高级微生物.pptx

基因突变在微生物研究基因突变在微生物研究中的应用中的应用基因突变是认识基因存在的前提基因突变是认识基因存在的前提基因突变是认识基因功能的基础基因突变是认识基因功能的基础任何一个基因的都是在发现其突变体后才被证实其存在；现代分子生物学可借助于分析DNA序列来确定基因，但是真正明确是否存在，仍然需要研究其突变与功能的关系。lacY与细菌促进扩散：温度敏感突变与细菌DNA复制：筛选到许多与细菌DNA复制有关的温度敏感突变菌株，至少可以分成十类，表明DNA复制至少有十种蛋白。基因突基因突变变可引入生化阻断，利于可引入生化阻断，利于阐阐明物明物质质代代谢谢途径途径基因突基因突变变是研究基因表达是研究基因表达调调控的主要手段之一控的主要手段之一许多细菌的代谢途径是通过筛选突变菌株阐明的典型的例子就是大肠杆菌乳糖操纵子的发现和阐明酶酶的体内功能需要用突的体内功能需要用突变变菌株来菌株来鉴鉴定定大肠杆菌DNA复制中有三种DNA聚合酶：I，II和III。体外检测发现他们都能催化DNA的合成。在大肠杆菌体内这三种酶的生物功能相同吗？如何研究它们各自的生物功能？DNA聚合酶I由polA编码，polA突变对细胞的生长和体内DNA合成无影响。DNA聚合酶III由polC编码。polC的温度敏感突变菌株，在高温时不能合成DNA，并对菌体致死。这说明DNA聚合酶I对大肠杆菌是非必需的，而聚合酶III对菌体是必须的。后来证明聚合酶I参与DNA损伤修复，而聚合酶III参与DNA的复制。大肠杆菌脂肪酸合成代谢中有两个长链酯酰ACP合成酶，均能参与长链酯酰ACP的延伸反应，分别由fabB和fabF编码。基因突变研究发现fabF突变后，菌体能生长；而fabB突变后，菌体为不饱和脂肪酸营养缺陷菌株。表明FabF与FabB的生理功能不同，FabB是不饱和脂肪酸合成的关键酶。体外生物化学的研究证明了这一点。总之，基因的功能研究离不开对突变菌株的研究，同突变菌株的研究也同样需要体外酶学分析。基因突基因突变变可用于蛋白可用于蛋白质质与蛋白与蛋白质质的相互作用的相互作用有两个基因a，b，分别编码：A蛋白与B蛋白。基因a突变造成细胞丧失某一功能。如果A和B是完成这一功能所必须的，也就是说如果A和B之间存在相互作用，那么就有可能在a基因的突变体中筛选到b基因的突变，并由于这一突变的出现，使菌体恢复某一功能。通过研究两者的突变位点，了解这两种蛋白的相互作用机制。基因突基因突变变可用于可用于鉴鉴定抗菌定抗菌药药物物物物质质作用的位点作用的位点利福平与依赖DNA的RNA多聚酶的亚单位牢固结合，抑制细菌RNA的合成，防止该酶与DNA结合，从而阻断RNA转录过程，使DNA和蛋白的合成停止利福平RNA聚合酶总总之，采用基因突之，采用基因突变变可以研究微生物的生可以研究微生物的生长长繁殖、物繁殖、物质质与与能量代能量代谢谢及其他生命及其他生命现现象象获得基因突变的方法获得基因突变的方法基因的随机突变梯度平板筛选抗药性基因突变微生物的自发突变率很低，在 10-5-10-10 之间。只有特殊情况时，直接筛选自发突变的菌株。如采用梯度平板法筛选细菌抗药性突变。诱变处理获得基因突变利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速高效的筛选方法从中挑选出少数符合目的的突变株。物理物理诱变剂诱变剂：紫外线、X射线、射线和快中子等。最常用是紫外线。化学化学诱变剂诱变剂：烷化剂、碱基类似物和吖啶类化合物。最常用的烷化剂有N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS)、甲基亚硝基脲(NMU)、硫酸二乙酯(DES)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙烷等。基因基因诱变诱变遵循的原遵循的原则则选择简便有效的诱变剂处理单细胞或单孢子悬液使每个被使每个被处处理的理的细细胞均匀接触胞均匀接触诱变剂诱变剂，防止，防止长长出不出不纯纯菌落。因此，在菌落。