血栓与止血检验.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,血栓与止血检验PPT课件,血栓与止血检验PPT课件血栓与止血检验PPT课件,一、基本理论,血管壁的正常结构包括三层：内层、中层和外层,内层：内皮细胞,+,基底膜,内皮细胞管壁有肝素类物质,内皮细胞内含细胞器,（棒状小体,vWF,和,t-PA,，,TM,，,AT-,PAI-1,等,）,中层：平滑肌细胞（脉细血管无此层）,外层：结缔组织,血管壁的结构,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,激活血小板,激活凝血过程,抗血栓特性,收缩反应,血管壁的止血功能,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,一、基本理论,血小板的止血功能,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,血管损伤（抗血栓特性降低）,血管收缩,激活凝血过程,血流减慢,纤维蛋白形成,血管内皮下成分暴露,血小板黏附、聚集、释放,血栓形成,血浆血管性血友病因子抗原,vWF:Ag,，,ELISA,法,原理纯化的兔抗人,vWF:Ag,抗体包被聚苯乙烯反应板，加入稀释的待测血浆，样本中的,vWF:Ag,结合于固相的抗体上，然后加入酶标记兔抗人,vWF:Ag,抗体，与其定量结合，洗去多余抗体后，加底物显色，通过查找标准曲线，即可计算出,vWF:Ag,的含量。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,二、血管壁（内皮）检验,vWF:Ag,操作,单抗以,0.1mol/L,的碳酸盐缓冲液（,pH9.5,）稀释成,10g/ml,加入反应板中，每孔,0.2ml,，置于湿盒中,4,过夜。,0.05%Tween,20,，,0.01mol/L,磷酸盐缓冲液（,pH7.4,，,Tween,PBS,）洗,3,次后加入用,0.4%BSA,PBS,稀释的待测血浆或培养液上清，每孔,0.2ml,，,37,温育,2,小时。,同前洗涤,3,次后，加入用同上缓冲液稀释的酶标,vWF,单抗，每孔,0.2ml,，,37,温育,2,小时。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,vWF:Ag,操作,同前洗涤,5,次后，每孔加底物溶液（,OPD 1mg/ml,，用,0.1ml/L,，,pH4.5,的枸橼酸盐缓冲液配制，,30%,过氧化氢,0.5g/ml,）,0.2ml,，置室温约,5,分钟后，各孔加,3mol/L,硫酸,0.05ml,终止反应。,室温放置,10min,后在酶标仪上测定,492nm,处的吸光度值。,绘制标准曲线 正常混合血浆以,0.4%BSA,PBA,按,1,：,20,、,1,：,50,、,1,：,100,、,1,：,200,、,1,：,500,、,1,：,1000,六种浓度稀释，与待测样品在相同条件下测定。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,参考值：,61.6%,126.6%,注意事项,对血浆,vWF,：,Ag,浓度过高的标本，应稀释后再测定。,所有,ELISA,测定中应注意的事项均应引起重视。,除本方法外，也可以采用胶乳增强免疫比浊法。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,vWF:Ag,参考区间,vWF:Ag,应用评价,血管性血友病因子抗原测定主要用于血管性血友病的诊断和鉴别诊断,1.,减低 见于血管性血友病（,vWD,），是诊断,vWD,及其分型的重要依据,2.,升高 见于血栓性疾病，如急性冠脉综合征（,ASC,）、心肌梗死、,脑血管病变、妊娠高血压综合征、肾小球疾病等，同时也见,于剧烈运动后，肾上腺素受体被兴奋等。,应用评价以前,vWF,：,Ag,定量常采用免疫火箭电泳，由于操作较为复杂，现在少用。,ELISA,常用于定量检测,vWF,：,Ag,，但是胶乳增强的免疫比浊法更为简便快速，而且可以在全自动血凝仪上进行测定。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,凝血酶调节蛋白，,TM,原理将抗人凝血酶调节蛋白（,Thrombomdulin,TM,）单克隆抗体包被于聚苯乙烯放免小杯中，样本中的,TM,结合于包被的放免小杯上，加入,125I-,抗人,TM,单抗，根据结合的,125I,放射性强度计算出样品中,TM,的含量。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,TM,操作,1.,绘制校正曲线 人,TM,标准品用缓冲液,A,做倍比稀释，,TM,的浓度分别为,500,，,250,，,125,，,31.25,，,15.6,，,7.3,3.9,和,0ng/ml,以人,TM,浓度为横坐标，以,cpm,为纵坐标绘制校正曲线。