生物制药工艺技术基础.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 生物制药工艺技术基础,第一节 生化制药工艺技术基础,由人体组织起源生化药品含有,疗效好,，几乎,无副作用,独特优点。,但,因为以人体组织提供原料受到法律或伦理方面严格限制,，所以有许多,人源性,生化药品已更多地采取,生物工程技术,生产。,当前已生产应用制品主要有,血液制品类、人胎盘制品类和人尿制品类,。,动物起源,生化药品是天然生化药品,主要品种,，它含有原料起源丰富、价格低廉，便于,综合利用和批量生产,优点。,第1页,但因为提供原料动物,种族差异较大,，所以对,原料品质,和,制品质控,要比普通药品更为严格。,植物起源,生化药品品种正逐年增加，如,酶、蛋白质 多糖和核酸,等。,海洋生物起源,生化药品是发展最快一大类生化药品。海洋生物种类繁多，是丰富,药品资源宝库,，含有很大发展潜力。,第2页,一、生物材料与生化活性物质,（一）生化制药生物材料起源,供生产,生化药品,生物资源主要有,动物、植物、海洋生物和微生物组织、器官、细胞与代谢产物,。应用,动、植物细胞培养与微生物发酵技术,也是取得,生化制药原料,主要路径。,基因工程技术与细胞工程技术和酶工程技术,更是开发,生化制药资源,新路径,。,第3页,1、动物脏器,以,动物组织器官,为原料能够,综合利用制备100各种,生化药品。动物组织器官主要起源是猪，其次是牛、羊、家禽和鱼类等,脏器,。,l）胰脏,胰脏是动物体内不可替换,实质性腺体之一,。它兼有其它器官所没有,内分泌和外分泌,两种功效。,2）脑,脑组织富含脂质。脑组织中,脂类,占13.5，,蛋白质,占810，还有,少许黏多糖,脑组织中,主要脂类物质,是,脑磷脂、肌醇磷脂、神经磷脂、脑苷脂、神经节苷脂和胆固醇,。还有,神经递质和各种神经肽,。,第4页,（3）胃黏膜,胃是动物,消化器官,，主要分泌,消化液,、,胃黏膜,。,（,4）肝脏,肝脏是机体内最大不可替换,实质性腺体,，是机体“生化反应器”。肝脏含有,复杂酶系,，已知肝脏酶达,数百种,，有些是其它组织所没有或者含量极少。,如,鸟氨酸氨基甲酰转移酶,仅存在于肝细胞微粒体中。肝脏还含有,不饱和脂肪酸、磷脂类和胆固醇,。肝脏富有,肝糖原及维生素A、D、E、B12,等。,第5页,（5）脾脏,脾脏是体内,最大免疫器官,，已用于生产药品有,脾水解物，脾RNA和脾转移因子,。人脾混合,淋巴因子制剂,对原发性肝癌含有良好疗效。,（6）小肠,小肠是,消化和吸收,主要场所，含有丰富,淋巴组织和各种内分泌细胞,。,（7）脑垂体,脑垂体是主要,内分泌腺体,，由两部分组成：,脑垂体（前叶）,包含远侧部、结节及中间部；,神经垂体（后叶）,包含神经部及漏斗部。,垂体激素,品种不少于,10种,。,（8）心脏,心脏含有丰富,糖原、激素和酶类,。,第6页,其它动物脏器,如,肺、肾、胸腺、肾上腺、扁桃体、甲状腺、睾丸、胎盘、羊精囊、气管软骨、眼球、鸡冠,等也都是主要生物制药原料。,2、血液、分泌物和其它代谢物,血液约,占体重610,，,血液中水分占80，干物质占20,。血液资源丰富，可用于生产药品、生化试剂、营养食品、医用化装品及饲料添加剂等。,尿液、胆汁、蛇毒、蜂毒,等也是主要生物材料。,第7页,3、海洋生物,海洋生物是开发防治常见病、多发病和疑难病药品,主要生物材料,。主要有：,（1）海藻,海藻是海洋,水生植物类,，分绿藻门、褐藻门、蓝藻门、红藻门、甲藻门等,10门，共10000各种,。,（2）腔肠动物,腔肠动物是原始多细胞动物，,有9000各种。,（3）节肢动物,节肢动物门中一些甲壳动物可供药用。,甲壳动物有25 000各种。,第8页,（4）软体动物,软体动物,有80 000种,，包含螺、蚌类和乌贼等。,（5）棘皮动物,棘皮动物,有6000各种,，包含海星、海胆、海参。,（6）鱼类,鱼类,有0各种,，可制造各种药品。,（7）爬行动物,爬行动物多数为,陆生脊椎动物,。海生主要有海蛇、海龟等。,（8）海洋哺乳动物,用鲸鱼和海豚类,脏器和腺体,已制成各种药品。,其它,海洋生物,还有,步骤、海绵、扁形、纽形、两栖,等也都是主要生物材料。,第9页,4、植物,药用植物品种繁多，除含有,生物碱、强心苷、黄酮、皂苷、挥发油、树脂、鞣质等有效药理成份外,，还含有氨基酸，蛋白质、酶、激素、糖类、脂类、维生素类等众多生化成份。,由植物材料寻找有效生物药品已逐步引发重视，品种逐年增加，以及各种,蛋白酶抑制剂,。