因此，在诱变诱变时选时选用用单单核核细细胞：放胞：放线线菌、霉菌菌、霉菌处处理分生理分生孢孢子；子；细细菌使用菌使用对对数期菌体；芽数期菌体；芽孢孢菌菌处处理芽理芽孢孢。通过预实验制定最适诱变剂量一般通一般通过计过计算致死效率来确定算致死效率来确定诱变剂诱变剂量。如制定量。如制定诱变剂诱变剂量量为为致死率达到致死率达到80的的诱变剂诱变剂量。量。物理物理诱变剂剂诱变剂剂量：量：强强度度时间时间，紫外，紫外线线强强度度单单位是位是尔尔格，格，X射射线单线单位是位是伦伦琴琴或拉得等。或拉得等。化学化学诱变剂剂诱变剂剂量：一定温度下量：一定温度下诱变剂浓诱变剂浓度和度和处处理理时间时间。设计高效的筛选方案根据研究目的根据研究目的设计筛选设计筛选方案。方案。化学诱变剂诱变的简便方法在平板涂布初发菌株；将诱变剂颗粒或沾有诱变剂溶液的滤纸片放在平板中央；适合温度，保温培养一定时间；收集抑菌圈周围的菌体；筛选目的突变株。采用转座子获得基因突变Tn10的随机突变Tn10及mini-Tn10Tn10为复合性转座子：长9.3kb；中央区编码四环素抗性基因；两侧为两个IS10。转座频率为10-8IS10两端有反向重复序列，是转座酶识别位点，中间编码转座酶，其中IS10L中的转座酶无活性。mini-Tn10：由IS10两端反向重复序列和中间的抗性基因组成，不编码转座酶，转座需要有其它元件提供转座酶，转座后稳定，不再次发生转座。ATS转座酶：在原有的转座酶基因中发生了两个突变，造成134和249位的半胱氨酸变成了酪氨酸，使得转座频率降低了3倍，但是转座的随机性增强。突变原理携带mini-Tn10的噬菌体感染受体大肠杆菌。在诱导时，发生转座，产生随机突变体库。递送载体：将mini-Tn10带入受体菌的噬菌体。一般使用b22（cI857 Oam29 Pam80）噬菌体为递送载体。特点：复制基因O和P中各有一个琥珀无义突变（am），使得噬菌体在非抑制菌中不能复制；cI基因为温度敏感突变cI1857，使得噬菌体DNA，在39不能发生整合；mini-Tn10插入此噬菌体；转座酶基因的表达受tac启动子控制。操作过程递送载体感染抑制大肠杆菌菌株，制备噬菌体裂解物。新制备的噬菌体裂解物感染非抑制大肠杆菌受体菌，40 培养。添加IPTG，诱导转座酶表达。筛选抗性菌株，获得随机突变体库。设计合适的方法，获得目的突变体。Tn5的随机突变与Tn10类似，为复合性转座子。中心区编码卡那霉素，新霉素，链霉素和博来霉素抗性基因，其中链霉素和博来霉素抗性基因在肠道细菌中不表达。两侧为插入序列IS50。右侧的IS50R编码转座酶基因和转座酶的一个抑制子，左侧的IS50L的转座酶基因无功能。人工构建的Tn5转座子转座体法人工体外构建携带Tn5转座酶识别位点的抗药性基因盒（有商品出售）；独立表达纯化Tn5转座酶（有商品出售）；体外使转座酶与抗药性基因盒结合；电激转化受体细菌，根据抗药性筛选转化子，得到突变体库；根据需要，设计筛选方法，获得目的突变菌株。通过Southern杂交，确定突变基因，或通过构建基因文库，获得突变基因。质粒拯救法人工体外构建携带Tn5转座酶识别位点、抗药性基因盒和R6Kori复制位点区的DNA片段。其它，操作方法与“转座体法”一样。得到突变菌株后，可以很快确定突变基因的部分序列。携带R6Kori复制位点的质粒复制时，需要有pir基因产物蛋白，也就是这样的质只能在染色体携带pir或pir-116的大肠杆菌菌株中复制，如S17-1。人工构建的携带R6Kori的Tn5转座子质粒拯救质粒拯救这两种方法也可用于大肠杆菌以外的细菌。自杀性质粒的随机突变自杀性质粒：pRL1063a质粒的复制子为ColE1的复制子，为狭宿主范围复制子，仅在大肠杆菌等少数细菌中复制。携带质粒转移识别位点oriT，通过接合可转移到大肠杆菌以外的细菌中。携带人工改造转座子Tn5，其上有荧光基因luxA和luxB；有质粒复制位点：oriV（p15A）。得到突变菌株后，也可以通过质粒拯救确定突变基因的部分序列。基因的定位突变对已知的基因进行敲除、插入、缺失和替换或进行基因融合的遗传操作，主要用于研究已知基因的生理功能。