,2.,将,200l,的抗人,TM,单抗包被液加入聚苯乙烯放免小杯中，,4,过夜，用洗涤液,A,洗,3,次，将待测样本（或标准品）,0.25ml,与等量缓冲液,A,混合，每小杯加入,20l,稀释样品液（空白管加入缓冲液,A,），,37,水浴,2h,，用洗涤液,A,洗,3,次，加入,200l125I-,抗人,TM,单抗，,37,水浴,2h,，再用洗涤液,B,洗六次，在,闪烁测定仪上测定放射活性，在校正曲线上查出相应的浓度。,TM,参考区间,25,52g/L,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,TM,是由血管内皮细胞合成和分泌释放的，它表达于血管内皮细胞表面，和循环血液中的凝血酶形成,1,：,1,的,TM-,凝血酶复合物，此复合物将蛋白,C,（,PC,）激活为活化蛋白,C,（,APC,），,APC,有灭活,Fa,、,Fa,和激活纤溶活性的作用，因此,TM,对于血管的抗凝作用十分重要。正常情况下，血浆中,TM,的含量很低，但当血管内皮受损后，血浆中的,TM,含量明显升高且与内皮的损伤程度相关。目前认为，,TM:Ag,的检测是了解血管内皮损伤最好的指标。,TM:Ag,的水平升高 见于血栓性疾病，如糖尿病、心肌梗死、脑血栓、深静脉血栓形成（,DVT,）、,DIC,等。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,TM,应用评价,TM,注意事项,1.,如果样品不能当天测定，应在采血后立即将血浆分离出放于,-20,冷冻保存。冷冻的样品复溶时应在,37,水浴中进行，室温中缓慢解冻则可导致,TM,沉淀。,2.,若样本中的,TM,含量超过校正曲线范围应适量稀释后再次测定,。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,血浆,6-,酮,-,前列腺素,F1,检测,原理,ELISA,法：将抗原（血浆,6-,酮,-,前列腺素,F1-,牛血清白蛋白连接物）包被于固相载体上，与游离抗原（待测样品或,6-,酮,-,前列腺素,F1,标准品）竞争性地与一定量的抗,6-,酮,-PGF1,抗体结合，洗涤后加入过量的酶标记第二抗体，再加入底物显色。待检血浆或标准品中的,6-,酮,-PGF1,含量与显色程度呈负相关，根据显色程度（,A,值）即可从标准曲线中推算出待检血浆中,6-,酮,-PGF1,的含量。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,血浆,6-,酮,-,前列腺素,F1,检测 操作步骤,1.,标本采集 顺利采取静脉血后与,5%EDTA-Na2,进行,9,：,1,抗凝混匀，,3000r/min,离心,20min,分离出血浆。,2.,用碳酸盐缓冲液将,6-,酮,-PGF1-BSA,作一定稀释后包被于酶标反应板，再用,0.3%,明胶封闭。加入标准品（倍比稀释成,12.51600pg/ml,浓度）或待测样品、兔抗,6,酮,-PGF1IgG100l,后在,37,中温育,2h,。洗涤后再加入酶标第二抗体,200l,在,37,反应,2h,。以,OPD-,过氧化氢为基质显色,20min,，加入,3mol/L,硫酸中止反应，在酶标检测仪上测定,490nm,处的吸光度值,A,。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,血浆,6-,酮,-,前列腺素,F1,检测,参考区间,标准曲线与计算,式中,:B,为测定管；,B0,为不加样品管，最大结合率管；,B/B0,为结合率。,以标准品含量为横坐标，,B/B0,（,%,）为纵坐标，在半对数纸上绘制出标准曲线。根据样品孔,B/B0,（,%,）值在标准曲线上读出,6-,酮,-PGF1,的含量。,样品,6-,酮,-PGF1,浓度（,pg/ml,）,=,测定值,10,。,参考范围,10.7,25.1 pg/ml,。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,血浆,6-,酮,-,前列腺素,F1,检测 应用评价,血浆,6-,酮,-,前列腺素,F1,是血管内皮细胞膜上,PGG2,和,PGH2,代谢的终末产物，检测血浆中,6-,酮,-,前列腺素,F1,的水平能客观的反映血管内皮的功能，有助于对血管内皮损伤程度的了解和疗效评价。,血浆,6-,酮,-,前列腺素,F1,减低 见于血栓性疾病，如急性心肌梗死、心绞痛、脑血管病变、动脉粥样硬化、周围血管血栓形成及血栓性血小板减少性紫癜等。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,了解血小板的超微结构，在此基础上理解血小板的止血功能。