,第10页,5、微生物,微生物资源非常丰富，已研究品种仅占自然界中微生物,总数10左右,。微生物代谢物有,1300各种,，已大量生产才,近百种,。,微生物酶有几千种,，已被应用才几十种，可见其应用前景很大。,（1）细菌,惯用细菌,发酵法生产,。主要发展领域有：,氨基酸,。,有机酸,。,糖类。,第11页,核苷酸类,。,维生素,。用细菌可制取,各种维生素如VB,1,、YB,2,、VB,6,、烟酸、生物素,等。,酶,。,（2）放线菌,放线菌是最主要抗生素产生菌，己有,1000各种抗生素约23产自放线菌,。其代谢产物也是主要生物制药资源。,氨基酸。,核苷酸类。,第12页,维生素,。利用放线菌可产生维生素B12、B族维生素、胡萝卜素、蕃茄素及食品染料。,酶。,放线菌能产生众多品种酶。,（3）真菌,酶,有机酸,。,氨基酸,。,核酸及其相关物质。,维生素。,促生素。多糖。,第13页,（4）酵母菌,维生素。,蛋白质与多肽。,核酸。,6、开发生物新资源,（1）动植物细胞大规模培养,利用动植物细胞大规模培养产生生物药品是,细胞工程技术,一大应用领域。,（,2）应用基因重组技术建立“工程菌”或“工程细胞”，,使所需要基因在宿主细胞内表示，制造各种生物活性物质，是生物制药工业主要发展领域。,第14页,（二）生物材料准备,1、生物材料选择,生化药品生产原料,选择标准,是：有效成份,含量高，原料新鲜、无污染,；,起源丰富、易得,；原料产地较近，价格低廉；原料中杂质含量少，,便于分离纯化,等。,（1）有效成份含量,生物品种,依据,目标物,分布，选择,富含有效成份,生物品种是选材关键。,第15页,适当组织器官。,另外动物,年纪、性别、营养情况、产地、季节,对活性物质含量也有影响。植物原料要注意,采集地点、季节,，微生物原料要注意其,对数生长久时间,与活性成份关系,。,（2）杂质情况,选材时,，应防止,与目标物性质相同杂质,对纯化过程,干扰。,（3）起源,应选取起源丰富材料，尽可能不与其它产品争原料，最好能,一物多用，,综合利用,。,第16页,2、生物材料,采集、预处理与保留,生物材料采集时必须确保环境卫生符合要求，并尽力保持原材料,新鲜，预防腐败、变质与微生物污染。,生物材料采摘选取后，必须,快速及时速冻，低温保留，预防生物活性成份变性、失活,，,酶原提取要及时进行，预防酶原激活转变为酶,。,植物原料,采集后可就地,去除不用部分,，,将,有用部分保鲜处理,。,搜集微生物原料时，要及时将菌体细胞与培养液分开，,依据有效成份存在部位及时进行保鲜处理。,第17页,生物材料保留方法,主要有：,冷冻法。,本法适合用于全部生物材料。,普通先速冻后置于,40处低温保留,。,有机溶剂脱水法,，,惯用有机溶剂,是,丙酮,。,防腐剂保鲜法,。,惯用,乙醇、苯酚,等。,二、生化活性物质提取,（）生化活性物质惯用提取方法,1、酸、碱、盐水溶液提取法,第18页,2、表面活性剂提取法与反胶束提取法,表面活性剂,分子兼有,亲水与疏水基团,，分布于,水油界面,时有,分散、乳化和增溶作用,。,生物提取,惯用,表面活性剂,，其,HLB,多在,1020,之间。,在,适当pH及低离子强度,条件下，,表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜渗透性改变或使之溶解,。,第19页,反胶束也称为反胶团,。反胶束是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成,纳米尺度,一个,聚集体。反胶束系统,作为,液液萃取方法，更具选择性,。,此法优点是使,热敏感性,，亲水蛋白质在一个近似水相环境中被提取出来，,最大程度地保持了蛋白质生物活性,，蛋白质经过,中间反胶束,从一个主体相中转移到另一个水相中，并在,瞬间完成,。,第20页,3、有机溶剂提取,用有机溶剂提取生化物质可分为,固液提取和液液提取（萃取）,二类。,（1）固液提取,在生物制药中惯用有机溶剂有,甲醇、乙醇、丙酮、丁醇等极性溶剂,以及,乙醚、三氯甲烷、苯等非极性溶剂,。,极性溶剂现有亲水基团又有疏水基团，从广义上说，也是一个表面活性剂。,甲醇、乙醇、丙酮,能同水混溶，同时又有较强亲脂性，对一些蛋白质、类脂起,增溶作用,，,乙醚、三氯甲烷、苯,是,脂质化合物良好溶剂,。,第21页,在选取有机溶剂时普通,采取“相同相溶”标准,。,丁醇在水溶液中,解离脂蛋白能力更强,。,在生化物质提取前，有时还用丙酮处理原材料，,制成“丙酮粉”,，其作用是使材料,脱水，脱脂，使细胞结构涣散,，增加了一些物质稳定性，便于贮存和运输。