DB51∕T 2469-2018 鲟鱼海豚链球菌病诊断技术规程(四川省).pdf

1 ICS 65.150 B 52 DB51 四川省地方标准 DB51/T 24692018 鲟鱼海豚链球菌病诊断技术规程 2018 - 04 - 18 发布 2018 - 05 - 01 实施四川省质量技术监督局 发 布 DB51/T 24692018 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 试剂和材料 . 1 5 设备和器械 . 2 6 临床检查 . 2 7 实验室样品采集 . 2 8 细菌分离与纯化 . 2 9 细菌鉴定 . 2 10 结果判定 . 4 11 综合判定 . 5 附录 A（规范性附录） 试剂配方. 6 附录 B（资料性附录） 海豚链球菌 lctO 基因参考序列（870bp） . 9 DB51/T 24692018 II 前 言 本标准依据 GB/T 1.12009 给出的规定进行编写。 本标准中附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川农业大学。 本标准起草人：耿毅、郑李平、黄小丽、陈德芳、欧阳萍、雷雪平、曹师琪。 DB51/T 24692018 1 鲟鱼海豚链球菌病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了鲟鱼海豚链球菌病诊断的术语与定义、试剂和材料、设备和器械、临床检查、实验室样品采集、细菌分离与纯化、细菌鉴定、结果判定和综合判定等技术规程。 本标准适用于施氏鲟 (Acipenser schrenckii) 、西伯利亚鲟 (Acipenser baerii) 、俄罗斯鲟 ( Acipenser gueldenstaedtii ) 等鲟鱼海豚链球菌病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于文件的应用时必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检测 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 18652 致病性嗜水气单胞菌检测方法 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7201.1 鱼类细菌病检疫技术规程 第1部分：通用技术 3 术语和定义 下列术语和定义适用于此文件。 3.1 鲟鱼海豚链球菌病 指由海豚链球菌(Streptococcus iniae)感染引起的鲟鱼发病或死亡的一种细菌性疾病。 3.2 BHI Brain Heart Infusion 脑心浸液琼脂培养基。 3.3 基因 lctO lactate oxidase 乳酸氧化酶基因。 4 试剂和材料 4.1 试剂、染色液与培养基 DB51/T 24692018 2 按 GB/T 4789.28、GB/T 18652、SC/T 7014 规定执行。Taq酶、dNTPs、10PCR缓冲液（无Mg2+ ）、DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒等选用专业试剂公司提供的商品化试剂，上述未提及的见附录A。 4.2 水 应符合 GB/T 6682 中一级水的规定。 4.3 引物 lctO基 因 序 列 扩 增 引 物 ， P1-F ： 5-AAGGGGAAATCGCAAGTGCC-3, P2-R ： 5-ATATCTGATTGG GCCGTCTAA-3 - 20保存。 5 设备和器械 主要设备与器械如下： 解剖盘、剪刀、镊子、手术刀、培养皿、铂耳、酒精灯、普通光学显微镜、电子天平、高压灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台、普通冰箱、高速冷冻离心机、微量移液器、PCR扩增仪、离心管和PCR管、水平电泳系统和凝胶成像系统等。 6 临床检查 6.1 临床症状 病鱼摄食减少或停止摄食，体色发黑，游动缓慢，偶见间隙性的狂游或旋游。 