,理解并掌握血小板止血功能实验室检查的临床应用及评价。,学习要点,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,第二节 血小板止血作用及检验,一、基本理论,血小板（,blood platelet,）由骨髓中成熟巨核细胞的胞 质分割生成，是哺乳动物血液中体积最小的血细胞。,血小板数量：,(100,300)x10,9,个,/L,（成年人）。,血小板寿命：,7,10,天。,主要功能：促进止血和加速凝血，在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中起重要作用。,血小板概述,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板结构,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,光学显微镜：一般表现为多形态，直径,1,4m,，具有运动和变形能力。瑞氏染色后见血小板胞质呈灰蓝色或淡红色，无胞核，中心部位有较多紫红色嗜苯胺蓝颗粒。,电子显微镜：血小板结构由外向内可分为表面结构、溶胶质层结构和细胞器内含物三层。,1,血小板表面结构 由血小板膜、细胞外衣和开放管道系统（,open canalicular system,，,OCS,）组成。,重要成分：磷脂酰丝氨酸（,phosphatidylserine,，,PS,）,/,血细胞第,3,因子（,PF3,）,血小板膜糖蛋白等。,2,溶胶质层结构 由微管、微丝、致密管道系统等组成。,3,细胞器内含物结构 主要致密颗粒和,-,颗粒、溶酶体组成。,血小板超微结构,功能基础,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,花生四烯酸是膜磷脂代谢产物，其代谢途径是血小板发挥聚集止血功能的主要代谢基础。,血小板的花生四烯酸代谢途径,血管内皮细胞内完成,2,3min,后,前列环素,合成酶,血栓烷,A,2,合成酶,环氧化酶,花生四烯酸,膜磷脂,磷脂酶,A,2,前列腺素环内过氧化物,PGG,2,过氧化物酶,前列腺素环内过氧化物,PGH,2,前列环素（,PGI,2,）,血栓烷,A,2,（,TXA,2,）,30s,后,6-,酮,-PGF,1,（稳定产物）,血栓烷,B,2,（,TXB,2,）,（稳定产物）,血小板内完成,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板粘附,促凝作用,血小板聚集,释放反应,血块收缩,血小板的止血功能,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板的止血功能,血小板的止血功能,ADP,血小板进一步激活、释放,血块收缩,内皮损伤（内皮下组织暴露）,血小板粘附,血小板初期释放,ADP,等,血小板聚集,纤维蛋白形成,坚固的凝血块,血小板促凝作用,5-HT,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,类 别,成分,活性胺,5-HT,，组胺，肾上腺素，去甲肾上腺素,腺嘌呤核苷酸,ADP,ATP,cAMP,阳离子,Ca2+,K+,血小板因子,PF3,PF4,等,凝血因子,凝血因子,I,，,V,，,VIII,，,XIII,血小板蛋白,-TG,，血小板糖蛋白等,血栓烷,TXA2,血小板的主要释放产物,血小板功能的实验室检查,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板粘附实验,PAdT,，玻珠柱法,原理 血小板粘附试验（,platelet adhension test,，,PAdT,）利用血小板在体外可黏附于玻璃表面的原理设计，测定方法有多种，包括玻珠柱法、玻球法等。当血液与一定表面积的玻璃接触一定时间后，血小板粘附于玻璃表面，因此血液中血小板数会降低。通过计数接触前、后的血中血小板数，即可计算出血小板粘附率。该试验为判断血小板粘附能力的常用指标。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,PAdT,操作,将玻珠柱管（内径,3mm,，长,9.4cm,，内装直径,0.3,0.5mm,玻珠,1.5g,，管两端封以,0.05cm,孔径的尼龙布）与注射器相连；,行肘正中静脉穿刺；,当血液接触玻珠时开始计时，掌握好血液通过玻珠柱的速度。在,4,等分的玻珠柱中，血液通过每段速度为,5s,，共,20s,。经过玻珠柱后，再按原速抽血,5s,；,采集通过玻珠柱前后的血液，作血小板计数。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板粘附率（,%,）,=100%,参考值：,62.5%8.6%,注意事项,取血过程必须顺利，掌握血液通过玻珠柱的速度。