DB51∕T 2165-2016 微生物检测领域培养基和试剂管理指南(四川省).pdf

ICS 03.120.10 A 00 DB51 四川省地方标准 DB51/T 21652016 微生物检测领域培养基和试剂管理指南 2016 - 05 - 18 发布 2016 - 10 - 01 实施四川省质量技术监督局 发 布 DB51/T 21652016 I 目 次 前 言 . II 引 言 . III 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 采购 . 2 5 验收 . 2 6 贮存 . 3 7 制备 . 3 8 灭菌 . 4 9 保存 . 5 10 性能测试 . 5 11 使用 . 5 12 弃置 . 6 附录 A（资料性附录） 培养基的不正确配制出现的质量问题及原因分析 . 7 参考文献 . 8 DB51/T 21652016 II 前 言 本标准为实验室质量管理和技术运作类标准， 建议实验室将该标准与下列实验室质量管理和技术运作类标准结合起来使用。 微生物检测实验室安全管理指南 微生物检测领域设施和环境条件监测指南 微生物检测实验室废弃物处置指南 标准菌株的保存与使用指南 微生物检测领域培养基和试剂验证指南 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则进行起草。 本标准由四川省产品质量监督检验检测院提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准由四川省产品质量监督检验检测院负责解释。 本标准起草单位: 四川省产品质量监督检验检测院， 成都市食品药品监督管理局， 四川省食品药品检验检测院，成都市疾病预防控制中心 本标准主要起草人：时炜，郑卫东，黄薇，黄瑛。 DB51/T 21652016 III 引 言 培养基和试剂的质量是微生物检验成功与否的关键。 只有培养基和试剂的质量符合标准要求， 或至少满足最低性能要求，才能保证检验结果的准确性。 本标准提出微生物检测领域培养基和试剂的管理指南， 旨在为实验室提供培养基和试剂管理的科学路径，以满足相关要求。 本标准包含术语及定义，培养基采购、验收、贮存、制备、使用、弃置等内容。DB51/T 21652016 1 微生物检测领域培养基和试剂管理指南 1 范围 本标准提出了微生物检测领域培养基和试剂的管理要求。 本标准适用于微生物检测领域培养基和试剂的管理，并满足GB/T 27025检测和校准实验室能力的通用要求（IDT ISO/IEC 17025）、国家认证认可监督管理委员会检验检测机构资质认定评审准则对微生物检测领域培养基和试剂的管理要求。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.2 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定 DB51/T 2158 实验室服务和供应品采购及管理指南 DB51/T 2166 微生物检测领域培养基和试剂的验证 3 术语和定义 GB 4789.28界定的以及下列术语和定义适用于本标准。 3.1 培养基 culture medium 液体、半固体或固体形式的、含天然或合成成分，用于保证微生物繁殖(含或不含某类微生物的抑菌剂) 、鉴定或保持其活力的物质。 3.2 试剂 reagent 用于微生物检验的染色剂和培养基配套试剂。 3.3 商品化即用型培养基 ready-to-use medium 以即用形式或融化后即用形式置于容器（例如平皿、试管或其他容器）内供应的液体、固体或半固体培养基。 注：商品化即用型培养基可分为以下四种： 完全可即用培养基； 需重新融化的培养基(如用于平板倾注技术) ； 使用前需重新融化并分装（如倾注到平皿）的培养基； 使用前需重新融化，添加物质并分装的培养基(如：TSC 培养基和 Baird Parker 琼脂) 。 DB51/T 21652016 2 3.4 商品化脱水合成培养基 culture medium prepared form commercially formulations 使用前需加水和进行处理的干燥培养基。 