腐乳及其生产过程中蜡样芽孢杆菌的防控及检测方法研究进展.pdf

D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 0-9 9 7 3.2 0 2 3.0 9.0 3 7引文格式:杨春晖,王文平,续丹丹.腐乳及其生产过程中蜡样芽孢杆菌的防控及检测方法研究进展J.中国调味品,2 0 2 3,4 8(9):2 1 4-2 2 0.YANG C H,WANG W P,X U D D.R e s e a r c h p r o g r e s s o n c o n t r o l a n d d e t e c t i o n m e t h o d s o f B a c i l l u s c e r e u s i n s u f u a n d i t s p r o d u c t i o n p r o c e s sJ.C h i n a C o n d i m e n t,2 0 2 3,4 8(9):2 1 4-2 2 0.腐乳及其生产过程中蜡样芽孢杆菌的防控及检测方法研究进展杨春晖,王文平*,续丹丹(北京食品科学研究院,北京 1 0 0 0 6 8)摘要:蜡样芽孢杆菌(B a c i l l u s c e r e u s)是一种广泛分布于土壤、灰尘、植物和生熟食品中的食源性致病菌。蜡样芽孢杆菌超过一定量会产生毒素,从而导致食物中毒,引起食物中毒的两种毒素是腹泻型毒素和呕吐型毒素。腐乳是中国传统大豆发酵食品,由于其半开放的发酵方式,且大多为传统手工操作,腐乳及其生产过程中极易被蜡样芽孢杆菌污染,存在食品安全风险。文章主要对蜡样芽孢杆菌的特征、产毒素特性、腐乳中蜡样芽孢杆菌的来源以及腐乳生产过程中蜡样芽孢杆菌的控制措施等方面进行了综述,同时对蜡样芽孢杆菌的检测方法进行了介绍,旨在为降低腐乳中蜡样芽孢杆菌的含量、提升腐乳的食品安全性提供参考。关键词:腐乳;蜡样芽孢杆菌;控制措施;检测方法中图分类号:T S 2 1 4.2 文献标志码:A 文章编号:1 0 0 0-9 9 7 3(2 0 2 3)0 9-0 2 1 4-0 7R e s e a r c h P r o g r e s s o n C o n t r o l a n d D e t e c t i o n M e t h o d s o f B a c i l l u s c e r e u s i n S u f u a n d I t s P r o d u c t i o n P r o c e s sYANG C h u n-h u i,WANG W e n-p i n g*,XU D a n-d a n(B e i j i n g A c a d e m y o f F o o d S c i e n c e,B e i j i n g 1 0 0 0 6 8,C h i n a)A b s t r a c t:B a c i l l u s c e r e u s i s a f o o d b o r n e p a t h o g e n w i d e l y d i s t r i b u t e d i n s o i l,d u s t,p l a n t s,r a w a n d c o o k e d f o o d s.B.c e r e u s c a n p r o d u c e t o x i n s b e y o n d a c e r t a i n l i m i t,l e a d i n g t o f o o d p o i s o n i n g.T h e t w o t y p e s o f t o x i n s t h a t c a u s e f o o d p o i s o n i n g a r e d i a r r h e a-t y p e t o x i n a n d v o m i t-t y p e t o x i n.S u f u i s a t r a d i t i o n a l f e r m e n t e d s o y b e a n f o o d i n C h i n a.D u e t o i t s s e m i-o p e n f e r m e n t a t i o n m e t h o d a n d t r a d i t i o n a l m a n u a l o p e