第4章2细胞化学染色检验血液检验.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,掌握细胞化学染色临床应用,掌握各种细胞化学染色的原理及临床意义,熟悉各种细胞化学染色结果判断及正常血细胞染色反应,了解细胞化学染色的基本步骤,要求：,一、概念,细胞化学染色是细胞学和化学相结合,而形成的一门科学。它以细胞形态学为,基础，结合运用化学反应的原理对血细,胞内的各种化学物质(酶类/脂类/糖类/铁,/蛋白质/核酸等)作定性、定位、半定量,分析的方法。,第一部分 概 述,二、必要性,从形态学观察，存在较多的主观性；,有些原始细胞形态较相似，难以鉴别；,结合细胞化学染色，提高疾病的诊断率。,三、临床应用,1.辅助判断急性白血病的细胞类型,2.辅助血液系统疾病的诊断和鉴别,诊断,3.观察疾病的疗效和预后,4.疾病发病机制的探讨,白血病的诊断：MICM分型,M：morphology I：immunology,C：cytogenitics M：molecular biology,形态学分型：进行初步的诊断,免疫学分型：明确细胞种类,细胞遗传学分型：与疾病预后有关,分子生物学分型：提高到分子水平,四、基本步骤,（1）物理法：干燥、火焰,（2）化学法：,A、蒸气固定：,B、液体固定：甲醛、乙醇、甲醇。,1.固定,（1）偶氮偶联法：酯酶染色,（2）联苯胺法：POX,（3）普鲁士蓝反应：Fe,（4）雪夫反应：PAS,（5）金属沉淀法：NAP,（6）物理显色法：SBB,2.显示：有色沉淀反应,铁染色-中性红、伊红,PAS-甲基绿,3.复染：使各种细胞能显示出来,核：中性红、甲基绿、沙黄等。,浆：伊红、刚果红、光绿等。,第二部分,具体细胞化学染色方法,铁染色(Ferric stain),骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒(外铁)和幼红细胞(内铁)中；检测采用普鲁氏蓝反应。,一、原 理,4Fe3+3K4Fe(CN)6 Fe4Fe(CN)63+12K+,含铁物质 亚铁氰化钾 亚铁氰化铁,酸性,二、结果判断,1.细胞外铁(骨髓小粒含铁血黄素),铁颗粒、铁小珠、铁团块,细胞外铁(低倍镜观察),（）：无颗粒,（）：有少量铁颗粒或偶见铁小珠,（）：有较多的铁颗粒或铁小珠,（）：有很多的铁颗粒、铁小珠,和少数铁小块,（）：有极多铁颗粒、小珠和,很多铁小块，密集成堆。,+,+,+,+,+,（1）分级(按铁颗粒数量的多少及大小),细小颗粒：细沙样铁小粒，不易看清。,粗大颗粒：很容易看清的颗粒。,（2）阳性率,观察100个中晚幼红细胞，计算出铁,粒幼红细胞的百分比。,2.细胞内铁(中晚幼红细胞，油镜观察),细胞内铁(油镜观察幼红细胞),型：12个小铁颗粒；,型：35个小铁颗粒；,型：610个小铁颗粒或14个大颗粒；,型：10个以上小铁颗粒或5个以上大颗粒。,环形铁粒幼红细胞(ringed sideroblast),幼红细胞胞质内铁颗粒6个，围绕,核周1/2以上者。,铁粒幼红细胞(sideroblast)：,胞质中出现蓝色铁颗粒的幼红细胞。,铁粒红细胞(siderocyte)：,胞质中出现蓝色铁颗粒的成熟红细胞。,绿色箭头示：环形铁粒幼红细胞；蓝色箭头示：铁粒红细胞,1.细胞外铁：（+）（+）,2.细胞内铁：铁粒幼红细胞阳性率大约,1944%，III型（I型为主），无,型、型、环形铁粒幼红细胞及铁粒,红细胞。,三、参考范围,四、临床意义,1.缺铁性贫血：,外铁（），内铁15%。,4.非缺铁性贫血：溶贫、巨幼贫、再障、,白血病等，内外铁常增多。,5.感染、肝硬化、慢性肾炎、血色病等：,外铁增多。,五、应用评价,铁染色是临床常用的一种细胞化学,染色，虽不如血浆铁蛋白敏感，但是反,映机体储存铁的金标准。,外铁：反映骨髓中铁的储存量；,内铁：反映骨髓中可利用的铁量。