酸化后生成肌苷酸，是制造强力味精的前体物质。,第二十页，共35页。,13.2 肌苷酸的生产,肌苷酸由核糖、磷酸和次黄嘌呤组成，其中磷酸结合在核酸的第5位羟基上。,肌苷酸的结构式,第二十一页，共35页。,肌苷酸为白色结晶粉末状或颗粒状，味鲜，无臭，易溶于水，在乙醇或其他有机溶剂中溶解度极小。,核苷和碱基容易透过细胞膜而核苷酸却难以透过，因此由微生物直接发酵法生产肌苷酸比较困难。,可解除微生物自身反馈调节、改变细胞膜通透性，在发酵液中积累肌苷酸。发酵法得到的是肌苷酸钠盐。,第二十二页，共35页。,1生产菌种,有短小芽孢杆菌、产氨短杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、某些链霉菌等。,肌苷酸产生菌在Mn,2+,限量(20g/L以下)的条件下，菌体会产生膨胀异常形态，积累肌苷酸，因此认为细胞膜对肌苷酸存在透过性障碍。,Mn,2+,使细胞通透性降低。,第二十三页，共35页。,2肌苷酸生物合成途径,最初起作用的酶是PRPP氨基转移酶，该酶受AMP、ATP及GMP的反馈抑制，被腺嘌呤阻遏。还有腺苷酸琥珀脱氢酶（SAMP脱氢酶）和GMP还原酶。,诱变处理可获得SAMP脱氢酶缺失的腺嘌呤缺陷型突变株和缺失XMP氨化酶的鸟嘌呤缺陷型菌株更多地积累肌苷酸。,第二十四页，共35页。,肌苷酸合成途径,第二十五页，共35页。,3肌苷酸的生产工艺,肌苷酸的生产方法,（1）将生物细胞内的呈味核苷酸用化学方法抽提和精制。,（2）从微生物（例如酵母）细胞提取核酸后，再通过有关酶系进行核酸降解。,（3）用发酵法或合成工艺制得肌苷酸的前体物质，再经微生物转化而成。,（4）选育肌苷酸高产变异菌株，直接发酵生产。,第二十六页，共35页。,一般采用方法（2）和方法（4）生产肌酸。,国外采用枯草芽孢杆菌、产氨短杆菌的营养缺陷型、抗代谢类似物、Mn,2+,不敏感抗生物素菌株，以糖类等为基质的发酵法得到稳步发展，效益显著。,工艺路线如下：,试管斜面培养,摇瓶种子培养,二级种子罐培养,三级种子罐培养,发酵,板框压滤,脱色,活性炭吸附,浓缩结晶,精制,第二十七页，共35页。,4肌苷酸的用途,肌苷酸可参与机体能量代谢以及蛋白质合成，活化丙酮酸氧化酶，能使细胞在缺氧状态下继续进行代谢。,肌苷酸的主要医用价值为白细胞或血小扳减少症、各种急慢性肝炎、肺原性心脏病、中心性视网膜炎、视神经萎缩症、放射线照射病、毛地黄中毒症以及血吸虫病等的治疗。,第二十八页，共35页。,肌苷酸更主要用途是作为助鲜剂，制成强力味精(第二代味精)和复合调味料(第三代味精)。,肌苷酸单独存在时，鲜味并不显著，但与谷氨酸钠(味精)并存时，该混合物鲜味随肌苷酸含量的增加而增强。,此外肌苷酸可提高酱油品质。,第二十九页，共35页。,13.3 鸟苷酸的生产,鸟苷酸由鸟嘌呤、核糖和磷酸三部分组成，磷酸结合在核糖的5位羟基上，又名5-单磷酸鸟苷，分子式为C,10,H,12,N,5,O,6,P。,鸟苷酸的结构式,第三十页，共35页。,鸟苷酸为白色晶体或粉末，溶于冷水中，能完全溶于碱溶液中，在冷的酸性溶液中缓慢分解。生产中多以钠盐形式出现。,鸟苷酸在菌体内的浓度超过一定限度，就会引起反馈调节，抑制鸟苷酸合成。尤其是使PRPP转酰胺酶、IMP脱氢酶及GMP合成酶等受到抑制。而且微生物中还普遍存在催化由GMP向乌鸟苷、鸟嘌呤降解的酶系。,因此必须利用相关营养缺陷型进行发酵生产。,鸟苷溶解度很低，发酵中容易析出结晶，减弱了反馈调节的效果，有可能积累鸟苷。,第三十一页，共35页。,GMP生产方法除RNA分解外，还有：,（1）生物和化学合成并用：,利用微生物发酵法生产AICAR（S），然后AICAR(S)经过有机化学合成的方法制成GMP。,（2）利用细菌发酵生产鸟苷，然后以酶法或化学合成法将鸟苷进行磷酸化，得到GMP。,（3）双菌混合发酵：,利用XMP或黄苷生产菌与能将XMP或黄苷转化为GMP的菌株混合培养法。,（4）利用直接发酵法生产GMP。,第三十二页，共35页。,目前，国内外多采用酵母提取核酸后进行酶解生产鸟苷酸。,5-鸟苷酸有助鲜作用，与适量谷氨酸钠按不同比例混合时，其鲜昧更优于5-肌苷酸。在特鲜酱油方面也重要应用。,在医疗方面，其钠盐用于治疗白细胞减少、血小板下降及肝炎等。,第三十三页，共35页。,第三十四页，共35页。,谢谢！,第三十五页，共35页。,