r a t i o n,s u f u a n d i t s p r o d u c t i o n p r o c e s s a r e v u l n e r a b l e t o c o n t a m i n a t i o n b y B.c e r e u s,w h i c h h a s f o o d s a f e t y r i s k s.I n t h i s p a p e r,t h e c h a r a c t e r i s t i c s,t o x i n-p r o d u c i n g c h a r a c t e r i s t i c s o f B.c e r e u s,t h e s o u r c e s o f B.c e r e u s i n s u f u a n d t h e c o n t r o l m e a s u r e s o f B.c e r e u s i n t h e p r o c e s s o f s u f u p r o d u c t i o n a r e r e v i e w e d,a n d t h e d e t e c t i o n m e t h o d s o f B.c e r e u s a r e i n t r o d u c e d,i n o r d e r t o p r o v i d e r e f e r e n c e s f o r r e d u c i n g t h e c o n t e n t o f B.c e r e u s i n s u f u a n d i m p r o v i n g t h e f o o d s a f e t y o f s u f u.K e y w o r d s:s u f u;B a c i l l u s c e r e u s;c o n t r o l m e a s u r e s;d e t e c t i o n m e t h o d s收稿日期:2 0 2 3-0 3-2 6基金项目:国家重点研发计划项目(2 0 1 6 Y F D 0 4 0 0 5 0 0)作者简介:杨春晖(1 9 9 0-),女,工程师,硕士,研究方向:食品生物技术。*通信作者:王文平(1 9 6 6-),女,教授,博士,研究方向:食品生物技术。蜡样芽孢杆菌(B a c i l l u s c e r e u s)是一种革兰氏阳性杆菌,其广泛存在于灰尘、土壤和水中1。蜡样芽孢杆菌在2 04 0 的温度条件下会迅速繁殖,并产生肠毒素,且蜡样芽孢杆菌不分解蛋白质,导致食物在感官上变化不明显且食用无异味,因此食用过程中不易察觉变质情况,容易误食而引发食物中毒2。蜡样芽孢杆菌从功能上可分为益生性蜡样芽孢杆菌和条件致病性蜡样芽孢杆菌。益生性蜡样芽孢杆菌具有一定的耐受性,可耐受酸碱、高温等,可产生耐高热的抗菌活性蛋白,其菌制剂已被广泛应用于饲料、农业等领域3。412专论综述 第4 8卷 第9期2 0 2 3年9月 中 国 调 味 品C h i n a C o n d i m e n t条件致病性蜡样芽孢杆菌通常当其在食物中的含量超过1 05 C F U/m L(g)时,就有可能带来中毒症状。条件致病性蜡样芽孢杆菌也成为我国食源性微生物污染的主要菌种之一,其生长条件宽松,常规热处理无法对蜡样芽孢杆菌的孢子造成毁灭性伤害,且蜡样芽孢杆菌能产生致密的生物膜,这些生物膜可以附着在食品加工设备上,形成持续污染源4。腐乳是以大豆为主要原料,经过多种发酵工艺制得的发酵食品。其味道鲜美,营养丰富,既可以作为烹饪辅料又可以作为佐餐食品,还具有抗氧化、抗炎等功效,在我国传统发酵食品中占有十分重要的地位5。由于腐乳的生产是敞开式发酵,且不能后期灭菌,所以环境中的微生物可通过空气、设备等在腐乳中定殖生长,影响腐乳品质。近年来,与腐乳相关的食品安全事件也不断引起人们的注意,在近几年欧盟及其他国家通报的食品数据中,腐乳、酱油都因蜡样芽孢杆菌含量不合格而使产品出口受到影响6。因此,从腐乳食用安全与品质的角度出发,对腐乳中蜡状芽孢杆菌的菌株来源、毒理特性、控制措施以及检测方法进行研究是有必要的。本文主要对蜡样芽孢杆菌的特征、产毒素特性、腐乳中蜡样芽孢杆菌的来源以及腐乳生产过程中蜡样芽孢杆菌的控制措施等方面进行了综述,同时对蜡样芽孢杆菌的检测方法进行了介绍,旨在为降低腐乳中蜡样芽孢杆菌的含量、提升腐乳产品的质量安全、增强腐乳产品的竞争力提供参考。