,有机溶剂,既能抑制微生物生长和一些酶作用,，也能,阻止大量无关蛋白质溶出,，有利于深入纯化。,第22页,（2）液液萃取,液液萃取,是利用溶质在两个互不混溶溶剂中溶解度差异将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移操作。,影响液液萃取原因主要有目标物在两相,分配比（分配系数）和有机溶剂用量,等。,第23页,溶剂萃取注意事项：,（1）pH,在萃取操作中正确选择pH很主要。,所以，,酸性物质在酸性条件下萃取，碱性物质在碱性条件下萃取,，对氨基酸等两性电解质，则采取,pH在等电点,时进行提取很好。,（2）盐析,加入中性盐如硫酸铵、氯化钠等能够使一些生化物质溶解度降低，这种现象称作,盐析,。,在提取液中加入中性盐，能够促使生化物质转入有机相从而,提升萃取率,：,盐析作用,也能,降低有机溶剂在水中溶解度,，使提取液中,水分含量降低,。,第24页,（3）温度,普通,在室温或低温下,进行萃取操作。,（4）乳化,液液萃取时，常发生,乳化作用,。,去乳化惯用方法,有：,过滤与离心,；,轻轻搅动,；,改变两相百分比,；,加热；加电解质,；,加吸附剂（如碳酸钙）,等。,液液萃取时溶剂选择,要注意以下几点：,（1）选取溶剂必须含有,较高选择性,。,（2）选取溶剂，,溶质与溶剂要轻易分离与回收。,第25页,（3）两种溶剂,密度相差不大时，易形成乳化,，选溶剂时应注意。,（4）要选取,无毒，不易燃烧价廉易得,溶剂。,4、双水相萃取法,双水相系统是,两种亲水性聚合物,都加在一个水溶液中，当超出某一浓度时，就会产生两相，,两种聚合物分别溶于互不相溶两相中,。,其操作是向水相中加入溶于水高分子化合物，如,聚乙二醇（PEG）或葡聚糖,，能够形成,密度不一样两相,（有时甚至是多相），因两相都含有较多水，所以称为,双水相,，惯用双水相系统为,PEG葡聚糖和PEG无机盐,两种，后者应用更广泛。,第26页,普通认为，成相是因为,聚合物之间不溶性,，即,聚合物分子空间妨碍作用，无法相互渗透,，不能形成均一相，从而含有相分离倾向。,如用等量11右旋糖酐溶液和0.36甲基纤维素溶液混合，静止后，产生两相，,上相中,含右旋糖酐0.39，含甲基纤维素0.65，而,下相中,含右旋糖酐1.58，含甲基纤维素0.15。,第27页,5、超临界萃取技术,超临界流体萃取技术,优点是节能，对生化活性物质,不产生热变性作用,，可使用,生理惰性溶剂,在低温下分离活性组分。,当在某一温度和压力时，,气体和液体物理特征,就会趋于相同。两相变为一相，此时称为,临界点,，物质临界点常数包含：,临界温度、临界压力和临界密度。,如CO,2,临界点分别为,31.1、7.3MPa和0.47gml,，当温度和压力高于临界点值时，物质处于液体和气体,中间状态,，在超临界状态下流体称为,超临界流体,，,超临界流体最惯用萃取剂是CO,2,。,第28页,超临界流体,物理特征、传质特征,通常介于液体和气体之间，适于作为萃取溶剂。,超临界流体,含有与液体一样,凝聚力、溶解力,。,密度与液体比较靠近,。,伴随,温度和压力,连续改变，超临界流体,扩散系数靠近于气体,，是通常液体,近百倍,，超临界流体,黏度大大低于液体黏度，靠近气体黏度,，有利于物质扩散。,超临界流体,溶解力与其密度有很大关系,，而,密度又受到体系温度或压力影响,，所以,压力或温度改变都会直接改变其溶解能力,。,第29页,（二）提取效率,提取时，总希望,提取率愈高愈好,，但实际上这种,“相转移”提取效率,不可能到达100。,在生物材料中总要残留部分目标物，,残留量,多寡取决于所选择溶剂系统,种类、用量、提取次数,以及操作条件。,在实际工作中，溶剂用量有一定限量，所以普通用,分次提取法给予填补,。,普通生产上,多用23次提取。溶剂用量（L）为生物材料25倍,，少数情况也有用,1020倍量溶剂,作一次性提取。目标是节约提取时间，降低,有害酶,作用。,第30页,当提取物由固相转入液相或从细胞内转到细胞外时，提取率还与,物质扩散作用,相关。为了提升,提取速度,，常采取一些办法，如增加材料,破碎程度,，,进行搅拌,，,延长提取时间,，,提升提取温度,。,（三）影响提取效率原因,1、温度,多数物质,溶解度随提取温度升高而增加,。另外较高温度能够,降低物料黏度,，,有利于分子扩散和机械搅拌,。,应用有机溶剂提取生化成份时，普通在较低温度下进行提取，,首先是为了降低溶剂挥发损失和生产安全，另首先也是为了降低活力损失。