大肠杆菌的基因敲除：噬菌体Red重组酶系统利用噬菌体的Red重组系统进行同源重组，达到敲除靶基因的目的。质粒：pKD20和pKD46复制子为温度敏感型，在42很容易从宿主中丢失。质粒携带受阿拉伯糖启动子控制的噬菌体Red重组酶基因：exo、bet和gam。在阿拉伯糖诱导时产生重组酶，进行同源重组。菌株：DY330染色体上携带噬菌体Red重组酶基因：exo、bet和gam。为一个温度敏感菌株PCR扩增引物：以敲除大肠杆菌lacZYA为例。首先从网上下载包含lacZYA基因上下游200bp的DNA序列，使用DNA Star编辑DNA序列，共5579bp。用kan基因序列（从ATG到TAA，816bp）取代lacZYA（从Z的ATG到A的TAA），得到1216bp的DNA序列。从kan基因的ATG开始向下游取18bp，向上游取41bp，共59bp的DNA序列为上游引物。从kan基因终止密码子TAA开始，向上游取18bp，向下游取41bp，共59bp，做这序列的互补序列，并且头尾颠倒，得到下游引物。这样就保证了上下游引物中有41bp的序列与lacZYA的上下游同源。使用这对引物，以kan抗性基因为模板进行PCR扩增，得到PCR产物，使用DpnI内切酶处理产物，并纯化。使用电激法转化携带pKD46的大肠杆菌菌株或DY330菌株，经筛选获得突变菌株。大肠杆菌acpP温敏突变株的筛选错误倾向PCR重叠PCR其它革兰氏阴性细菌的基因敲除：pKmobsacB自杀质粒pKmobsacB使用ColE1的复制子oriV，携带RP4的转移位点oriT，携带枯草芽孢杆菌的果聚糖蔗糖酶基因sacB（负选择标记）。该质粒能在大肠杆菌中复制，并能通过细菌间的接合，转移进入其它革兰氏阴性细菌，但是由于不能复制，故用于革兰氏阴性细菌的基因敲除等操作。另外，携带sacB基因的革兰氏阴性细菌，不能在含有5以上蔗糖的培养基上生长，是一种负选择标记茄科雷尔氏菌fabG基因敲除：pKmobsacB铜绿假单胞菌acpP基因敲除：pKmobsacB载体构建突变菌株筛选载体构建铜绿假单胞菌acpP基因替换：pKmobsacB载体构建突变菌株筛选革兰氏阳性细菌的基因敲除：pORI280乳酸乳链球菌自杀性质粒：pOR280，使用乳酸菌质粒pWV01的复制子，但是不携带repA基因，因此，在乳酸球菌中不复制，遗传操作只能在专用大肠杆菌菌株EC1000中进行。该质粒携带红霉素抗性基因，携带由乳酸菌p32启动子控制的lacZ基因，在含有X-gal的培养基上为蓝色。携带外源DNA片段的质粒通过电激转化进入受体菌，发生一次重组后，菌株在平板上显蓝色，二次重组后，菌株显白色，通过PCR筛选突变菌株。乳酸乳链球菌fabH基因的缺失突变利用反义RNA构建突变菌株金黄色葡萄球菌fabI突变株表达载体：pYH4，有两个复制子：pUC18的复制子保证此载体能在大肠杆菌中复制；pE194复制子保证质粒在金黄色葡萄糖菌中复制。该载体携带四环素抗性基因表达调控元件，外源基因的表达受四环素诱导。构建反义RNA时，外源基因反向接入多克隆位点。反义RNA载体突变菌株突变菌株Nouthern杂交基因的定点突变定点突变是对DNA序列的个别核苷酸进行针对性的突变。它可以是核苷酸的置换、插入或缺失。依赖于PCR的基因定点突变方法1：质粒整体PCR以携带目的基因质粒载体为模板，设计互补的突变引物，使用高保真的DNA聚合酶，进行长链PCR。产物经DpnI酶切处理后转化大肠杆菌菌株。基本要求质粒模板要求从携带DNA甲基化酶野生基因（dam）的大肠杆菌中提取。使用一对完全互补的引物，此对引物与目的基因的特定区域能够配对；引物长度一般为25-45bp；将要突变的位点设计在引物中间，3端的碱基一般为G或C。方法2：DNA片段重叠PCR设计2对引物，其中1对为突变互补引物。以目的基因为模板，PCR分别扩增，得到两个带有点突变的DNA片段，然后以得到的两个DNA片段为模板，进行重叠PCR扩增，得到突变基因片段。依赖于错误倾向PCR的基因突变采用改变PCR反应体系中四种核苷酸浓度比例、镁离子浓度和使用保真性差的DNA聚合酶等措施，增加目的基因突变率，进而获得目标基因突变的技术。