1 蜡样芽孢杆菌1.1 蜡样芽孢杆菌的特性蜡样芽孢杆菌(B a c i l l u s c e r e u s)大小为(1.0 1.3)m(3.05.0)m,为杆状菌体,呼吸类型为兼性需氧,菌体表面粗糙,形状扁平,两端较平整。菌体周身分布有鞭毛,可以运动,且鞭毛具有一定黏附作用。蜡样芽孢杆菌最适生长温度为2 04 5,菌株耐热,其产生的孢子在1 0 0 下加热3 0 m i n仍无法将其完全灭活,而干热灭菌需要1 2 0 处理6 0 m i n以上才能将其全完杀灭7。蜡样芽孢杆菌具有耐高温、耐酸碱等特点,能产生耐高热的抗菌活性蛋白。蜡样芽孢杆菌是一种食源性致病菌,广泛分布于大米、谷物、肉制品及豆制品等食品中8。据报道,全世界约2 0%的食源性疾病暴发是由于食物中的蜡样芽孢杆菌污染9,欧盟和韩国的法规要求蜡样芽孢杆菌含量分别为低于1 04 C F U/g1 0和不得超过1 03 C F U/g1 1。国标G B 3 1 6 0 72 0 2 1 食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量 中表明,对部分散装或未经热处理散装即食食品中蜡样芽孢杆菌的限量要求为1 05 C F U/g(m L)1 2。1.2 蜡样芽孢杆菌产生的毒素及致病性蜡样芽孢杆菌超过一定限量会产生毒素,从而导致食物中毒,引起食物中毒的两种毒素是腹泻型毒素和呕吐型毒素。腹泻型毒素主要包括溶血性肠毒素、非溶血性肠毒素、细胞毒素和肠毒素等1 3,主要是不耐热的肠毒素,这类毒素在4 5、3 0 m i n或5 6、5 m i n的情况下被破坏失去毒性;此类型食物中毒较少,主要中毒症状表现为腹痛、腹泻,偶有发热、水样腹泻、腹部疼痛,少见呕吐。一般潜伏期为61 5 h,持续时间为2 4 h1 4。蜡样芽孢杆菌腹泻综合征是由作为活细胞或孢子摄入的营养细胞引起的感染,被认为在小肠中产生蛋白质肠毒素1 5。呕吐型毒素(c e r e u l i d e)引起的食物中毒比腹泻型更严重,主要表现为恶心和呕吐,偶尔有发烧和四肢无力等症状1 6。呕吐型肠毒素是一种通过非核糖体途径合成的十二环形多肽,其具有稳定的结构,使其能够抵抗各种恶劣环境,它在酸碱环境和1 2 6、9 0 m i n的条件下具有活性,对理化因素稳定1 3。携带c e s基因的蜡样芽孢杆菌在食物中预先产生该毒素,进入人体后在胃中与其受体5-HT 3结合导致呕吐1 7。国内报道的蜡样芽孢杆菌食物中毒事件多为此型毒素,引起食物中毒的食品主要有炒饭和米饭等淀粉类食物,凉面、豆腐也可以引发,由于其毒素的耐热性,所以含有此毒素的食品即使经过高温加热,仍会引起食物中毒1 8,潜伏期一般为0.56.0 h1 9。因蜡样芽孢杆菌导致的人体中毒,除腹泻病和呕吐病外,严重的还会通过菌体诱发严重疾病如骨髓炎、眼内炎、心内膜炎、脑膜炎和菌血症等2 0。其致病性特点为死亡率不高、症状发生快、中毒事件广泛。据报道,蜡样芽孢杆菌引起的疾病不仅与摄入芽孢杆菌的量有关,也可能与蜡样芽孢杆菌菌株、宿主生理及食物本身有关2 1。近年来关于蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒事件较多,2 0 2 1年北京海淀区某小学有9名学生共同食用配餐公司的营养午餐后出现腹痛、腹泻、呕吐等症状,留样食品检测、接触食品的工具检测结果表明盒饭中的蜡样芽孢杆菌数量为4.01 05 C F U/g,因此该事件判定为营养配餐公司提供的盒饭引起的蜡样芽孢杆菌食物中毒2 2。2 0 2 1年6月,山东淄博的2名大学生同时出现恶心、呕吐、精神萎靡的症状,病原学检测结果表明,2人食用了长时间存放且储存条件不当的包装鸡腿,该食物长期存放在较高温度下,蜡样芽孢杆菌快速繁殖达到致病数量,造成蜡样芽孢杆菌食物中毒2 3。2 腐乳及其生产过程中的蜡样芽孢杆菌腐乳是我国传统的大豆发酵食品之一,其滋味鲜512第4 8卷 第9期2 0 2 3年9月 中 国 调 味 品C h i n a C o n d i m e n t专论综述 美、风味独特、富含优质蛋白质和营养素,具有较高的营养价值,深受广大消费者青睐2 4。腐乳是经过大豆浸泡、磨豆、煮浆、点浆、压榨、切块、排块、接种毛霉、前发酵、加盐腌制、装瓶、灌汤、后酵等一系列工艺制作而成的,腐乳的生产工艺流程见图1。由于腐乳生产的一些环节需要在开放的环境中进行,无法避免地引入环境中的微生物,且后期不能灭菌,故腐乳中检出的微生物种类繁多5。