,第31页,2、酸碱度,多数生化物质在,中性条件下较稳定,，所以提取用,溶剂系统标准上,应防止过酸或过碱，pH普通应控制在,49范围,内。,为了增加目标物溶解度，往往要防止在目标物等电点附近进行提取。,巧妙地,选择溶剂系统pH,，不但直接影响,目标物与杂质溶解度,，还能够,抑制有害酶类,水解破坏作用，,预防降解,，提升收得率。,第32页,3、盐浓度,盐离子存在能,减弱生物分子间离子键及氢键,作用力。稀盐溶液对蛋白质等生物大分子有,助溶作用,。,一些不溶于纯水球蛋白在稀盐中能增加溶解度，这是因为盐离子作用于生物大分子表面，,增加了表面电荷,，使之,极性增加,，,水合作用增强,，促使形成稳定,双电层,，此现象称,“盐溶”作用,。,各种盐溶液盐溶能力既与其,浓度相关,，也与其,离子强度相关,，,普通高价酸盐盐溶作用比单价酸盐盐溶作用强。,第33页,惯用稀盐提取液有：,氯化钠溶液（0.10.15molL）；,磷酸盐缓冲液（0.020.05molL）；,焦磷酸钠缓冲液（0.020.05molL）：,醋酸盐缓冲液（0.100.15molL）：,柠檬酸缓冲液（0.020.05molL）。,其,中焦磷酸盐缓冲范围较大,，对氢键和离子键有,较强解离作用,，还能,结合二价离子,，对一些生化物质有,保护作用,。,柠檬酸缓冲液,常在酸性条件下使用，作用,近似焦磷酸盐,。,第34页,（四）提取方法选择,生物材料及其目标物与提取相关一些性状包含,溶解性质、分子量、等电点、存在方式、稳定性、相对密度、粒度、黏度、目标物含量、主要杂质种类及溶量解性质、相关酶类特征,等。,操作者可依据,文件资料及本人试验探索,取得相关信息，在提取过程中尽可能,增加目标物溶出度,，尽可能,降低杂质溶出度,，同时充分重视生物材料及目标物在,提取过程,中,活性改变,。,第35页,对,酶类药品,提取要,预防辅酶丢失,和其它,失活原因干扰,；,对,蛋白质类药品,要预防其高级结构破坏（即,变性作用,），应防止,高热、强烈搅拌、大量泡沫、强酸 强碱及重金属离子,作用。,多肽类,及核酸类药品需注意防止酶,降解作用,，提取过程中，应在,低温下操作,，并添加一些,酶抑制剂,；,对,脂类药品,应尤其注意,预防氧化作用,，降低与空气接触，如添加,抗氧剂，通氮气及避光,等。,第36页,在提取过程中，如蛋白质、酶及核酸类药品常,采取以下保护办法,。,（1）采取缓冲系统,预防提取过程中一些,酸碱基团,解离造成溶液,pH大幅度改变,，,使一些活性物质变性失活,或因,pH改变,影响提取效果。,在生化药品制备中，惯用缓冲系统有,磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液,等，,所使用缓冲液,浓度均较低,，以,利于增加溶质溶解性能,。,第37页,（2）添加保护剂,预防一些生理活性物质活性基团及酶活性中心受破坏，如,巯基是许多活性蛋白质和酶催化活性基团,，,极易被氧化,，故提取时，常添加一些还原剂如,半胱氨酸、巯基乙醇、二巯基赤鲜糖醇、还原型谷胱甘肽,等。,其它办法如提取一些酶时，常,加入适量底物,以,保护活性中心,。对,易受重金属离子抑制,活性物质，可在提取时添加一些,金属螯合剂,，以保护活性物质稳定性。,第38页,（3）抑制水解酶作用,抑制水解酶对目标物作用是提取操作中最主要保护性方法之一,。,如需要,金属离子激活水解酶,（如DNase）常加入,EDTA或用柠檬酸缓冲液,，,使水解酶活力受到抑制,。,对,热不稳定,水解酶，可用,热变性提取法,，使酶失活。,依据,酶溶解性质,不一样，可用pH不一样缓冲体系提取，以降低,酶释放,或依据酶,最适pH,，,选取酶发挥活力最低pH进行提取,。,最有效方法是在提取时，,添加酶抑制剂,。,第39页,（4）其它保护办法,为了保持一些生物大分子活性，还要注意防止,紫外线、强烈搅拌、过酸、过碱或高温、高频震荡,等。,有些活性物质还应,预防氧化,，如,固氮酶、铜铁蛋白,提取分离时要求在,无氧条件,下进行，有些活性蛋白对,冷、热改变,也十分敏感，如免疫球蛋白就不宜在低温冻结。所以提取时要,依据目标物不一样性质,，,详细对待。,第40页,三、生化活性物质浓缩与干燥,（一）生化活性物质浓缩,生化活性物质提取液在深入分离、提纯前，依据物料性能可,采取不一样方法浓缩,，因为多数生化活性成份对热不稳定，所以常采取一些较为,缓解浓缩方法,。,1、盐析浓缩,用添加,中性盐方法,来使一些蛋白质（或酶）从稀溶液中,沉淀出来,，从而到达样品浓缩目标。