6.2 外部检查 病鱼体表、胸鳍基部、口腔周围出血，肛门红肿，外突；部分病鱼腹部膨大，体表出现溃疡，或无明显外部病变。 6.3 剖检 肝肿大，发黄，质地变脆，或弥散性出血，呈花斑状；脾、肾肿大，呈紫色；肠道充血，肠壁变薄，肠腔内充满黏液；脑肿胀，脑膜淤血；部分病鱼腹腔内积有淡红色腹水；鳃与其他组织无明显病变。 7 实验室样品采集 样品采集按 SC/T 7103 的规定执行。 8 细菌分离与纯化 在无菌的环境中， 从病鱼的肝、 肾及脑中直接取样， 按常规法划线接种脑心浸液琼脂培养基 （Brain Heart Infusion, BHI）（A.1）。28培养36h48h后，挑取表面光滑、微隆起、针尖大小、边缘整齐的淡黄色优势菌落划线接种在BHI平板进行纯化培养。 9 细菌鉴定 DB51/T 24692018 3 9.1 革兰氏染色 按 GB/T 4789.28 中2.2的规定执行。 9.2 生理生化试验 9.2.1 精氨酸双水解酶试验 将待检菌穿刺接种在精氨酸双水解酶培养基（A.2）上。28培养48h。菌落周围培养基出现粉红色晕圈为阳性，无粉红色晕圈为阴性。 9.2.2 七叶苷水解试验 将待检菌接种于七叶苷培养基平板（A. 3）上，35培养24h。培养基变黑为阳性；不变为阴性。 9.2.3 氧化酶试验 以毛细管吸取四甲基对二苯胺的1水溶液滴在细菌的菌落上。菌落呈玫瑰红色、深紫色为阳性；不变色为阴性。 9.2.4 马尿酸钠水解试验 将0.4ml待检菌液加1%马尿酸钠水溶液混合后，35培养2h；加入0.2ml茚三酮试剂（A. 4）振摇，观察颜色变化。出现紫色为阳性；无颜色改变为阴性。 9.2.5 过氧化氢酶试验 按 SC/T 7014 中表2的规定执行。有气泡产生为阳性；无气泡产生为阴性。 9.2.6 乙酰甲基甲醇（V-P）试验 按SC/T 7014表2的乙酰甲基甲醇（V-P）试验的规定执行。培养基下层出现红色为阳性，不出现红色为阴性。 9.2.7 糖、醇类（L阿拉伯糖、菊糖、核糖、乳糖、D-甘露醇、山梨醇）发酵试验 将待检菌穿刺接种于糖、醇类发酵试验培养基（A. 5），28培养24h后观察。培养基变黄为阳性，不变黄为阴性。 9.3 lctO 基因特异性鉴定 9.3.1 细菌基因组 DNA 提取 取2mL待检菌培养液，12000 r/min离心1min，收集菌体； 菌体悬浮于500L TE缓冲液（pH8.0） （A. 6），震荡悬浮，加入50L 10的SDS溶液（A. 7），10L 20mg/mL的蛋白酶K（A. 8），混匀，37温育1h；加入100L 5mol/L的NaCl溶液（A. 9），充分混匀，再加入100L CTAB/NaCl溶液（A. 10）混匀，65温育20min；加入等体积的酚氯仿异戊醇（25:24:1）（A. 11），混匀，12000 r/min离心5min；取上清液加入等体积的氯仿异戊醇（24:1）（A. 12），混匀，12000 r/min离心5min；取上清液，加入1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静置10min，10000 r/min离心10min；沉淀用70酒精洗涤2次，室温晾干；加入50L的TE缓冲液溶解，-20贮存，备用。 9.3.2 lctO 基因 PCR 扩增 DB51/T 24692018 4 PCR 体系： 在PCR管中加入10PCR缓冲液 （无Mg2+ ） 5.0L， MgCl2（25mmol/L） 5.0L， dNTPs（10mmol/L）1.0L，引物(20mol/L)P1-F和P1-R各1.0L，Taq DNA酶（5U/L）0.5L，DNA模板1.0L，无菌双蒸水补足至50L。混匀后，3000 r/min离心30s。设空白对照，空白对照取等体积的双蒸水代替DNA模板。 PCR扩增程序：94 预变性5min；94变性30s，54退火30s，72延伸1min，共30个循环；72延伸5 min；4保温。 9.3.3 琼脂糖凝胶电泳 用TAE电泳缓冲液（A. 13）配制1的琼脂糖平板，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将上述6L样品和2L溴酚蓝指示剂溶液（A. 14）混合后加入样品孔，使用DNA分子量标准参照物作对照。