其中食源性致病菌蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌在市售腐乳中有检出2 5。腐乳中蜡样芽孢杆菌问题不容忽视,因此有必要对腐乳生产过程中的蜡样芽孢杆菌进行溯源。图1 腐乳的生产工艺流程F i g.1 P r o d u c t i o n p r o c e s s o f s u f u点浆过程用到的酸浆水是豆腐压榨产生的大豆黄浆水经自然发酵得到的,如果黄浆水和工器具被蜡样芽孢杆菌污染,则二者就会成为传递蜡样芽孢杆菌的介质,蜡样芽孢杆菌被带到豆腐中快速繁殖;豆腐块排放冷却时,豆腐块接触人手和器具,可能使豆腐块污染蜡样芽孢杆菌,此后蜡样芽孢杆菌附着在营养丰富的豆腐块上快速生长;豆腐块接种毛霉发酵后,在开放的环境中蜡样芽孢杆菌快速生长繁殖,其数量可增长至1 06 C F U/g;由于盐可在一定程度上抑制蜡样芽孢杆菌,所以豆腐块加盐腌制过程中蜡样芽孢杆菌增长缓慢;装瓶灌汤后,由于食盐、酒精及厌氧环境的作用,蜡样芽孢杆菌的生长受到抑制,在腐乳发酵后熟和制成成品后,其数量分别降至1 05 C F U/g和1 04 C F U/g数量级2 6。因此,腐乳生产过程中点浆、豆腐排块、发酵、腌制等环节是蜡样芽孢杆菌污染的高风险环节,如能严格控制豆腐和毛坯中蜡样芽孢杆菌的数量,则腐乳产品中蜡样芽孢杆菌的数量可相应降低。多数学者对腐乳生产过程中的蜡样芽孢杆菌进行了监测,G u a n等2 7检出的腐乳中蜡样芽孢杆菌数量略有不同,但是蜡样芽孢杆菌数量趋势依然为豆腐坯子中的含量高于盐渍后的豆腐坯。金泽坤7对腐乳工厂的蜡样芽孢杆菌污染状况进行了分析,结果表明7 8.9 1%的样品呈蜡样芽孢杆菌阳性,且毛霉发酵阶段是腐乳中蜡样芽孢杆菌的增殖关键阶段。对不同工艺的红腐乳、白腐乳和青腐乳制作工艺环节进行采样分析考察,结果表明不同工艺的腐乳在各环节污染程度不同,原材料、人工操作污染、空气环境以及设备污染等都能引入蜡样芽孢杆菌导致腐乳污染2 8。张伟伟对腐乳生产流程的蜡样芽孢杆菌及菌落总数进行了测定和分析,结果表明蜡样芽孢杆菌主要分布于车间的空气、生产器具、毛坯车间的空气、毛坯及毛坯屉以及汤料车间的空气及汤料中。3 腐乳及其生产过程中蜡样芽孢杆菌的控制措施3.1 添加植物精油很多植物都具有天然抗菌功效,人们也经常使用植物中萃取得到的精油来抑制食物腐败变质。精油最常见的抑菌机制是膜破坏(见图2),精油的亲脂疏水性促进其在细胞质膜的磷脂双分子层中积累,影响细胞膜的结构完整性和功能,还可导致细胞成分和功能的丧失,甚至细胞破裂、凋亡,阻止细菌正常代谢。虽然细菌对渗漏有一定的耐受性,但这些细胞化合物的大量损失可能导致细胞死亡,从而达到抑菌作用2 9。图2 植物精油中生物活性化合物的抑菌作用机制F i g.2 T h e a n t i b a c t e r i a l m e c h a n i s m o f b i o a c t i v e c o m p o u n d s i n p l a n t e s s e n t i a l o i l s大蒜营养物质丰富,大蒜精油中含有多种杀菌物质,如大蒜辣素、蒜氨酸、阿藿烯等,是一种天然抑菌剂3 0。将大豆煮浆后添加3 2.5 g/L大蒜精油,以此处理的腐乳各加工阶段的蜡样芽孢杆菌数量均有所下降,成品中蜡样芽孢杆菌数量控制在5 l o g C F U/g以下,极大地降低了腐乳引起食源性疾病的风险;同时加入的大蒜精油可优化细菌成分,促进乳酸菌在发酵过程中的生长,可能是大蒜精油改变了部分细菌细胞膜的通透性3 1。而且在腐乳发酵过程中加入大蒜精油对中极性代谢产物(碳水化合物、有机酸、生物胺、游离氨基酸)和挥发性化合物均无显著影响3 2。肉桂中含约2%的挥发油,其气味温和,很多试验证明其有很明显的抑菌作用,且主要有效杀菌成分为肉桂醛。向蜡样芽孢杆菌总数为1 06 C F U/m L的腐乳汤汁中添加用9 5%乙醇稀释至1 0-6和1 0-7的肉桂精油时,3 7 培养1 d后检测蜡样芽孢杆菌总数,结果表明其数量降低至1 03 C F U/m L,降低了3个数612专论综述 第4 8卷 第9期2 0 2 3年9月 中 国 调 味 品C h i n a C o n d i m e n t量级1 6。青花椒精油是一种天然的精油,是食品工业中有前途的化学食品防腐剂代替品。