注1：商品化脱水合成培养基的形态一般为粉末状、小颗粒状、冻干等。 注2：商品化脱水合成培养基一般分为以下两种： 完全培养基，使用时无需加入任何其他添加剂； 不完全培养基，使用的时候需加入添加剂。 3.5 自制培养基 culture medium prepared form components in the laboratory 使用者（实验室）依据完整配方配制的培养基。 3.6 （培养基或试剂）批 batch (culture media or reagent) 特定生产周期内生产的、产品型号和编号相同，经过性能测试、质量满足要求的一批培养基或试剂的半成品或成品。 3.7 培养基及试剂的性能 performance of culture media 在特定条件下培养基对测试菌株的反应能力。 4 采购 应按 DB51/T 2158 的要求选择合格供应商，实施培养基与试剂采购。 4.1 供应商在供应产品的同时，应向使用者提供生产企业所附相关文件。文件应包含下列内容： a) 培养基或试剂的各种成分（含添加成分名称及产品编号）； b) 批号； c) 最终 pH (适用于培养基) ； d) 储存信息和有效期； e) 标准要求及质量测试报告； f) 必要的安全操作提示和（或）可能产生危害的信息。 4.2 如果电子文本能确保所提供的文件信息真实有效，供应商可提供电子文本。 4.3 供应商应能保证并要求厂商在培养基发生任何配方的改变时，及时告知实验室。 5 验收 5.1 实验室应逐批验收所采购的培养基和试剂，检查并记录下列内容： a) 有无产品合格证明； b) 包装是否完好； c) 产品生产日期及有效期； d) 所附的文件内容是否完整； e) 验收日期和验收人的签名。 DB51/T 21652016 3 5.2 若上述检查内容出现不符合项，则应拒收。 6 贮存 6.1 应严格按供应商明示的贮存条件贮存培养基和试剂，以保证各成分不会发生改变，超过贮存有效期的培养基和试剂不能再使用； 6.2 应有有效保存培养基和试剂的管理记录，记录中应包括以下内容： a) 容器密闭性检查结果； b) 首次开封日期； c) 有效期； d) 检查内容物流动性、均匀性、结块情况和色泽的记录。 7 制备 7.1 一般要求 7.1.1 应根据培养基和试剂的有效期决定其使用的先后，先到有效期的先用； 7.1.2 制备过程中，应采取措施避免接触性和吸入性危害，尤其应避免接触有毒物质（如胆盐等选择剂）； 7.1.3 称量前，应检查培养基和试剂的流动性、均匀性、结块情况和色泽变化，若出现明显改变，则不应再使用； 7.1.4 称量时，应遵守良好实验室规范和生产厂商提供的使用说明。 注：培养基的不正确制备会导致培养基出现质量问题（见附录A）。 7.2 商品化脱水合成培养基的使用 7.2.1 应严格按照厂商提供的使用说明， 使用商品化脱水合成培养基制备培养基， 如配制重量 （体积） 、pH 值、灭菌条件和操作步骤等。 7.2.2 做好配制记录。配制记录包含下列相关信息： a) 培养基名称和类型、制造商、批号、称重量、配制体积（分装体积）； b) 当作为稀释液或因其他原因要对体积进行控制时,应记录灭菌后的体积； c) pH（最初和最终）值； d) 无菌措施（包括实施的方式、温度及时间）； e) 配制日期、配制人员； f) 灭菌措施,包括灭菌方式、设备、时间和温度等。 7.3 实验室自制培养基的制备 7.3.1 自制培养基时，应按照配方准确配制； 7.3.2 自制培养基的记录，除 7.2.2 规定的内容外，还应包括下列信息： a) 培养基表观特性； b) 每个成分的名称、级别、含量、制造商、批号。 7.4 添加成分的制备 7.4.1 应按产品使用说明书的要求制备添加成分； DB51/T 21652016 4 7.4.2 不稳定的添加成分应即配即用； 7.4.3 不得使用过期的添加成分； 7.4.4 批量配制的抗生素溶液可分装后冷冻贮存，但解冻后的贮存溶液不能再次冷冻。 7.4.5 应要求供应商或生产商提供冷冻对抗生素活性影响的有关资料，也可由使用者自行测试。 7.4.6 当添加成分中含有有毒物质（尤其是抗生素）时，应小心操作，必要时需在通风橱中操作。 