120V电泳约20min，当溴酚蓝到达底部时停止，于紫外光下观察约870bp的目的条带。 9.3.4 PCR 扩增产物纯化、测序及序列比对 9.3.4.1 PCR 扩增产物纯化 9.3.4.1.1 在长波紫外灯下用刀片切下含目的条带（约 870bp）的胶块，放入无菌离心管中称重； 9.3.4.1.2 按每 0.1g 琼脂糖凝胶加 0.1mL 酚， 将酚加入 9.3.3 含有目的条带胶块的离心管中， 漩涡震荡仪震荡 1min-2min，将离心管在-70放置 1h，使凝胶完全冻结； 9.3.4.1.3 37水浴将冻结的凝胶融化后，在漩涡震荡仪上震荡 1min2min；14000r/min 离心 5min，取上层水相转入另一个离心管中， 加入等体积的酚氯仿异戊醇 （25:24:1）（A. 11） ， 混匀， 12000r/min离心 5min； 9.3.4.1.4 取上清液加入等体积的氯仿异戊醇（24:1）（A12），混匀，12000r/min 离心 5min； 9.3.4.1.5 向收集的水溶液中加入 1/10 体积的 3mol/L 的乙酸钠和 2 倍体积的无水乙醇， -20过夜或-70放置 1h2h； 9.3.4.1.6 14000r/min 离心 10min，弃上清，将沉淀的 DNA 溶于适当体积的 TE 缓冲液（A. 6）中，置-20保存，待测。 9.3.4.2 PCR 扩增产物测序与同源性分析 将9.3.4.1纯化的PCR扩增产物进行序列测定，并与参考序列（附录B）进行比对分析。 10 结果判定 10.1 菌落形态 28培养36h-48h，形成表面光滑、微隆起、针尖大小、边缘整齐的淡黄色菌落。 10.2 细菌染色 革兰氏染色为阳性，成双或链状排列的球状细菌。 10.3 生理生化试验 生理生化反应试验结果见表1。 DB51/T 24692018 5 表1 鲟鱼海豚链球菌的生理生化反应结果 反应项目 结果 反应项目 结果 反应项目 结果 精氨酸 - 过氧化氢酶 - 核糖 - 七叶苷 + V-P - 乳糖 - 氧化酶 - L-阿拉伯糖 - D-甘露醇 + 马尿酸钠 - 菊糖 - 山梨醇 - 注： “+”为阳性， “-”为阴性。 10.3.1 lctO 基因 DNA 序列测定和同源性分析 测定的lctO基因DNA序列与附录所列的基因序列进行比对，同源性达98%以上。 11 综合判定 符合以下所有特征者判定为鲟鱼海豚链球菌病： a) 临床症状与 6 相符； b) 菌落形态和染色观察与 10.1 和 10.2 相符； c) 生理生化反应结果与 10.3 相符； d) lctO 基因序列测定和同源性分析结果与 10.4 相符。 DB51/T 24692018 6 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂配方 A.1 脑心浸液琼脂 蛋白胨 10.0g 脱水小牛脑浸粉 12.5g 脱水牛心浸粉 5.0g 氯化钠 5.0g 葡萄糖 2.0g 磷酸氢二钠 2.5g 琼脂粉 20g 加热搅拌溶解于1000ml蒸馏水中,121灭菌15min，倒平板。 A.2 精氨酸双水解酶培养基 蛋白胨 1g NaCl 5g K2HPO4 0.3g 酚红 0.01g 琼脂 6g L-精氨酸盐 10g 蒸馏水 1000mL pH7.0-7.2，分装试管，培养基高度约4.5cm，121灭菌15min。 A.3 七叶苷水解试验 蛋白胨 5g 七叶苷 3g K2HPO4 1g 枸橼酸铁 0.5g 琼脂 15g 蒸馏水 1000Ml A.4 茚三酮试剂 3.5g茚三酮溶于100ml丙酮、丁醇混合液（1:1）中。 A.5 糖、醇类发酵培养基 DB51/T 24692018 7 蛋白胨 2g NaCl 5g K2HPO4 0.2g 被测糖或醇类 10g 琼脂 6g 溴百里酚蓝1水溶液 3mL （溴百里酚蓝先用少量95乙醇溶解后，再加水配制1的水溶液） 蒸馏水 1000mL pH7.0-7.2，分装试管，培养基高度约4.5cm，115灭菌20min。 A.6 TE缓冲液（pH8.0） 将0.121g Tris碱（分子量121.1），0.0372g乙二胺四乙酸二钠（分子量372.24）加入80mL双蒸水中，加浓盐酸调节pH至8.0，加双蒸水定容至100mL，室温保存。 