,中性粒细胞碱性磷酸酶染色,neutrophilic alkaline phosphatase（NAP）,-磷酸萘酚钠,-萘酚+磷酸钠,NAP,-萘酚+重氮盐,不溶性沉淀定位于胞质,Kaplow偶氮偶联法：,一、原 理,二、正常血细胞染色反应,NAP主要存在于成熟的中性粒细胞胞质中。严重的化脓性感染时，晚幼阶段粒细胞也可见有阳性反应。,其他细胞基本呈阴性反应。,三、结果判断及参考范围,1.结果判断：出现深褐色颗粒的量及密度,NAP染色反应强度标准：,（）：胞质中无颗粒；,（）：胞质含少量颗粒，约占1/4；,（）：胞质含中等量颗粒，约占1/2；（）：胞质含较多颗粒，约占3/4；（）：胞质充满颗粒，无空隙。,+,+,+,+,+,+,EOS,钙 钴 法,NAP染色结果报告包括阳性率和积分值。,阳性率：指计数100个中性成熟粒细胞，其阳性细胞的数量即为阳性率；积分值：指计数100个中性成熟粒细胞，不同阳性程度细胞数量乘以其阳性程度之和即为积分值，其计算公式为：积分值=()数量1+()数量2+()数量3+()数量4。,2.NAP染色结果报告：,3.参考范围：,中性粒细胞NAP阳性率：40%,NAP积分为：30130分,NAP染色结果既报阳性率又报积分值。,四、临床意义,1.生理性变化：应激状态、妊娠、新生儿等。,2.病理性变化：,(1)NAP：细菌性感染、慢粒(加、急)、急,淋、慢淋、恶性淋巴瘤、转移癌、,骨纤、真红、再障、原发性血小,板增多症、使用糖皮质激素等。,3.疾病的鉴别：,(1)类白与慢粒:前者 后者,(2)慢粒慢性期与慢性中性粒细胞白血病：前者 后者,(3)细菌性感染与病毒性感染/寄生虫感染：,前者 后两者正常或,(2)NAP：慢粒(慢)、PNH、MDS、恶组等。,(6)恶组与反应性组织细胞增多症：,前者 后者常,(7)急性白血病类型：急性髓细胞 急淋,(4)慢粒病情观察：,(5)再障与阵发性睡眠性血红蛋白尿：前者 后者,CML,类白,五、应用评价,NAP染色有多种检测方法，国际标准化委员会推荐,Kaplow萘酚AS-BI磷酸钠法和Tomonaga萘酚AS-MX,磷酸钠法。钙-钴法试剂成本低廉，操作繁琐，反应,时间长，临床上逐步被偶氮偶联法取代，阳性产物色,泽鲜明、定位精确，尤其以萘酚AS-BI磷酸钠法最为,广泛使用，利于评定NAP活性强度的分级。常用重氮,盐有坚牢蓝RR、坚牢蓝BB、坚牢紫酱等，不同偶联,有不同的灵敏度。,过氧化物酶染色,(peroxidase，POX),一、原 理,粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶(POX)，它可分解H2O2释放出新生态的氧，后者氧化二氨基联苯胺，形成金黄色不溶性沉淀，定位于胞质内酶活性部位。,二氨基联苯胺法,二盐酸联苯胺法,二、结果判断,在细胞质内出现金黄色颗粒为阳性反应。,二氨基联苯胺法,二盐酸联苯胺法,复方联苯胺法,三、正常血细胞的染色反应,1.粒细胞系统：,原始粒细胞（）或（+）,早幼粒以下细胞均（+），阳性逐渐增强。,中性分叶核粒细胞：强阳性,嗜酸粒细胞：阳性最强,嗜碱粒细胞：（）,2.单核细胞系统：,（）或弱（+），阳性颗粒少而细小。,3.其它系统细胞：,淋巴细胞系统、红细胞系统、巨核,细胞系统、浆细胞、组织细胞（）。,四、临床意义,主要用于鉴别急性白血病的类型,（1）急淋和急性髓细胞系的鉴别：,急淋：（），阳性率3%；,急单：弱阳性；,急粒：阳性（+）。,ALL,ALL,原粒阴性,原粒弱阳性,原粒阳性,早幼粒,强阳性,（2）鉴别诊断：,a.小原粒（+）与原淋（）,b.急性早幼粒白血病(+)与急单（+）,c.急单（+）与组织细胞白血病、,恶性组织细胞病（）,一、原理,苏丹黑B是一种脂溶性重氮染料，可溶解细胞内含脂结构(中性脂肪、磷脂、糖脂和类固醇)，而使脂类物质显示出来，呈棕黑色或深黑色(粒细胞：丰富；单核细胞：少量)。,苏丹黑染色,（Sudan black B，SBB）,二、SBB与POX区别：,POX特异性高于SBB，而敏感性,低于SBB；,2.SBB步骤较繁琐。