7.5 配制用水 7.5.1 除非另有规定，配制用水的电导率在 25时不应超过 25 s/cm； 7.5.2 应按 GB 4789.2 规定的方法，采用平板计数琼脂培养基，定期检查配制用水的微生物污染情况，水中微生物不应超过 103 CFU/mL。 7.5.3 盛装配制用水的容器最好由中性材料制成，如中性玻璃、聚乙烯，在初次使用前应确认不含任何抑菌因子。 7.6 称重和溶解 7.6.1 必要时，称量应在通风柜中，佩戴口罩操作，以防吸入含有有毒物质的培养基粉末； 7.6.2 溶解时，先加入适量的水，充分混合（注意避免培养基结块），然后加水至所需的量后适当加热，并重复或连续搅拌使其快速分散，必要时应完全溶解； 7.6.3 含琼脂的培养基在加热前应浸泡几分钟。 7.7 调整 pH 7.7.1 应使用适合的 pH 计，检测培养基灭菌前后的 pH； 注：固体培养基可用带针式探头的固体培养基专用pH计。 7.7.2 灭菌前后，通过检测发现培养基的 pH 不能满足要求时，应按以下要求进行调整： a) 灭菌前， 一般使用浓度约为40 g/L （约1mol/L） 的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5 g/L （约1mol/L）的盐酸溶液进行调整； b) 灭菌后，使用灭菌或除菌的溶液进行调整。 7.7.3 除特殊情况外，培养基和试剂在灭菌后冷却至 25 时，pH 应在规定的0.2pH 范围内。 7.8 分装 将配好的培养基分装到适当的容器中，培养基体积不得超过容器体积的80%。 8 灭菌 8.1 一般要求 8.1.1 应按照相关标准或供应商使用说明，对培养基和试剂实施灭菌； 8.1.2 灭菌方式通常有湿热灭菌法、过滤除菌法和煮沸等。 注：有些试剂则不需灭菌，可直接使用（参见相关标准或供应商使用说明）。 8.2 湿热灭菌 8.2.1 一般情况下，应在高压锅或培养基制备器中进行湿热灭菌； 8.2.2 应按照相关标准或供应商使用说明的规定确定灭菌参数； 8.2.3 单个包装，培养基体积不应超过 1000 mL，否则灭菌时可能会造成过度加热。 DB51/T 21652016 5 8.2.4 加热完成后采用适当的方式冷却，以防加热过度。 注：适当的冷却方式对于大容量和敏感培养基十分重要，例如含有煌绿的培养基。 8.3 过滤除菌 8.3.1 过滤除菌可在真空或加压的条件下进行； 8.3.2 通常，使用孔径为 0.2 m 的无菌设备和滤膜； 8.3.3 应对过滤设备实施严格的消毒。 8.3.4 如果滤膜上附着有蛋白质或其他物质（如抗生素），应事先用无菌水润湿。 8.4 煮沸灭菌 8.4.1 某些培养基不能或不需要高压灭菌，可采用煮沸灭菌。例如：SC 肉汤等特定的培养基中含有对光和热敏感的物质，不宜使用高压灭菌； 8.4.2 煮沸灭菌后应迅速冷却，避光保存。 8.5 检查 在每次灭菌后，对培养基进行检查，包括：pH、色泽、灭菌效果和均匀度等指标。 9 保存 9.1 在避光、干燥条件下保存培养基和试剂，以保证其成分不会改变； 9.2 必要时，应将培养基和试剂置于（53）冰箱中保存。 注：对于自制培养基，通常建议平板不超过2周4周， 瓶装及试管装培养基不超过3个月6个月 ，除非某些标准或实验室能证明保质期比前述要求的更长。 10 性能测试 应按 DB51/T 2166 的要求对培养基和试剂进行性能测试，测试合格后方能使用。 11 使用 11.1 一般要求 11.1.1 使用前，应先取培养基和试剂平衡至室温，观察是否有颜色变化、蒸发（脱水）或微生物生长的情况，当发生这类变化时，应禁止使用； 11.1.2 培养时，应使培养物温度尽快与培养设定温度一致，并考虑空气流通要求。通常每垛最多堆放6 个平板，以保证平板间的空气流通；厌氧培养时，堆放平板数可以超过 6 个。 11.2 固体培养基 11.2.1 固体培养基的融化 采用下列方法融化固体培养基： a) 采用沸水浴中或采用有相同效果的方法（如高压锅中的层流蒸汽）使之融化； b) 经过高压的培养基应尽量减少重新加热时间，融化后避免过度加热； c) 融化后应短暂置于室温中（如 2 min）以避免玻璃瓶破碎； DB51/T 21652016 6 d) 融化后的培养基放入 4750的恒温水浴锅中冷却保温直至使用； 注1：可根据实际培养基凝固温度适当提高水浴锅温度； 注2: 培养基达到4750的时间与培养基的品种、体积、数量有关； 注3：敏感的培养基尤应注意，融化后保温时间应尽量缩短，如有特定要求可参考指定的标准。 