,最惯用中性盐是,硫酸铵,，其次是硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸钾等。,第41页,2、有机溶剂沉淀浓缩,在生物大分子水溶液中，逐步,加入乙醇、丙酮等有机溶剂,，能够使生化物质,溶解度显著降低,，从溶液中沉淀出来，这也是浓缩生物样品惯用方法。,其优点是溶剂易于回收，样品无须,透析除盐,，,在低温操作下,，对各种生物大分子,较为稳定,，但对一些蛋白质或酶却,易使它们变性失活,，应小心操作。,应用本法取得浓缩物，为预防生物活性物质变性应,尽快除去有机溶剂。,第42页,3、用葡聚糖凝胶（Sephadex）浓缩,加入固体,干葡聚糖凝胶G25,，迟缓搅拌30min，葡聚糖凝胶吸水膨胀，进行吸滤，生物大分子全部留在溶液中，如此,重复数次,，可在短时间内使溶液浓缩到l00ml，每次葡萄糖凝胶加入量为溶液量,15为宜,，,用过葡聚糖凝胶经,蒸馏水洗净,后，可用,乙醇脱水，干燥后重复使用,。,第43页,4、用聚乙二醇浓缩,将待浓缩液放入,透析袋内，袋外覆以聚乙二醇,，袋内水分很快被袋外聚乙二醇所吸收，在极短时间内，能够浓缩,几十倍至上百倍,。,5、超滤浓缩,应用,不一样型号超滤膜浓缩,不一样分子量生物大分子。,第44页,6、真空减压浓缩与薄膜浓缩,真空减压浓缩,在生物药品生产中使用较为普遍，,浓缩目标,是除去,挥发性溶剂,，保持物料,生物活性,，如薄膜蒸发器便是其中一例。,薄膜蒸发,进行方式有二：,一是使,液膜快速流过加热面,而蒸发，,另一是使物料猛烈地沸腾，产生大量泡沫，以,泡沫内外表面,为蒸发面进行蒸发，后一方法使用较普遍。,第45页,第46页,（二）干燥,干燥是使物质,从固体或半固体状经除去存在水分或他种溶剂,，从而取得干燥物品过程。,水分在干燥物料中，有三种情况：即,表面水、毛细管中水与细胞内水,。,表面水,很轻易,经过汽化除去,。,毛细管中水,，,因为毛细管壁作用，较难除去。,细胞内水,因为被,细胞膜包围封闭,，如不,扩散到膜外,则不轻易蒸发除去。,第47页,干燥速度,在,温度及压力不变条件下,取决于,液体抵达表面速度,。,物质在空气中干燥度，也常称为物质,平衡湿度,，在一定条件下是一个不变值。所以，除非改变大气,温度，湿度或压力,。,干燥多用,加热法,进行。惯用方法有,膜式干燥、气流干燥、减压干燥,等。另外，,冷冻干燥、喷雾干燥以及红外线干燥,等也常选取。,第48页,1、减压干燥,减压干燥,是在密闭容器中抽去空气后进行干燥方法，亦称,真空干燥,。,2、喷雾干燥,喷雾干燥,是,流化技术,用于干燥最早方法。待干燥物质先浓缩成一定浓度液体。因为液体经喷雾后含有极大表面，故能在很短时间内干燥，使,受热时间缩短,，而且干燥物为,粉状,，不需粉碎即可应用。,第49页,第50页,3、冷冻干燥,冷冻干燥,是在,低温、低压条件下,，利用,水升华性能,而进行一个干燥方法。,在预冻结过程中，制品预冻有,两种方式,：,其一是制品与干燥箱,同时降温,；,另一个是待干燥箱搁板降温至,40左右,，再将制品放入。前者相当于,慢冻,，后者则介于,慢冻与速冻之间。,第51页,冷冻干燥机系由,制冷系统、真空系统、加热系统、电器仪表控制系统,所组成，主要部件为,干燥箱、凝结器、冷冻机组、真空泵组和加热装置,等（图2 3）。,第52页,第53页,四、生化活性物质分离与纯化,1、生化制药工艺中分离制备方法,特点,生化分离技术,包含：,生化分离分析和生化制备,。前者主要对生物体内各组分加以分离后进行,定性、定量判定,。,而后者则主要是为了取得生物体内某一,单纯组分,。,生物制药工艺中,分离制备方法有以下特点,：,（1）生物材料组成非常复杂,。,其中有,不少化合物迄今还是未知物,，而且生物活性物质在,分离进程中,仍,处于不停代谢改变中,，所以,常无固定操作方法可循,。,第54页,（2）,有些化合物在生物材料中,含量极微,，所以分离操作步骤多，,不易取得高收率,。,（3）生物活性成份离开生物体后，,易变性破坏,，,必须十分小心地保护这些化合物,生理活性,，这也是生物制药中,分离、制备难点,。,（4）,生物制药中分离方法,几乎都在溶液中进行，,各种参数,（温度、pH、离子强度等）,对溶液中各种组分综合影响经常无法固定,，以致,许多试验设计理论性不强,。,试验结果经常带有很大,经验成份,。,第55页,（5）为了保护目标物生理活性及,结构上完整性,，生物制药中分离方法多采取,温和“多阶式”方法,进行，即常说,“逐层分离”方法,。