,过碘酸-雪夫反应(糖原染色)periodic acid-Schiff reaction(PAS),过碘酸是氧化剂，使含有乙二醇基的多糖类物质(糖原、糖蛋白、糖脂、粘多糖等)氧化，形成双醛基。醛基与Schiff s液中的无色品红结合，使无色品红变成紫红色化合物，定位于含多糖类的细胞内。,一、原理,1.粒细胞系统：（阳性逐渐增强）,原始粒C（）或（+）,早幼粒C成熟中性粒C（+）：,细颗粒均匀红色,嗜酸粒C：颗粒不着色，胞质呈红色。,嗜碱粒C：颗粒阳性，胞质不着色。,二、正常血细胞的染色反应,2.单核细胞系统：分化差（）其他（+），,细颗粒状。,3.淋巴细胞系统：多数（）少数（+），,粗颗粒或块状。,4.红细胞系统：（），病理情况可（+）。,5.巨核细胞系统：（+），颗粒状或块状。,6.其它细胞：浆细胞（），巨噬细胞（+）,a 粒细胞、b 巨核细胞、c 单核细胞、d 幼红细胞,三、结果判断,1.粒细胞系统：,红色、弥散状。,各种细胞阳性反应强弱不同,2.淋巴细胞系统：,粗颗粒状、小块状、大块状红色。,1、+2、+3、+4、+5、,3.红细胞系统：,均匀红色或块状,4.单核细胞系统：,细颗粒状,5.巨核细胞和血小板：,颗粒状、块状。,1.帮助鉴别巨幼细胞性贫血和骨,髓增生异常综合征、红白血病:,前者（），后两者（+）。,四、临床意义,A 红白血病(+),B 巨幼细胞性贫血(),2.帮助鉴别急性白血病的细胞类型：,急淋：（+）呈粗颗粒状或块状。,急粒：（+）细颗粒状或均匀红色。,急单：（+）细颗粒状，均匀分布，,有时胞质边缘颗粒较粗大。,3.其他细胞：,急慢性淋巴细胞白血病和,淋巴瘤细胞多呈强阳性,戈谢细胞呈强阳性,尼曼-皮克细胞多呈阴性,CLL,ALL,1.特异性酯酶（specific esterase）,主要存在于粒细胞，又称“粒细胞酯酶”,氯乙酸AS-D萘酚酯酶（NAS-DCE）。,一、分类,酯 酶 染 色,2.非特异性酯酶(nonspecific esterase),单核、组织细胞中含量较多，粒细,胞、淋巴细胞中含量少，且氟化钠抑,制单核细胞中的非特异性酯酶，而不,抑制粒细胞、淋巴细胞及其他细胞。,醋酸AS-D奈酚酯酶：NAS-DAE,-醋酸奈酚酯酶：-NAE,-丁酸奈酚酯酶：-NBE,酸性-醋酸奈酚酯酶：ANAE,(-NBE 敏感性不如NAS-DAE,但特异性较之强),（一）氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色,Naphthol AS-D chloroacetate esterase,1.原理,氯乙酸AS-D萘酚 AS-D萘酚,不溶性的有色(红)沉淀。,NAS-DCE几乎仅出现在粒细胞，其特异性高，,因此又称为“粒细胞酯酶”,NAS-DCE,重氮盐(坚牢蓝紫酱),氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色,2.正常血细胞的染色反应,粒系(酶活性随细胞成熟而逐渐减弱),原粒（）或（+）,早幼粒成熟中性粒细胞（+）,嗜酸性粒细胞（）或弱（+）,嗜碱性粒细胞（+）,单核细胞系统：（）,肥大细胞：（+）,淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、,巨核细胞、血小板：（）,3.临床意义,主要用于辅助鉴别急性白血病细胞类型：,急性粒细胞白血病：（+）,急性早幼粒细胞白血病：强（+）,急性单核细胞白血病：（）,急粒单：粒细胞（+）和单核细胞（）,急性巨核细胞性白血病：（）,急性淋巴细胞白血病：（）,1.原 理,非特异性脂酶在相应的pH环境中，,将基质液中相应底物水解，产生含萘酚,的物质，后者与重氮盐发生偶联反应，,形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质,内酶所在的部位。