青花椒精油同样可以破坏细菌的细胞膜和细胞壁,引起细胞质渗漏、细胞膜损伤、能量代谢紊乱和氨基酸代谢紊乱,其对蜡样芽孢杆菌的最小杀菌浓度和最小抑菌浓度分别为2.0 m g/m L和4.0 m g/m L3 3。佛手柑精油是从佛手柑果皮中萃取得到的,其味道清新,有类似柠檬的香气。其可以通过影响细胞膜完整性的作用机制,抑制蜡样芽孢杆菌细胞生长3 4。以上研究均表明,添加天然植物精油于食品中,在保证食品安全性的同时,还能起到有效抑菌作用,具有广阔的应用前景。3.2 添加抑菌素表没食子儿茶素没食子酸酯(e p i g a l l o c a t e c h i n g a l l a t e,E G C G)和乳酸链球菌素(N i s i n)等已逐渐成为具有应用前景的抑菌素。乳酸链球菌素可以改变有害微生物细胞的p H,使细胞濒临死亡。王舒叆等研究表明,添加0.0 2 5%的E G C G以及N i s i n对青稞湿面中的蜡样芽孢杆菌菌落数有一定的抑制作用,但是N i s i n受环境的影响较大3 5。黄现青等研究了N i s i n、聚赖氨酸、壳聚糖对蜡样芽孢杆菌指示菌的抑菌效果,结果表明三者对蜡样芽孢杆菌均有一定的抑制效果,N i s i n和聚赖氨酸对蜡样芽孢杆菌的杀菌效果最好,在质量浓度为0.0 2 m g/m L和0.0 1 m g/m L时杀菌率达8 3.8 5%3 6。将乳酸链球菌素作用于萌发状态的蜡样芽孢杆菌处理1 5 m i n,其芽孢杀灭率可达到9 9.6 2%,且作用体系中加入萌发剂可以明显提升芽孢的杀灭率3 7。3.3 使用环境消毒剂莫金观等3 8分别采用含量为7 5 0 m g/L的二氧化氯、2 0 0 0 m g/L的过氧乙酸对蜡样芽孢杆菌菌悬液作用1.5 m i n,采用1 5 g/L过氧化氢作用1.5 m i n,考察了其对蜡样芽孢杆菌的杀菌效果。结果表明,二氧化氯和过氧乙酸对菌悬液内蜡样芽孢杆菌杀灭数量均大于1 05数量级,过氧化氢对蜡样芽孢杆菌的杀菌效率则相对较低,表明采用二氧化氯和过氧乙酸溶液喷洒生产工具有一定的杀灭蜡样芽孢杆菌效果。张鉴平提到以2%的过氧乙酸溶液喷雾室内表面3 0 m i n,室内空气熏蒸6 0 m i n后可以有效杀灭蜡样芽孢杆菌。3.4 工艺环节的监控腐乳生产过程中应该将蜡样芽孢杆菌数量降到最低范围,以保证后期发酵时及成品中蜡样芽孢杆菌数量处于安全范围。所以提出以下几条针对性的控制措施:第一,辅料微生物控制。由于酸浆水和盐水直接参与腐乳的发酵,其微生物种类和数量会直接影响腐乳的品质,所以对二者存在的环节应该严格把控,如对酸浆水和盐水进行蜡样芽孢杆菌计数,一旦有异常应及时采取措施。配制盐水时应使用凉开水,且盐水不能长期存放或者循环使用,应该现用现配,也可考虑加大食盐用量、缩短腌制时间来抑制蜡样芽孢杆菌的生长2 8。红腐乳灌汤所用的汤料中含有面曲及红曲,其淀粉含量高,适宜蜡样芽孢杆菌生长,所以还需加强对汤料品质的监控。第二,生产工具消毒。由于生产过程中压豆腐产生的黄浆水是敞开放置的,隔夜自然发酵至第2天成为酸浆水,其通过靠近地面的半封闭管道进入下一生产环节,用于豆腐点浆。但是黄浆水营养成分丰富,有机物含量高,易于微生物生长繁殖,容易变质污染管道以及周边空气环境,所以应使用食品级的清洗溶液对生产过程中管道进行C I P系统清洗消毒处理,且管道须全密闭3 9。由于蜡样芽孢杆菌能附着于食物接触面、生产设备、不锈钢工具等表面并形成生物膜,并在表面积累繁殖,所以在白坯车间应该对放置白坯的托盘、链条等工具进行按时灭菌消毒处理。如采用湿热灭菌的方式对腐乳生产用布料进行灭菌、用次氯酸钠对器具进行清洗消毒再高温蒸汽灭菌等4 0。第三,车间控制措施。整个厂区的环境卫生应保持清洁,加强防虫、防鼠措施,对腐乳生产车间进行消毒,对发酵房进行喷洒醋酸预处理,形成弱酸性环境后再进行发酵,这样可以进一步改善发酵环境,抑制杂菌生长4 1。在发酵房的预处理方面,还可以使用紫外灯照射2 54 0 m i n,或者采用臭氧、冰醋酸对生产车间进行消毒,通过以上处理后,空气中蜡样芽孢杆菌数量明显降低2 6。腐乳生产行业应进一步强化管理,加强对腐乳生产环节的监测,制定严格的操作卫生管理制度,建立有效的危害分析与关键控制点(h a z a r d a n a l y s i s a n d c r i t i c a l c o n t r o l p o i n t,HA C C P)体系以及I S O 2 2 0 0 0食品安全质量管理体系,从而有效控制腐乳及生产过程中的蜡样芽孢杆菌。