,（6）,生物产品最终均一性证实与化学上纯度概念不完全相同,，因生物分子对环境反应十分敏感，,结构与功效关系,比较复杂，故对其均一性评定经常是有条件，只凭一个方法得到,纯度结论,往往是片面，甚至是错误。,第56页,2、生化制药工艺中分离制备方法基本原理,生物大分子,分离纯化主要原理,是：,（1）依据,分子形状和大小,不一样进行分离。如差速离心与超,离心,、,膜分离,（透析、电渗析）,超滤法,凝胶过滤法。,（2）依据分子,电离性质（带电性）差异,进行分离。如,离子交换法、电泳法、等电点聚焦法,。,（3）依据,分子极性大小及溶解度不一样,进行分离。如溶剂提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法、等电点沉淀法及有机溶剂分级沉淀法。,（4）依据物质,吸附性质不一样,进行分离。如选择性吸附与,吸附层析法,。,第57页,（5）依据,配体特异性,进行分离,亲和层析法,。,3、分离纯化基本程序和试验设计,生物体内某一组分，尤其是未知结构组分分离制备设计大致可分为,五个基本阶段,：,（1）确定,制备物,研究目标,及建立对应,分析判定方法,；,（2）制备物,理化性质和稳定性预备试验,；,（3）,材料处理及抽提方法选择,；,第58页,（4）分离纯化方法探索；,（5）产物,均一性测定,。,提取是分离纯化目标物第一步，所选取溶剂应对目标物含有,最大溶解度,，并尽可能降低杂质进入提取液中，为此可调整溶剂,pH、离子强度、溶剂成份配比和温度,范围等。,分离纯化,是生化制备,关键操作,。所以合理分离纯化方法是依据,目标物理化性质与生物学性质,依详细试验条件而定。,依据分析和预试验初步结果，,参考他人对类似物质分离纯化经验,，也能够,少走弯路,。,第59页,4、分离纯化方法步骤优劣综合评价,每一个,分离纯化步骤好坏,，除了从,分辨能力和重现性,二方面考虑外，还要注意方法本身,回收率,。,5、制备物均一性判定,一个制备物是否纯，常以,“均一性”表示,。,均一性,是指所取得制备物只含有一个,完全相同成份,。均一性评价常须经过,数种方法验证,才能必定。,第60页,假如某物质所含有,物理、化学各方面性质,经过,几个高灵敏度方法,判定都是均一，那么大致能够认为它是均一。,当然，,伴随更加好判定方法出现，还可能发觉它不是均一。,绝正确标准,只有把制备物全部结构搞清楚，并经过人工合成证实含有相同生理活性时，才能必定制备物是,绝对纯净,。,生物分子,纯度判定方法,很多，惯用有,溶解度法、化学组成份析法、电泳法、免疫学方法、离心沉降分析法、各种色谱法、生物功效测定法，以及质谱法,等。,第61页,第二节 微生物制药工艺技术基础,、微生物菌种选育与菌种保藏,（一）菌种分离与筛选,1、菌种分离,（1）含菌样品搜集,依据微生物,生态特点,，从自然界,取样，分离,所需菌种，普通可从,土壤中分离,。,第62页,（2）富集培养,搜集到样品若含所需要菌较多，可,直接分离,。若含所需要菌极少，就需要,经过富集培养,，使所需要菌大量生长，,以利筛选,。,再配合,控制温度、pH或营养成份,即可到达目标。,（3）菌种纯化,在自然条件下，各种类型菌混杂在一起生长，所以要进行分离，以取得纯种。,菌种纯化方法普通,采取稀释分离法或划线分离法,。,2、菌种筛选,筛选前，先要考虑哪些微生物是,筛选对象,。,第63页,（二）菌种选育与保藏,1、菌株选育,发酵生产，从自然界直接分离到菌种，都不能适合实际生产需要。只有经过,诱变、选育,才能使产量,成倍、成百倍,地提升。,（1）自然选育,自然选育是一个,纯种,选育方法,。它利用微生物在一定条件下产生,自发突变原理,，经过分离、筛选,排除衰变型菌落,，从中选择维持原有生产水平菌株。所以，它能到达,纯化、复壮菌种,，稳定生产目标。,自然选育普通包含,单孢子悬浮液制备、分离及单菌落培养、筛选,等操作过程,。,第64页,（2）诱变育种,诱变育种,是指有意识地将生物体暴露于,物理、化学或生物,一个或,各种诱变因子,，促使生物体,发生突变,，进而从突变体中,筛选,含有优良性状突变株过程。,出发菌株选择,出发菌株是用于诱变原始菌株，选择出发菌株时，应考虑以下问题：,a、出发菌株稳定性,，尽可能挑选,纯系菌株,，以排除,异核体系与异质体菌株,，所以对选定出发菌株常需经过,自然选育深入纯化,；,第65页,b、选取具备某种,优良特征菌株,。,c、拟选对,诱变剂敏感,菌株，以提升,突变频率,；,d、菌种,生理状态及生长发育时间,，因为诱变剂对处于,转录状态或翻译状态菌种效应,要比静止状态或休眠状态菌种敏感得多。