,（二）非特异性脂酶染色,根据pH值的不同分为：,酸性：酸性-醋酸萘酚酯酶染色(ANAE),中性：-醋酸萘酚酯酶染色(-NAE)醋酸AS-D萘酚酯酶染色(NAS-DAE),碱性：-丁酸萘酚酯酶染色(-NBE),名称,pH,底物,生成物,重氮盐,(,产物颜色,),-醋酸萘酚酯酶,(-NAE),中,-醋酸萘酚,-萘酚,坚牢蓝B,棕黑,灰黑,醋酸AS-D萘酚酯酶(AS-D NAE),中,醋酸AS-D萘酚,AS-D萘酚,坚牢蓝BB,蓝,-丁酸萘酚酯酶,(-NBE),碱,-丁酸萘酚,-萘酚,坚牢紫酱GBC,红,酸性-醋酸萘酚酯酶(ANAE),酸,-醋酸萘酚,-萘,酚,六偶氮,付品红,红,-醋酸萘酚酯酶染色(灰黑色、棕黑色),-醋酸萘酚酯酶染色,a:单核 b:BPC c:巨核 d:LC(+)e:幼红(-),2.临床意义,辅助鉴别急性白血病细胞类型,A.急单：单核细胞阳性，能被NaF抑制。,B.急粒：粒细胞弱阳性，不被NaF抑制。,C.M3：强阳性，不能被NaF抑制。,D.M4：部分阳性细胞能被NaF抑制，,部分阳性细胞不能被NaF抑制。,E.ALL：原幼淋阴性或阳性，不能被NaF,抑制。,氟化钠抑制：氟化钠试验的抑制率大于50%。,公式：,NaF抑制,率=,抑制,前,阳性率 抑制,后,阳性率,抑制,前,阳性率,(或阳性积分),100%,-醋酸萘酚酯酶染色,M5,NaF,M1,NaF,酸性-醋酸萘酚酯酶染色（弥漫性棕红色）-M5,3.酯酶双染色,在同一张涂片上进行两种酯酶染色,特异性酯酶+非特异性酯酶,对诊断急性粒-单细胞白血病有独特价值,-NAE 与NAS-DCE 红色(单),-NBE 与 NAS-DCE 兰色(粒),NAS-DCE：,M1弱(+)/M2(+)/M3强(+)，M5/ALL()；,-NBE：,M5(+)NaF抑制，M1/M2/M3/ALL()；,-NAE/NAS-DAE：,M5强(+)NaF抑制,M3强(+)/M1M2a/ALL(+)NaF不抑制。,酸性磷酸酶染色,(acid phosphatase，ACP),一、原理,1.Gomori 硫化铅法,棕黑色,2.偶氮偶联法(常用),六偶氮付品红棕红色沉淀,磷酸萘酚AS-BI 萘酚AS-BI 棕红色沉淀,ACP,重氮盐,3.抗酒石酸酸性磷酸酶染色（一组同工酶）,两张相同标本涂片+两份基质液,(加L-酒石酸，不加 L-酒石酸),ACP染色,耐L-酒石酸,两份（+）,不耐L-酒石酸,不加 L-酒石酸（+）,加L-酒石酸（）,二、正常血细胞染色反应,粒细胞、单核细胞、淋巴细,胞、巨核细胞、血小板、浆细胞、,巨噬细胞均呈阳性反应。,三、临床评价,1.诊断多毛细胞白血病,多毛细胞白血病：,（+），不被L-酒石酸抑制。,慢淋和恶性淋巴瘤细胞:（+），被L-酒石酸抑制。,多毛细胞白血病,慢性淋巴细胞白血病,抗酒石酸酸性磷酸酶染色,酸性磷酸酶染色,多毛细胞白血病,多毛细胞白血病 抗L-酒石酸ACP阳性,2.鉴别戈谢(Gaucher)细胞和尼曼-匹,克(Niemann-Picks)细胞：前者（+）后者（）,3.鉴别T淋巴细胞和B淋巴细胞：前者（+）后者（）,Gaucher s cell,Niemann-Picks,四种常见急性白血病的细胞化学染色结果,项目 M3 M1/M2 M5 ALL,POX 强阳性 阳性/阴性 弱阳性/阴性 阴性,NAS-DCE 强阳性 阳性/阴性 多阴性 阴性,-NAE 强阳性 阴性/弱阳性 阳至强阳性 阴性/阳性,-NAE+NaF,不抑制 不抑制 抑制 不抑制,-NBE 阴性 阴性 阳性 阴性,-NBE+NaF 抑制,急非淋 脂酶染色,NAP：类白与慢粒、感染类型、再障与,PNH、慢粒分期；,ACP：毛白、T细胞/B细胞、脂代谢障碍；,PAS：巨幼贫与MDS-RA、红白血病；,铁染色：缺铁贫、铁粒幼贫、MDS-RAS。,急淋,POX,急性白血病,思考题：,POX染色的原理及临床意义,酯酶的临床应用,NAP染色的原理及临床应用,PAS染色的原理及临床意义,细胞化学染色在鉴别急性白血病中的应用,铁染色的临床意义,谢谢观赏,