3.5 其他控制措施电离辐射可作用于环境或者组成微生物的物质,使物质氧化或产生自由基,再作用于生物分子,破坏或者改变微生物大分子结构,从而起到抑菌作用。常用放射性同位素铯-1 3 7和钴-6 0发射出射线,对食品进行辐照处理,该方法效率高、无残留、对食品营养成分不造成破坏,但是缺点是设备贵重,需专业人员管理7。黄训端等4 2采用响应面试验设计,考察了高静压处理蜡样芽孢杆菌菌悬液对其致死率的影响,结果表明压力、温度、时间对菌株致死率均有显著影响,在5 0 0 MP a、6 0 处理2 0 m i n的条件下蜡样芽孢杆菌致死率达1 0 0%。低温发酵对蜡样芽孢杆菌细胞的影响结果表明,低温和厌氧条件限制了蜡样芽孢杆菌的生712第4 8卷 第9期2 0 2 3年9月 中 国 调 味 品C h i n a C o n d i m e n t专论综述 长,部分原因是无法合成适应低温所必需的低熔点脂肪酸,且低温条件下发酵代谢也进行了改变,所以可以通过调整后酵温度和真空条件来抑制包装腐乳中蜡样芽孢杆菌的生长4 3。B a n d a r a等4 4研究了噬菌体对发酵食品中蜡样芽孢杆菌的杀灭效果,从1 3个韩国发酵食品中分离得到2个噬菌体,它们的寄主范围均局限于蜡样芽孢杆菌,可以用于抑制蜡样芽孢杆菌在发酵食品系统模型中的生长,优化噬菌体的反应条件是成功利用噬菌体进行生物防治的关键。4 蜡样芽孢杆菌的检测方法4.1 传统检测方法蜡样芽孢杆菌传统检测方法包括平板计数法和MP N计数法。国标G B 4 7 8 9.1 42 0 1 4 食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽孢杆菌检验 是我国规定的检测食品中蜡样芽孢杆菌的标准方法。传统培养即通过各种不同的显色培养基,使该菌产生特有的颜色与菌落形态。除了以上传统的方法外,还可通过自动细菌鉴定仪对菌种进行鉴定。目前常用的全自动细菌鉴定仪有P h o e n i xTM-1 0 0和V I T E K 2。前者可以同时对1 0 0个样本进行5 1项药敏试验和生化反应,仅有革兰氏阴性和阳性两种检测卡,选板方便;后者可以进行3 0多项生化反应。全自动微生物鉴定系统优于普通生化反应项目,可信度高、简单快速、结果准确4 5-4 6。但是通过以上传统的培养方法和生化检测方法无法说明细菌产毒素的能力,具有一定的局限性。4.2 分子生物学检测方法4.2.1 传统聚合酶链式反应聚合酶链式反应(p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n,P C R)是一种广泛使用的食源性病原体检测技术,基于D N A聚合酶产生特定D N A序列的体外扩增。直到2 0 0 4年,P C R才可用于特异性检测呕吐型蜡样芽孢杆菌引物,因为蜡样肽生物合成的分子机制尚不清楚。基于微生物特异性靶基因的聚合酶链式反应检测方法,利用D NA聚合酶扩增蜡样芽孢杆菌的特异性基因片段,从而对蜡样芽孢杆菌进行快速检测。P C R检测蜡样芽孢杆菌的特异性靶基因主要有1 6 S r R NA、r p o B、g y r B和g r o E L等,其中1 6 S r R NA具有高度保守性,是蜡样芽孢杆菌的高拷贝保守基因;r p o B和g y r B分别编码R NA聚合酶-亚基和D NA旋转酶-亚基,g r o E L可编码分子伴侣蛋白4 7-4 8。当使用不同的引物时,测定的快速性和灵敏性可能不同。目前用于检测呕吐型蜡样芽孢杆菌的主要方法是聚合酶链式反应,且P C R法仍然是呕吐型蜡样芽孢杆菌检测的最可靠方法4 9。4.2.2 多重P C R检测多重P C R检测指在同一体系中,放入多对引物对其进行同时扩增的一种P C R检测,其原理类似于普通P C R。但是多重P C R更加敏捷快速,可以同时检测较高同源性的芽孢杆菌菌株5 0。通过设计引物和探针,优化反应条件,建立多重P C R方法检测蜡样芽孢杆菌1 6 S r R N A保守区基因及其编码致呕吐型毒素c e r e u l i d e的c e s基因,结果表明与菌株鉴定结果的符合率为1 0 0%5 1。H i k m a t e等5 2用多重P C R方法分离并检测了谷物和玉米发酵制品中蜡样芽孢杆菌的p X O 1和p X O 2质粒5 3,结果表明大部分族群有溶血素,其中两个亚种具有肠毒素活性。