A.7 10SDS溶液 将10g十二烷基硫酸钠加入80mL双蒸水中， 加热至68助溶， 再加入双蒸水定容至100mL， 室温保存。 A.8 蛋白酶K（20mg/mL） 将蛋白酶K溶解于双蒸水中，至终浓度20mg/mL，分装入小管，置-20保存。 A.9 5mol/L的NaCl溶液 将29.22g NaCl（分子量58.44）溶解于80mL双蒸水中，再加双蒸水定容至100mL，室温保存。 A.10 CTAB/NaCl溶液 4.1g NaCl溶解于80mL双蒸水中，缓慢加入10g CTAB，再加双蒸水定容至100mL，室温保存。 A.11 酚氯仿异戊醇（25241） 将25体积的酚、24体积的氯仿和1体积的异戊醇混合即可，室温贮存于不透光的瓶中，上面加上TE缓冲液，4保存。 A.12 氯仿异戊醇（241） 将24体积的氯仿和1体积的异戊醇混合即可，室温贮存于不透光的瓶中。 A.13 50TAE电泳缓冲液 在400mL双蒸水中溶解121g Tris碱，加入28.55mL冰乙酸和50ml 0.5/L EDTA。再加双蒸水定容至500mL，室温保存。使用时，配成1TAE电泳缓冲液。 DB51/T 24692018 8 A.14 溴酚蓝指示剂溶液 6上样缓冲液 将溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜。待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至50mL，加入NaOH溶液1滴，调至蓝色。 DB51/T 24692018 9 B B 附 录 B （资料性附录） 海豚链球菌 lctO 基因参考序列（870bp） 1 aaggggaaat cgcaagtgcc aaaggtgtta aagaatttgg aacaatctat acaaccagtt 61 cttattcaac aactgattta cctgaaattt cacaaacact tggtgattca ccacattggt 121 tccaattcta ttatagtaaa gatgatggta ttaacagaca catcatggac cgtttgaaag 181 ctgaaggggt aaaatcaatt gtcctaacag ttgatgcgac agttggtgga aaccgtgaag 241 ttgataagcg taatggcttt gttttccctg ttggaatgcc aattgttcaa gagtatctcc 301 caaatggggc aggaaaaaca atggactatg tttataaagc tactaaacaa gccctatcac 361 caaaagatgt tgaatacatt gcacaatatt caggcttgcc tgtatatgtt aaagggccac 421 aatgtgcaga agatgccttt cgtgctttag aagctggagc ttcaggaatt tgggtaacga 481 atcatggtgg ccgtcaatta gatggtggtc cagcagcctt tgattctctc caagaagttg 541 ctgaagctgt tgatcgccgt gtaccaattg tctttgattc tggtgtgaga cgcggacaac 601 atgtctttaa agccttagca tctggtgcag atcttgtagc acttggccgt cctgttattt 661 acggcttagc aatgggtggt agcgtaggaa cacgtcaagt ctttgaaaaa attaatgatg 721 aacttaaaat ggttatgcaa ttagctggta cacaaaccat cgacgatgtt aaacatttta 781 aattgcgtca taacccatat gattcttcca ttccatttag cccaaaatgc tttaaaatta 841 gattaatctt tagacggccc aatcagatat _ DB51/T 24692018