,待用玻珠柱应置于干燥器中储存，受潮后粘附率下降。,血小板计数要准确，宜作,2,3,次后取平均值。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,PAdT,参考区间,粘附前血小板数,-,粘附后血小板数,粘附前血小板数,PAdT,应用评价,血小板粘附率减低：见于先天性和继发性血小板功能异常（以后者多见），如血管性血友病、巨大血小板综合征、爱,-,唐综合征、低（无）纤维蛋白血症、异常纤维蛋白血症、急性白血病、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性疾病、肝硬化、尿毒症、服用抗血小板药物等。,血小板粘附率增高：见于血栓前状态和血栓形成性疾病，如高血压病、糖尿病、妊娠高血压综合征、肾小球肾炎、肾病综合征、心脏瓣膜置换术后、心绞痛、心肌梗死、脑梗死、深静脉血栓形成、口服避孕药等。,应用评价,是检测血小板功能的基本试验之一，用于遗传性与获得性血小板功能缺陷疾病的诊断、血栓前状态和血栓性疾病检查以及抗血小板药物治疗监测。但特异性差，操作较复杂，易受较多人为因素的影响，致使其在临床的实际应用受限。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板聚集实验,PAgT,原理,当一定数量的诱导剂存在时血小板即发生聚集。以贫血小板血浆（,PPP,）设定最低浊度（,100%,透光度），富血小板血浆（,PRP,）设定最高浊度（,0%,透光度）。在,PRP,血浆中加入诱聚剂诱导血小板聚集，测定血浆浊度的变化，绘制血小板聚集曲线。通过分析血小板聚集曲线的最大聚集率（,MAR,）、达到最大幅度的时间、达到,1/2,最大幅度的时间、,2min,的幅度、延迟时间、斜率参数判断血小板的聚集的程度和速度。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,PAgT,操作,1.,用硅化注射器从肘静脉取血,4.5ml,，注入含,0.5ml 109mmol/L,枸橼酸钠的硅化或塑料离心管中，充分混匀；,2.,以,1000r/min,室温下离心,10min,，分离,PRP,，小心取出上层血浆，计数血小板并调至（,100,200,）,10,9,/L,；,将上述剩余血液以,3000r/min,离心,20min,，分离,PPP,（上层较透明的液体），血小板计数一般要求低于,2010,9,/L,；,3.,按照不同的聚集仪的要求，吸取所需的,PRP,和,PPP,置于比色杯中，分别调整好透光度为,10,和,0,；,4.,打开记录仪走纸开关，描记,10s,的,PRP,基线，随后将适量诱聚剂（视仪器要求而定，一般为反应体系总量的,1/10,左右）加入,PRP,中，并开始搅拌，记录浊度改变曲线，测定时间一般为,6,10min,。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,不同仪器及诱聚剂或者不同浓度、剂量的同种诱聚剂有不同的参考范围。,MG-196,型血小板聚集仪为例，几种常用的诱聚剂测得的参考值,:,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,PAgT,参考区间,ADP,(1.0mol/ml),ADP,(0.5mol/ml),肾上腺素,(4.0g/ml),胶原,(3.0g/ml),瑞斯托霉素,(1.5mg/ml),最大幅度（,%,）,48.6 78.8,25 50,50.2 85.6,54 90,76.1 98.9,达到最大幅度时间（,S,）,150 290,68 230,220 360,220 290,200 280,2min,时幅度（,%,）,38 68,20 42,25 50,22 61,55 90,单峰或双峰曲线,双峰,双峰,双峰,单峰,双峰,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板聚集曲线,PAgT,应用评价,应用评价,本试验是检测血小板功能的基本试验之一，试验简便、快速，成本低廉，在临床上开展比较广泛。,血小板聚集率减低：见于血小板无力症、血小板贮存池病、血管性血友病、巨大血小板综合征、低（无）纤维蛋白原血症、肝硬化、尿毒症、维生素,B12,缺乏症、细菌性心内膜炎、急性白血病、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性疾病、特发性血小板减少性紫癜、服用抗血小板药物等。,血小板聚集率增高血液高凝状态和（或）血栓形成性疾病，如动脉粥样硬化性心脏病、糖尿病、肾小球肾炎、肾病综合征、心脏瓣膜置换术后、深静脉血栓形成、高脂饮食、口服避孕药和吸烟等。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,PAgT,注意事项,标本采集后置于室温（,25,C,左右）下保存,并在,3,小时内完成试验,;,试验前至少,1,周应停用一切抑制血小板聚集的药物，如阿司匹林、潘生丁、肝素、双香豆素等。