突变菌株的筛选突变菌株的筛选突变菌株筛选的一般方法突变菌株富集的方法淘汰经突变处理的微生物群体中的野生型菌体，使突变型菌株得到浓缩，以便筛选得到突变菌株。主要根据突变菌株和突变菌株的生长差异，设计合理的方法，最大可能地将野生菌株杀死，保留突变菌株。青霉素浓缩法：青霉素只能杀死生长繁殖的细菌，不能杀死停止分裂的细菌，通过处理便可以使突变菌株得到富集。5-溴脱氧尿苷浓缩法：在DNA复制时，5-溴脱氧尿苷替代胸腺嘧啶脱氧核苷掺入DNA分子中，但是携带5-溴脱氧尿苷的DNA对紫外线十分敏感。不生长的细胞，DNA不复制，5-溴脱氧尿苷也不能掺入DNA，在接触紫外线时能够存活下来。差别杀菌法：主要有菌丝过滤、高温法等。同位素自杀浓缩法：经同位素（如3H，35S和32P）标记的细菌细胞，在处于生长状态时，同位素发生衰变，产生-射线，能将处于生长状态的细菌杀死，而突变菌株不能将吸收同位素，且在一定条件下不能生长，从而免于死亡。主要用于一些大分子代谢突变菌株的筛选，如蛋白合成和DNA复制等；有时也用于某些温度敏感突变菌株的筛选。突变菌株筛选的方法不同的突变菌株，筛选方法不同，没有统一的方法，只能根据研究的要求进行筛选。鉴别培养法虽然野生菌株和突变菌株在一定的培养基上均能生长，但是通过菌落形态或颜色变化很容易区分突变菌株和野生菌的方法。麦康凯琼脂培养基培养基成份：蛋白胨，中性红（细菌染色剂），结晶紫（抑制革兰氏阳性细菌），胆盐（抑制革兰氏阳性细菌，同时参与pH依赖的颜色变化）和某种碳水化合物。特性：利用碳水化合物的细菌在这种培养基上形成红色菌落，在发酵力强的细菌菌落周围有胆盐沉淀；不能够利用碳水化合物的细菌形成无色菌落。可用于糖类代谢的研究。四氮唑培养基以营养琼脂为基础，添加氯化三苯四氮唑(TTC)。氧化型TTC是水溶性的，无色；还原型TTC是水不溶性的，暗红色。TTC能够被有代谢活性的细菌还原；低pH值可抑制还原型TTC的产生。可利用碳水化合物的细菌，产生酸，故TTC可以将利用和不利用碳水化合物的细菌区别开来，即利用碳水化合物的细菌形成无色菌落，而不利用的菌落形成红色。因此，此种培养基也可以用于碳水化合物代谢突变菌株的筛选。正向选择培养法在实验条件下，突变菌株能够生长，而野生菌株不能生长的筛选方法。此方法常用于细菌抗药性突变菌株的筛选。正向选择也可用于物质转运和物质代谢调控等方面突变菌株的筛选。如对某种氨基酸结构类似物的抗性菌株，往往是该种氨基酸转运缺陷的突变菌株。另外从鼠伤寒沙门氏菌5,5,5-三氟亮氨酸抗性突变菌株中，曾筛选到亮氨酸合成抗反馈和抗阻遏的突变菌株，它们的亮氨酸产量比野生菌明显提高。在以癸酸唯一碳源的培养基上，涂布大肠杆菌，可得到能利用短链脂肪酸的突变菌株，经鉴定，这种突变株是fadR突变株。负向选择培养法这是一种筛选突变菌株最常用的方法。多用于条件致死突变菌株的筛选。如营养缺陷型菌株、温度敏感突变菌株。根据研究目的，设计的一种使野生菌株生长，而突变菌株不能生长的培养条件，用于区分野生菌株和突变菌株，从而得到目的突变株的筛选方法。影印技术将诱变处理过的菌体涂布在能使野生菌株和突变菌株均能生长的培养基上或置于两者均能生长的培养条件下，制备母板。然后用无菌的丝绒布制作印章，并将母板上的菌落对应地引印到区分野生菌和突变株的平板上，或将引印的两平板置于区分野生菌和突变株的培养条件下培养，根据两平板上菌株生长情况确定突变菌株。影印技影印技术术条件致死突变菌株的筛选对于众多生长必须基因，突变会造成菌体死亡。研究这些基因的生理功能理想的策略是能获得条件致死突变菌株，最常用的是温度敏感突变菌株。条件致死突变菌株的获得没有统一的方法，筛选策略只能根据基因本身的特性设计，但是一般使用化学或物理诱变剂处理微生物。大肠杆菌DNA复制突变菌株的筛选：温度敏感突变菌株30，选用适当的化学或物理诱变剂处理大肠杆菌；30培养经诱变处理的菌体；在42使用3H标记的胸腺嘧啶核苷富集突变菌株；30培养富集后的菌体；采用影印技术，将菌体转印到两个平板上，并分别置于30和42培养；选取30能正常生长，而42不能生长的菌株，进行进一步的鉴定，确定是否为DNA复制的突变菌株。