,普通细菌处于,营养体,，比处于,对数生长久,菌体为佳。,真菌和放线菌,则以它们,孢子,，或处于刚开始,萌发状态,孢子为佳。,为了确保菌体和,诱变剂均匀接触,，出发菌株都必须制备成,单细胞（孢子）悬浮液,，严格控制单孢子,分散度在95以上。,第66页,诱变处理,能够提升生物体,突变频率,物质称为,诱变剂,。当前使用诱变剂可分为,物理诱变因子、化学诱变剂和生物诱变因子,三大类。,屡次重复用同一个诱变因子处理易出现,“饱和”或回复突变现象,，所以常采取各种不一样,诱变因子或复合因子诱变。,a、物理诱变：,物理诱变因子主要包含,紫外线（UV）、射线、射线、快中子（FN）、射线、超声波、激光,等，其中以紫外线辐照使用最为普遍。,近年来用,离子束注入细胞技术,进行诱变育种。,第67页,b、化学诱变：,化学诱变剂是一些能和DNA起作用，改变其结构，并引发遗传变异化学物质。,化学诱变剂据其与,DNA作用方式,不一样有3类：,烷化剂,如氮介、乙烯亚胺、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基脲、亚硝酸等，它们,与DNA碱基起反应,，引发,碱基配正确转换,而发生,遗传变异,；,第68页,碱基类似物,，它们掺入到DNA分子中而造成遗传变异如,5溴尿嘧啶（5BU）、5氟尿嘧啶（5FU）,等；,移码诱变剂,如,吖啶黄、吖啶橙,等。它们可插入DNA双螺旋邻近碱基对之间造成碱基,插入或缺失,造成,转录和翻译,移码突变,。,第69页,c、生物诱变：,噬菌体可作为诱变剂应用于抗噬菌体菌种选育，其,作用原理,可能与,传递遗传信息,，,诱发抗性突变,相关。,诱变剂量,选择能够,提升正变株取得率,诱变剂量即为最适剂量，普通情况下，诱变处理后细胞死亡率越高，活下来细胞突变率也越高，故可用,死亡率作为相对剂量,。,在自动化程度高大规模筛选中，,常采取死亡率,在,9099.9高剂量,，,小规模人工筛选，普通采取,死亡率7090,低剂量，,也有报道采取死亡率,4060,更低剂量。,第70页,增变剂,使用，,氯化锂,本身并无诱变作用，但在抗生素产生菌诱变育种中表明氯化锂与一些诱变因子,含有协同作用,。,氯化锂使用,剂量,普通为0.5,，,处理方法多是后处理，即加在平板培养基中，在菌种生长发育过程中发生作用。,第71页,突变株筛选,a、随机筛选：,随机筛选指菌种经诱变处理后，凭经验随机选择一定数量菌落，其中包含,未发生突变野生型菌株和发生突变后正向及负向突变株,，再进行,摇瓶筛选,。,b、半理性化筛选,：,近年来，伴随遗传学、生物化学知识积累，人们对各种,抗生素生物合成路径,及,代谢调控机制,了解不停深入，抗生素产生菌,推理选育技术,应运而生、即依据已知或,可能生物合成路径、代谢调控机制,和,产物分子结构,来设计筛选方法，以打破微生物原有,代谢调控机制,，取得能大量形成产物,高产突变株,。,第72页,（3）当代菌种选育技术,杂交育种,杂交育种,普通指将两个基因型不一样菌株,经过接合使遗传物质重新组合,，再从中分离和筛选出含有新性状菌株。,杂交育种,是选取,已知性状,供体菌株和受体菌株作为,亲本,，把不一样菌株,优良性状集中于重组体中,。,所以杂交育种含有,定向育种性质,。杂交育种使得遗传物质,重新组合,，,扩大了变异范围，改进了产品质量和产量。,第73页,原生质体融合,用,脱壁酶,处理将微生物,细胞壁除去,，制成,原生质体,，再用,聚乙二醇（PEG）促进原主质体发生融合,，从而取得,融合子,，这一技术叫,原生质体融合,。,原生质体融合,重组频率高于,普通杂交方法，并实现了种间、属间融合，,为亲缘关系较远、性能差异较大菌株实现杂交,，开辟了一条,有效路径,。,第74页,基因工程技术,基因工程技术可完成,超远缘杂交,，是将某一生物体（供体）遗传信息在体外经,人工与载体相接（重组）,，组成,重组DNA分子,，然后转入另一微生物体（受体）细胞中，使外源DNA片段在后者内部得以,表示和遗传,。,所以基因工程是在分子生物学理论指导下一个自觉、能像工程一样,可事先设计和控制育种技术。,第75页,2菌种保藏,（1）菌种退化与预防,退化,意味着随时间推移菌种,一个或多个特征,逐步,减退或消失,。普通把菌株,生活力、产孢子能力,衰退和特殊产物产量下降统称为,退化,。,菌株遗传性状是稳定，不过也,可能发生突变,。所以，能够在,基因型改变,情况下引发,菌种退化,。,在,传代过程中回复突变,数量逐步取得优势过程，也就是,菌种退化,过程。