,采血前一天应避免使用牛奶、豆浆等高脂肪食物以免影响悬液透光度。,抗凝剂应选用枸橼酸钠，而忌用,EDTA,。,注意诱聚剂的保存，如,ADP,在保存过程中会自行分解产生,AMP,，故配制后溶液应保存与,-20,C,冰箱，但保存一般不应超过,6,个月；肾上腺素应避光防止减少分解。此外，诱聚剂的种类和浓度对血小板聚集结果都有影响，临床判断是应注明所用诱聚剂的种类和浓度。各实验室也应建立自己的参考值。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板第,3,因子有效性测定（,PF3aT,原理,PF3,是血小板活化过程中形成的一种膜表面磷脂成分（即磷脂酰丝氨酸），是血小板参与凝血过程的重要因子。试验将正常人与受检者的,PRP(,富含血小板血浆,),和,PPP,（贫血小板血浆）交叉组合,利用白陶土作为血小板活化剂，氯化钙作为凝血反应启动剂，促进,PF3,形成。通过测定各组标本的凝固时间，比较各组时差，了解受检者,PF3,是否有缺陷。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,PF3aT,操作步骤,采血，待测血样和正常对照血样各一份，加入抗凝剂混匀；,分别制备,PPP,和,PRP,；,准备四只试管，按下表加样；,将上述,4,只试管置于,37,C,水浴预温,2min,后，依次加入白陶土悬液,0.2ml,，并记录时间；,加入白陶土,20min,后，向小试管中依次加入,0.025mol/L,氯化钙,0.2ml,，开动秒表测定凝固时间。,组别,患者血浆（,ml,）,正常血浆（,ml,）,PRP,PPP,PRP,PPP,1,0.1,0.1,2,0.1,0.1,3,0.1,0.1,4,0.1,0.1,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,PF3aT,参考区间,第,1,组较第,2,组延长如超过,5s,以上，即为,PF3,有效性减低。第,3,组、第,4,组分别为患者和正常人（作为对照管），患者,PF3,有缺陷或内源凝血因子有缺陷时（如血友病），第,3,组凝固时间比第,4,组长。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,PF3aT,应用评价,应用评价,PF3aT,是最常用的血小板凝血活性检测试验，方法简单，易于操作。,PF3,有效性减低：见于先天性血小板,PF3,缺乏症、血小板无力症、巨大血小板综合征、肝硬化、尿毒症、弥散性血管内凝血、系统性红斑狼疮、特发性血小板减少性紫癜、骨髓增生异常综合征、急性白血病及服用抗血小板药物等。,PF3,有效性增加：常见于高脂血症、动脉粥样硬化、心肌梗死、糖尿病伴血管病变等。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板膜糖蛋白测定,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板膜糖蛋白（,Glucoprotein,，,GP,）是血小板功能和血小板与其他活性物质作用的基础，一些糖蛋白如,GP Ia,、,GP Ib,、,GP IIb,、,GP IIIa,等已被确定为血小板特异抗原。,GP,分子数量或结构异常均可导致出血或血栓形成。,活化血小板与静止血小板相比，,GP,的种类、结构、含量等亦呈现显著变化。,可使用,ELISA,或流式细胞术（,FCM,）分析血小板膜糖蛋白的表达。,主要血小板膜糖蛋白及功能,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,名 称,CD,名称,分子量,功能特性,GP Ia,CD49b,150 000,与,GP IIa,形成复合物，是胶原的受体,GP Ib,CD42c,170 000,与,GP IX,、,GP V,形成复合物，是,vWF,的受体，参与血小板粘附反应，缺乏或减少时血小板粘附功能减低，见于巨大血小板综合征,GP Ic,CD49f,140 000,与,GP II,形成复合物，是层素（,laminin,）的受体,GP IIa,CD29,138 000,与,GP Ia,和,Ic,形成复合物，是胶原和层素的受体,GP IIb,和,IIIa,CD41a,IIb 145 000,IIIa 90 000,GP IIb,与,IIIa,形成复合物，是纤维蛋白原（,Fg,）的受体，参与血小板聚集反应，缺乏或减少时血小板聚集功能减低，见于血小板无力症,GP IV,CD36,88 000,是,TSP,的受体,GP V,82 000,和,GP Ib,、,GP IX,构成,vWF,受体,GP Ib-V-IX,GP IX,CD42a,17 000,和,GP Ib,、,GP V,形成复合物，构成,vWF,受体,P-selectin,140 000,即,颗粒膜糖蛋白（,GMP140,）。