4.2.3 实时荧光定量P C R检测实时荧光定量P C R(r e a l-t i m e f l u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v e P C R,R T-q P C R)检测技术是通过将可被检测到的荧光化学剂放入P C R体系中,根据其产生信号的强弱判断P C R产物的量从而实现定量检测的方法。王振国等5 4采用R T-q P C R检测蜡样芽孢杆菌,其检出限为8 C F U/m L,且用P C R技术对食物样品中致病性蜡样芽孢杆菌的检出限低。刘芳等5 5采用实时荧光P C R法对与肠毒素、非溶血性肠毒素、呕吐型毒素等相关的基因进行检测,结果表明方法特异性好,检出限可达6 3 C F U/m L。R T-q P C R的扩增和检测一步即可完成,特异性强、灵敏度高、检测周期短;缺点是需要昂贵的设备和试剂。4.2.4 环介导等温扩增技术检测环介导等温扩增(l o o p-m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n,L AMP)技术是一种核酸扩增方法,与常规P C R相比,不需要模板热变形、温度循环等过程,等温环境下即可工作,阳性结果可以肉眼直接观察评估,可用于蜡样芽孢杆菌的快速检测5 6。L AMP针对靶基因的6个不同区域,然后设计4个特异性引物以高选择性扩增靶序列。贾雅菁等5 7根据蜡样芽孢杆菌溶血性肠毒素基因h b l A序列设计引物后建立环介导等温扩增技术检测方法,对溶血毒素的h b l A基因进行鉴定,结果表明该方法比普通环介导等温扩增技术的敏感度高出1 0倍。齐哲5 8通过建立L AMP对蜡样芽孢杆菌的快速测定方法进行研究,结果表明L AMP扩增时间段最短仅需2 0 m i n,实际样品检测结果显示,该方法敏感性为1 0 0%,特异性为7 2.7%,符合率为9 4.5%。该方法扩增反应程序比经典P C R和R T-q P C R需要的时间更少,不需要昂贵的设备,但是该方法存在假阳性率,且需要复杂的多引物设计,对初学者来说比较麻烦。4.3 免疫学检测方法免疫学检测方法是将被检测的样品作为抗原,通过免疫反应制备单克隆抗体,再通过抗原抗体的反应判断其含量的方法4 7,最常用的方法为酶联免疫吸附测定(e n z y m e l i n k e d i mm u n o s o r b e n t a s s a y,E L I S A)法,其次为胶体金法。E L I S A是将待测物与酶连接,812专论综述 第4 8卷 第9期2 0 2 3年9月 中 国 调 味 品C h i n a C o n d i m e n t通过酶与底物的颜色反应可以直接定量大分子质量的蛋白或细菌,也可以直接检测蜡样芽孢杆菌细胞以及毒素。即使样品中有多种致病菌,也可以准确地定量到蜡样芽孢杆菌。通过胶体金检测试纸条法测定蜡样芽孢杆菌溶血素和非溶血性肠毒素,检测时间短,仅需3 0 m i n。但是由于蜡样芽孢杆菌不同菌株的产毒能力不同,以少数毒素作为检测靶标可能导致漏检。但与酶联免疫吸附测定法相比,胶体金法操作程序简单,结果直观,适合现场检测5 9。4.4 全基因组测序技术全基因组测序是一种分析细菌全基因组的综合方法。该方法不但能对菌种进行鉴定,而且能对致病菌进行分型,鉴定其毒力基因与耐药基因,进一步分析致病性6 0。与传统P C R预测毒素产生能力相比,全基因组测序可以更好地预测溶血性肠毒素基因h b l和非溶血性肠毒素基因n h e的表达,提供更多有关遗传流行病学、毒理和抗菌基因的存在以及与这种被低估的风险相关的潜在危害的有用信息4 9。尽管蜡样芽孢杆菌每年会导致相当多的食源性疾病病例,但其相对温和的感染过程导致很少以足够严格的方法来调查感染情况,所以关于呕吐型蜡样芽孢杆菌基因组多样性的全基因组测序参考数据和信息比较有限。5 结论与展望本研究对腐乳中蜡样芽孢杆菌的来源、产生的毒素类型进行了综述,对腐乳及生产过程中蜡样芽孢杆菌的控制措施进行了分析,最后对蜡样芽孢杆菌的检测方法进行了介绍。虽然蜡样芽孢杆菌及其孢子在食品中的存在确实难以避免,但如果采用适当的加工条件和防治措施,则可以有效降低各生产阶段中蜡样芽孢杆菌的数量,从而降低蜡样芽孢杆菌污染。因此,良好的操作规范和严格执行食品标准和法规对食品生产者来说是必要的。本研究为腐乳生产中蜡样芽孢杆菌的控制提供了参考,为提高生产企业的腐乳质量安全水平提供了借鉴。参考文献:1 张志强,陈雅丽,刘红丽,等.2 0 1 82 0 2 1年陕西省汉中市食品蜡样芽孢杆菌污染状况研究J.