所以基因突变能够使,原来纯菌株变为不纯,，不纯菌株在传代过程中,不停增加百分比,，从而造成,群体退化,。,第76页,菌种退化现象综合,比较判别,是：,单位容积中发酵液,活性物质含量,；,琼脂平皿上,单菌落形态,；,不一样培养时期菌体细胞,形态和主要遗传特征,，如形成,孢子能力,；,发酵过程,pH变动情况,；,发酵液,气味、色泽,。,第77页,菌种退化问题十分复杂，对其规律尚缺乏了解。所以，只能提供一些,标准性预防办法,。,预防基因突变,，,基因突变,是菌种退化一个主要原因，应用,低温保藏法,能够降低突变发生；,采取双重缺点型,，利用营养缺点型作为生产菌株时，,回复突变,可造成产量下降，采取双重缺点标志可间接而有效地预防突变；,制订科学管理制度,，使用菌种时,大批制作平行菌种斜面,，,少转接传代,；,分离单菌落，,在建立新菌株和使用过程中认真进行单菌落分离，再多制作,平行菌种斜面,；,第78页,选择培养条件,，选择有利高产菌株而不利于低产菌株,培养条件,。,（2）惯用菌种保藏法,微生物菌种在,屡次传代,中，会发生,遗传性变异,，而且退化性变异是,大量,，所以微生物菌种应妥善,保藏,，使之能,长久保持存活、不退化,，便于,生产和科研,使用。,菌种保藏原理,是依据菌种,生理、生化特点,，创造条件使菌体,代谢处于不活泼状态,。,第79页,保藏时，先挑选,优良纯种,，最好是选取它们,休眠体（孢子、芽孢,等），然后创造一个最有利于休眠环境条件（如,低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等,），以,降低菌种代谢活动,速度，到达,延长保留期,目标。,一个很好,保藏方法,，首先要求能,较长久,地保留原有菌种,优良特征,，但也要考虑方法本身经济简便。,第80页,斜面低温保藏法,。斜面低温保藏法是最早使用而且现今依然普遍采取方法。,详细方法是将菌种接种于所要求,斜面培养基,上，置最适温度下培养，待得到健壮菌体后，放在,4左右,，,湿度小于70,条件下保藏，,每间隔一定时间,重新移植培养1次。,普通,，细菌,每个月,移植一次，放线菌每,3个月,移植一次，,酵母菌,每,46个月,移植一次，,丝状真菌,每,4个月移植,一次。,保留期间应注意冰箱温度，不能波动太大，,切忌保留在0以下,，不然,培养基会结冰脱水,，造成,菌种性能,衰退。,第81页,液体石蜡封藏法,。,在长好菌苔斜面试管中，,加入灭过菌液体石蜡,，可预防或降低培养基内,水分蒸发,，隔绝培养物与,氧接触,，从而降低微生物,代谢活动,，推迟细胞老化，延长了,保留时间,。适合用于,不能利用石蜡油作碳源,微生物保藏。,方法为选取,优质纯净无色中性液体石蜡，经,121加压蒸汽灭菌30min,，然后在,150170烘箱中干燥12h,，使水汽蒸发，,石蜡油变清,。,再按无菌操作将灭菌石蜡油注入长好菌苔斜面试管中，,液面高出斜面1cm。,第82页,冷冻干燥保藏法,。,冷冻干燥保藏法是在较低温度下（,15以下,），,快速地将细胞冻结,，而且保持,细胞完整,，然后在,真空中使水分升华,。,为,预防冻结和水分不停升华,对细胞损害，,采取保护剂,来制备细胞悬液。,常将菌种,悬浮于脱脂消毒牛奶,中，,快速冷冻，真空干燥,，经过冷冻干燥微生物,生长和代谢活动处于极低水平,，所以菌种能够保留很长时间，,普通5l0年，最多可达15年之久。,真空冷冻干燥保藏法是当前保留菌种一个,比很好方法。,第83页,液氮超低温保藏法,微生物在,130低温下,，全部,代谢活动暂时停顿而生命延续,，微生物菌种得以长久保留。,可经过,加入保护剂,来降低,细胞内溶液冰点,，降低,冰晶,对细胞伤害。其方法是,以510甘油或二甲亚砜（DMSO）制成孢子悬液或菌悬液,，浓度以,大于10,8,为宜,。将此悬液注入无菌安瓿管或聚丙烯小管内，密封。采取专用,冷冻温度控制仪,以,每1min降低1速度，从0降到35,，然后取出,直接放入液氮中,。保藏菌种如需用时，将安瓿管由液氮中取出，,马上置于3840温水浴中,，振荡，直到,全部融化,为止，开启移种。此法是当前,最可靠一个长久保留菌种方法。,第84页,甘油冷冻保藏法。,将对数期菌体悬浮于新鲜培养基中，加入,15消毒甘油,、混匀速冻，冻存于,7080,，可,保留35年,。,其它干燥保藏法,保藏微生物菌种最关键关键点是,干燥、隔氧、低温、避光,。,单就干燥原理将微生物细胞或孢子附着在一个基物上进行干燥，然后加以保留。,比如用沙、土或沙土混合，明