血小板活化时，可移行至血小板将膜上，成为血小板活化的标志。,血小板,自身,抗体测定,血小板自身抗体,包括：,血小板相关免疫球蛋白（,platelet associated immunoglobulin,，,PAIg,）（包括,PAIgG,、,PAIgA,、,PAIgM,）特异性膜糖蛋白自身抗体,药物相关自身抗体,抗同种血小板抗体,血小板自身抗体测定表达有助于判断血小板减少的原因。检测血小板免疫相关球蛋白的常用方法为,ELISA,及流式细胞术。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板相关抗体测定,的应用评价,特发性血小板减少性紫癜（,ITP,）：,90%,以上的病人,PAIgG,增加，同时测定,PAIgA,、,PAIgM,及,PAC3,阳性率达,100%,。,ITP,病人在皮质激素治疗后，,PAIgG,不下降可作为切脾的指征。,ITP,疗效监测指标，治疗有效上述指标下降，复发则增加。,其他疾病：,如同种免疫性血小板减少性紫癜（多次输血后）、,Evans,综合征、药物免疫性血小板减少性紫癜、慢性活动性肝炎、胶原性疾病、系统性红斑狼疮、恶性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤等,PAIg,也可增加。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板寿命测定,原理 利用阿司匹林可使血小板花生四烯酸（,AA,）代谢受阻，代谢产物丙二醛（,MDA,）和血栓烷,B2,（,TXB,2,）生成减少，而新生血小板不受抑制，,MDA,和,TXB,2,含量正常的原理，测量病人服用阿司匹林后血小板,MDA,和,TXB,2,生成量恢复曲线来推算血小板的生存时间。,该试验是检测血小板在体内破坏或消耗速度的一项重要试验，也称为血小板生存时间测定（,platelet survival time,，,PST,）。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板寿命测定的临床意义,血小板消耗过多性疾病：,DIC,等,各种血栓性疾病，如：心梗、肺梗死等,血小板破坏增多性疾病，如：,ITP,、脾亢、,SLE,等,血小板生存,时间缩短见于,注意：在血小板数过低时本法敏感性较低,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,了解血液中凝血因子及机体凝血机制的基础理论。,理解并掌握凝血因子实验室检查的临床应用及评,价。,学习要点,第十三章 第三节 血液凝固及检验,第三节 血液凝固及检验,一、基本理论,14,个：,12,个经典凝血因子,激肽释放酶原,+,高分子量激肽原,特殊：因子,为钙离子（,Ca,2+,）,其余均为蛋白质,除因子,即组织因子外，其余均存在于新鲜血浆中,依赖维生素,K,的凝血因子：因子,、,、,和,接触凝血因子：因子,、,、激肽释放酶原及高分子量激肽原。,对凝血酶敏感的凝血因子：因子,、,V,、,、,凝血因子概述,第十三章 第三节 血液凝固及检验,凝血因子一般特点,第十三章 第三节 血液凝固及检验,1,内源凝血途径,因子,因子,Xa,固相激活：因子与带负荷的物质如体内的胶原、微纤维等以及体外的玻璃、白陶土等接触后，构型发生改变而被激活为,a,。,液相激活：因子,a,在辅因子,HMWK,的参与下，水解,PK,使之被激活为,K,，,K,又可反馈激活因子,，生成大量的,a,。,二、凝血机制,第十三章 第三节 血液凝固及检验,因子,、,、,、,、,Ca2+,及,PK,、,HMWK,2.,外源凝血途径,因子,因子,Xa,（,1,）因子,（,TF,）是一种跨膜糖蛋白，作为因子,的受体，可与因子,或,a,结合，启动外源凝血途径。,（,2,）因子,的激活 当,TF,结合到因子,后，因子,的构型发生改变随之被凝血酶、,Xa,激活为,a,。因子,a,与,TF,、,Ca,2+,形成,-TF-Ca,2+,复合物，其形成所需时间很短，一般不超过,10,秒。,-TF-Ca,2+,复合物可激活因子,X,和因子,，使内源与外源凝血途径相联通，具有重要的生理和病理意义。,二、凝血机制,第十三章 第三节 血液凝固及检验,因子,、,Ca2+,3.,共同途径,因子,纤维蛋白,（,1,）凝血活酶的生成,因子,X,的激活：复合物,-TF-Ca,2+,和,a-a-Ca,2+,-PF3,均,可激活因子,X,生成有活性的因子,Xa,。,因子,V,的激活：在少量凝血酶的作用下，因子,V,被激活为,Va,。,磷脂的作用：主要指血小板膜脂质双层中的磷脂酰丝氨酸,（,PF3,）。它提供反应的催化表面。,上述因子共同作用形成,Xa-Va-Ca,2+,-PF3,复合物，此即凝血活酶（凝血酶原酶）。