医学动物防制,2 0 2 3,3 9(4):3 4 8-3 5 1.2 谢小本.腐乳生产过程中蜡样芽孢杆菌的防控探究J.食品安全导刊,2 0 1 8(7):3 3-3 4.3 陈丽仙,吴雅琨,王安如.一株益生芽孢杆菌的分离及理化性质鉴定C/中关村全球农业生物技术创新论坛论文集,2 0 1 1:5 1 8-5 2 1.4 杨久玲,张燚,黄坤宁,等.贵州市售腐乳蜡样芽孢杆菌污染研究分析J.食品安全质量检测学报,2 0 2 1,1 2(7):2 8 7 6-2 8 8 0.5 曹飞扬.北京市腐乳中蜡样芽孢杆菌检测及独立基因和耐药性研究D.哈尔滨:东北农业大学,2 0 1 7.6 张金兰,鲁绯,张伟伟,等.腐乳中蜡样芽孢杆菌污染情况的调查分析J.中国酿造,2 0 1 0,2 8(1 0):1 5-1 9.7 金泽坤.腐乳中蜡样芽孢杆菌的分离鉴定、毒性分析及大蒜精油的抑菌作用与机理研究D.广州:华南理工大学,2 0 2 1.8C U I H Y,L U J Y,L I C Z,e t a l.A n t i b a c t e r i a l a n d p h y s i c a l e f f e c t s o f c a t i o n i c s t a r c h n a n o f b e r s c o n t a i n i n g c a r v a c r o l c a s e i n n a n o p a r t i c l e s a g a i n s t B a c i l l u s c e r e u s i n s o y p r o d u c t sJ.I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f F o o d M i c r o b i o l o g y,2 0 2 2,3 6 4:1 0 9 5 3 0.9K R AME R J M,G I L B E R T R J.B a c i l l u s c e r e u s a n d o t h e r B a c i l l u s s p e c i e sM/D O Y L E M P(e d).F o o d B o r n e B a c t e r i a l P a t h o g e n s,B o c a R a t o n:C R C P r e s s,1 9 8 9:2 1-7 0.1 0B U D K A H,B U N C I C S,C O L I N P,e t a l.O p i n i o n o f t h e s c i e n t i f i c p a n e l o n b i o l o g i c a l h a z a r d s o n B a c i l l u s c e r e u s a n o t h e r B a c i l l u s s p p.i n f o o d s t u f f sJ.E F S A J o u r n a l,2 0 0 5,1 7 5:1-4 8.1 1 刘芳,兰金学,李碧芳,等.国内外即食品微生物限量标准解析J.食品与生物技术学报,2 0 1 7,3 6(2):2 1 5-2 2 3.1 2 食品中蜡样芽孢杆菌解读N.中国工商报,2 0 2 0-0 6-1 1(A 8).1 3 杨艳华,吕鹏,陈可平.蜡样芽孢杆菌主要毒素及检测方法的研究进展J.生命科学研究,2 0 2 1,2 5(6):4 7 1-4 7 9.1 4 张伟伟.腐乳生产过程中蜡样芽孢杆菌的防控D.天津:天津科技大学,2 0 1 0.1 5A R N E S E N L P S,F A G E R L UN D A,G R A N UM P E.F r o m s o i l t o g u t:B a c i l l u s c e r e u s a n d i t s f o o d p o i s o n i n g t o x i n sJ.F EM S M i c r o b i o l o g y R e v i e w s,2 0 0 8,3 2(4):5 7 9-6 0 6.1 6 周婷婷.蜡样芽孢杆菌在腐乳中的污染状况及其控制方法研究D.广州:华南理工大学,2 0 1 3.1 7 张伟伟,鲁绯,张金兰,等.食品中蜡样芽孢杆菌的研究进展J.中国酿造,2 0 1 0,2 2(5):1