e) 融化后的培养基应尽快使用，放置时间一般不应超过 4h； f) 一次未用完的培养基不能重新凝固留待下次使用。 11.2.2 培养基的脱气 按下列方法进行脱气： a) 必要时，将培养基在使用前放到沸水浴或蒸汽浴中加热 15 min； b) 加热时松开容器的盖子； c) 加热后盖紧，并迅速冷却至使用温度（如 FT 培养基）。 11.2.3 添加成分的加入 添加成分应满足下列要求： a) 热不稳定的添加成分应在培养基冷却至 4750时再加入； b) 无菌的添加成分在加入前应先放置到室温，避免冷的液体造成琼脂凝结或形成片状物； c) 缓慢充分混匀加入添加成分的培养基，尽快分装到待用的容器中； d) 含有活性化学物质或不稳定性成分的固体培养基也应即配即用，不可二次融化。 11.2.4 平板的制备和储存 按下列方法制备和储存平板： a) 倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成厚度至少为 3 mm； 注：直径90 mm的平皿，通常要加入18 mL20 mL琼脂培养基。 b) 将平皿盖好皿盖后放到水平平面使琼脂冷却凝固； c) 如果平板需储存，或者培养时间超过 48 h 或培养温度高于 40 ，则需要倾注更多的培养基； d) 若需倾注到样品，培养基温度应控制在约 45左右； e) 凝固后的培养基应立即使用，或置于密封袋中存放于暗处和（或）(53) 冰箱中， 以防其成分改变； f) 在平板底部或侧边做好标记，标记的内容包括培养基名称、制备日期和（或）有效期； 注：也可使用适宜的培养基编码系统进行标记； g) 储存前不要对培养基表面进行干燥处理； h) 将制备好的平板进行冷却后,放在密封的袋子中冷藏保存； 注：冷却是为了避免冷凝水的产生，冷藏可延长储存期限。 i) 对于采用表面接种形式培养的固体培养基，应先对琼脂表面进行干燥,干燥方式有如下两种： 揭开平皿盖，将平板倒扣于烘箱或培养箱中（温度设为 25 50 ）； 或放在有对流的无菌净化台中，直到培养基表面的水滴消失为止。 注：注意不要过度干燥，商品化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明使用。 12 弃置 所有污染和未使用的培养基的弃置应采用安全的方式，并且要符合相关法律法规的规定。 DB51/T 21652016 7 A A 附 录 A （资料性附录） 培养基的不正确配制出现的质量问题及原因分析 A.1 培养基的不正确配制出现的质量问题及原因分析见表A.1 表A.1 常见质量问题与解答 异常现象 可能原因 培养基不能凝固 制备过程中过度加热 低pH造成培养基酸解 称量不正确 琼脂未完全溶解 培养基成分未充分混合 pH不正确 制备过程中过度加热 水质不佳 外部化学物质污染 测定pH时温度不正确 pH计未正确校准 脱水培养基质量差 颜色异常 制备过程中过度加热 水质不佳 pH不正确 外来污染 脱水培养基质量差 产生沉淀 制备过程中过度加热 水质不佳 脱水培养基质量差 pH计未正确控制 原料中的杂质 培养基出现抑制低的生长率 制备过程中过度加热 脱水培养基质量差 水质不佳 使用成分不正确，如，成分称量不准，添加剂浓度不正确 制备容器或水中的有毒残留物 选择性差 制备过程中过度加热 脱水培养基质量差 配方使用不对 添加成分的加入不正确，例如加入添加成分时培养基过热或添加浓度错误 添加剂污染 污染 不适当的灭菌 无菌操作技术存在问题 添加剂污染 DB51/T 21652016 8 参 考 文 献 1 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 2 SN/T 1538.1 培养基制备指南实验室培养基制备质量保证通则 3 WS/T 232 商业性微生物培养基质量检验规程 _ DB51/T 21652016