,二、凝血机制,第十三章 第三节 血液凝固及检验,3.,共同途径,（,2,）凝血酶的生成 在凝血活酶的作用下，凝血酶原被水解释放出凝血酶原片段,1,和,2,（,F1,+2,），变成凝血酶（因子,a,）。,凝血酶是一种蛋白水解酶，其活性中心位于丝氨酸残基上，属于丝氨酸蛋白酶类。凝血酶在止血与凝血的生理和病理过程中具有多种重要作用,:,水解纤维蛋白原；激活因子,、,V,、,、,，称为凝血酶的自身催化作用；激活血小板；激活抗凝系统的蛋白,C,；抑制纤维蛋白（原）溶解活性。,二、凝血机制,第十三章 第三节 血液凝固及检验,3.,共同途径,（,3,）纤维蛋白的形成,可溶性纤维蛋白的形成：在凝血酶的作用下，纤维蛋白原的,A,链和,B,链先后被裂解，释出富含负电荷的纤维蛋白肽,A,（,fibrinopeptide A,FPA,）和肽,B,（,FPB,）后，生成纤维蛋白单体（,fibrin monomer,FM,），它们因负电荷减少，相互间排斥力明显降低，故能以氢键聚合。这种聚合物很不稳定，可溶于,5mol/L,（,30%,）尿素或,1%,单氯（碘）醋酸溶淮中（它们能解开氢键），故称为可溶性纤维蛋白单体聚合物或可溶性纤维蛋白。,交联纤维蛋白的形成：在凝血酶的作用下，因子,被激活为具有转谷氨酰酶活性的,Xa,。在因子,Xa,和,Ca,2+,共同作用下，使,FM,链上的谷氨酸与另一个,FM,链上的赖氨酸以共价键交联，形成稳定的纤维蛋白。,从内源凝血途径启动到纤维蛋白形成称为内源凝血系统，从外源凝血途径启动到纤维蛋白形成称为外源凝血系统。,二、凝血机制,第十三章 第三节 血液凝固及检验,。,二、凝血机制,第十三章 第三节 血液凝固及检验,活化部分凝血活酶时间测定,，,APTT,原理 在抗凝血中，加入足够量的活化接触因子激活剂（如白陶土）和部分凝血活酶（代替血小板的磷脂），再加入适量的钙离子即可满足内源凝血的全部条件。从加入钙离子到血浆凝固所需的时间即称为活化部分凝血活酶时间（,activated partial thromboplastin time,APTT,）。,APTT,的长短反映了血浆中内源凝血系统凝血因子（,、,、,、,）、共同途径中凝血酶原、纤维蛋白原和因子,、,的水平。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,凝血因子实验室检查,APTT,操作,（一）血凝仪法,1,预温活化 按仪器操作方法，取正常人混合血浆,0.1ml,于测量杯中并加入,APTT,试剂,0.1ml,混匀，,37,准确孵育,3min,，其间轻轻摇动数次。,2,加钙计时 在测量杯中加入,0.1ml 25mmol/L,的,CaCl,2,，仪器自动测定混合物凝固的终点并显示正常人混合血浆,APTT,秒数。,3,取待测血浆重复,1,2,的操作步骤，测定待测血浆的,APTT,秒数。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,APTT,操作,（二）试管法,1,预温活化 加正常人混合血浆和,APTT,试剂各,0.1ml,于塑料试管中混匀，,37,准确孵育,3min,，其间轻轻摇动数次。,2,加钙计时 加入预温的,0.1ml 25mmol/L CaCl,2,，混匀，并立即开动秒表计时，置水浴中不断振摇。,20s,后，不时取出试管观察混合液流动状态（倾斜,30,），当液体停止流动时终止计时，记录其秒数。一般应重复测,2,3,次取平均值。,3,取待测血浆重复,1,2,的操作步骤，测定待测血浆,APTT,秒数，一般应重复,2,3,次测定取平均值。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,每个实验室应建立所用测定方法相应的参考区间。男性,(373.3)s,，范围为,31.5,43.5 s,；女性,(37.52.8)s,，范围为,32,43s,。待测者测定值较正常对照延长,10s,以上才有病理意义。,APTT,参考区间,第十三章 第三节 血液凝固及检验,1,取血要顺利，血液应与抗凝剂充分混合避免发生微小凝块，样品采集后在,2h,内完成测定。,2,样本测定前应测定正常人混合血浆，其,APTT,值在允许的范围内方可测定样本。,3,APTT,测定因所用的激活剂不同，以及部分凝血活酶来源及制备的不同，均可影响测定结果。部分凝血活酶（磷脂）主要来源于兔脑组织（脑磷脂）。不同制剂质量不同，一般选用对因子,：,C,、,和,在血浆浓度为,200,250U/L,时敏感的试剂。,APTT,注意事项,第十三章 第三节 血液凝固及检验,APTT,临床意义,APTT,是一个临床常用、较为敏感的检测内源凝血因子缺乏的简便试验，已替代普通试管法,CT,测定。但,APTT,对诊断血栓性疾病（,thrombotic disease,）和血栓前状态（,prethrombotic state,）缺乏敏感性，也无特异性，临床价值有限。,新生儿由于凝血系统尚未发育完善，多种凝血因子尤其是维生素,K,依赖凝血因子（,FII,、,FVII,、,FIX,、,FX,）和接触系统凝血因子（,FXI,、,FXII,、,PK,、,HMWK,）血浆水平不到成人的,50%,，其,APTT,检测将延长，一般出生后半年凝血因子可达正常成人水平。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,APTT,临床意义,1,APTT,延长 主要见于：轻型血友病，可检出,FVIII,活性低于,15%,的患者，对,FVIII,活性超过,30%,和血友病携带者灵敏度欠佳。在中、轻度,FVIII,、,FIX,、,FXI,缺乏时，,APTT,可正常。,vWD,，,型和,型患者,APTT,可显著延长，但不少,型患者,APTT,并不延长。血中抗凝物如凝血因子抑制物、狼疮抗凝物、华法林或肝素水平增高，,FII,、,FI,及,FV,、,FX,缺乏时灵敏度略差。纤溶亢进，大量纤维蛋白降解产物（,FDP,）抑制纤维蛋白聚合，使,APTT,延长，,DIC,晚期时，伴随凝血因子大量被消耗，,APTT,延长更为显著。其他如肝病、,DIC,、大量输入库血等。,2,APTT,缩短 见于血栓前状态及血栓性疾病、,DIC,早期（动态观察,APTT,变化有助于,DIC,的诊断）。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,APTT,应用评价,APTT,对血浆肝素的浓度较敏感，是目前广泛应用的肝素治疗监测指标。此时，要注意,APTT,测定结果必须与肝素治疗范围的血浆浓度呈线性关系，否则不宜使用。一般在肝素治疗期间，,APTT,维持在正常对照的,1.5,3.0,倍为宜。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,简易凝血活酶生成试验,，,STGT,原理 用受检者稀释全血作为本试验中所需的全部凝血因子的来源，自身红细胞溶解产物即红细胞素代替,PF3,，按一定时间加入正常基质血浆（提供凝血酶原和纤维蛋白原），测定基质血浆的凝固时间，以检查内源凝血系统凝血活酶生成有无障碍。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,STGT,操作,1,取受检者全血,0.4ml,注入,5ml,蒸馏水内，混匀，使其完全溶解，此为溶血液。,2,取,0.5ml,溶血液加,0.308mol/L,氯化钠溶液,0.5ml,，混匀，,37,预温,2min,，使其变为等渗液。,3,于上液中加已预温的,0.025mol/L,氯化钙溶液,0.25ml,，启动秒表。同时放一竹签以挑除形成的微量纤维蛋白丝。此为温育混合液。,4,分别加,0.025mol/L,氯化钙溶液,0.1ml,于,6,支大试管内，置,37,水浴中，备用。,5,在,1min45s,时，吸,0.1ml,温育混合液注入第,1,支含有氯化钙溶液的试管内；在准,2min,时，将已预温的正常基质血浆,0.1ml,也加至第,1,支试管内，启动第,2,个秒表，记录凝固时间。每隔,2min,重复以上步骤,1,次，共,6,次。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,以最短的凝固时间作为本试验中最有价值的计数。正常人为,(11.990.72)s,，,15 s,为异常。,注意事项,1,等渗化的血液不宜放置过久。,2,温育混合液的准备要严格记时。,STGT,参考区间,第十三章 第三节 血液凝固及检验,STGT,临床意义,STGT,延长（,15 s,），主要见于：先天性因子,VIII,、,IX,、,XI,缺乏；获得性因子,VIII,、,IX,、,XI,缺乏，如,DIC,、原发性纤溶以及肝脏疾病、维生素,K,缺乏症等；血循环中有抗凝物质，如肝素、口服抗凝剂以及其他抗凝物质等。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,STGT,纠正试验,原理,在,STGT,延长的受检稀释全血血液中分别加入,1/100,容量的正常,BaSO,4,吸附血浆（提供,F,、,、,）正常血清（,、,、,）和正常新鲜血浆（,、,、,、,），分别测定正常基质血浆的最短凝固时间，以确定内源性凝血活酶生成缺陷的因子。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,操作,1,取小试管,3,支，分别加入正常吸附血浆、正常血清、正常新鲜血浆各,0.005ml,。,2,于上述,3,支试管中，再各加受检溶血液,0.5ml,，再加,0.308mol/L,氯化钠溶液,0.5ml,，混匀，,37,水浴,2min,。,3,按测定,STGT,的第,3,5,步骤继续操作。,参考区间,加入各种纠正血浆或血清后，延长时间纠正到正