内含子的比较.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,8.5,不同类型内含子的比较,内含子类型,细胞内定位,GU-AG,GC-AG,AU-AC,细胞核,I,类,细胞器，细菌，低等真核生物细胞核中,II,类,细胞器，细菌,双内含子,细胞器,tRNA,前体中的内含子,细胞核,8.5.1.1,型内含子,概念,:,：,1980,年代初，发现原生动物四膜虫,(,Tetruhymenu,),的,rRNA,内含子能够自我剪接,(self splicing),，这一类内含子后被称作,型内含子,.,后来在酵母菌的线粒体,rRNA,基因中也含有此类内含子,.,发现过程,为,:,1980,年,科学工作者将四膜虫,rRNA,基因克隆到质粒中，并与,E,.,coli,的,RNA,聚合酶一起保温，发现转录产物除了有约,400nt,的,rRNA,内含子外，还有一些小片段。从凝胶中回收,rRNA,前体，在,无蛋白质的条件下,保温培养，单一的,rRNA,前体依然可形成片段更小的电泳条带，其中移动最快的是,39nt,的条带，测序发现，它相当于,413nt,的,rRNA,内含子中的片段。将四膜虫,26S,rRNA,基因的一部分,(,第,l,个外显子,303bp+,完整的内含子,413bp+,第,2,个外显子,624bp),克隆到含噬菌体,SP6,启动子的载体内，再转录该重组质粒，将获得的产物与,GTP,一起保温，可以得到剪接产物，但缺乏,GTP,时无剪接反应，证明,rRNA,前体的确可以进行有,GTP,参与的自我剪接。,8.5.1.2,型内含子的剪接机制,(1)I,型内含子剪接的过程,I,型内含子剪接的,第一次转酯,反应，是由一个游离的,鸟苷或鸟苷酸,(GMP,GDP,或,GTP),启动的。鸟苷酸或鸟苷的,3,-OH,亲核攻击内含子,5,-,端剪接点的磷酸二酯键，将,G,转移到内含子的,5,-,端，同时切割内含子与上游外显子之间的磷酸二酯键，在上游外显子末端产生新的,3,-OH,。在,第二次转酯反应,中，上游外显子,3,-OH,攻击内含子,3,-,端剪接点的磷酸二酯键，将上游外显子和下游外显子连接起来，并,释放线性的内含子,。两次转酯反应是连续的，即外显子连接和线性内含子的释放同时进行。因此，实验不能得到游离的上游外显子和下游外显子,。,第三次转酯反应,是线性内含子的,环化,，发生在已切除的内含子片段中，内含子的,3,-OH,攻击其,5,-,端附近的第,15,和第,16,核苷酸之间的磷酸二酯键，从,5,-,端切除,15nt,的片段，并形成,399nt,的环状,RNA,。环状,RNA,随即被切割生成线状,RNA,，由于切割位置与环化位置相同，生成的线状,RNA,依然为,399nt,。接着，再从,5,-,端切去,4,个核苷酸，最终产物是,395nt,的线性,RNA,，由于这一产物比最初释放的内含子,少,19,个核苷酸,，因而被称作,L19,。,(2)I,型内含子的结构,I,型内含子剪接的最重要特点是自我催化,(self-catalysis),，,I,型内含子的自我剪接活性依赖于,RNA,分子中的,碱基配对,。通过比较不同的,I,型内含子序列，发现其中有,9,个主要的碱基配对区域，命名为,P1,P9,，在,I,型内含子中高度保守的双链结构有,3,个，即,P1,的内部引导序列,(internal guide sequence,IGS,),，,P4,的保守短序列元件,P/Q,，和,P7,的保守短序列元件,S/R,，其他配对区的序列因内含子不同而异。,I,型内含子自我剪接所需的最小催化活性中心由,P3,、,P4,、,P6,和,P7,组成。该结构包括由两个结构域构成的催化核心，每个结构域由两个碱基配对区域构成。包含上游外显子末端序列和内含子端,IGS,的,P1,，构成底物结合位点，,IGS,是内含子中能与外显子进行碱基配对的序列，这种配对使剪接位点暴露而易受攻击，同时使剪接反应具有专一性,(,图,8-16),。,I,型内含子的特征,1.,边界顺序为,5UG 3;,2.,具有,中部核心结构,（,Central core structure);,3.,内部引导顺序,(Internal guide,seguence,IGS);,4.,剪接通过转酯反应（,Transesterification,).,8.5.2.1 II,型内含子的特点,II,型内含子主要存在于某些真核生物的线粒体和叶绿体,rRNA,基因中，也具有催化功能，能够完成,自我剪接,.,几乎所有的细菌,II,型内含子能够,编码逆转录酶,，并可作为逆转录转座子，或逆转录转座子的衍生物高频率插入特定区域，或低频率插入其它区域。,II,型内含子是由内含子靠近,3,-,端的腺苷酸,2,-,羟基攻击,5,-,磷酸基启动剪接过程，经过两次转酯反应连接两个外显子，并切除形成,套索结构的内含子,(,图,8-17),。,8.5.2.2,II,型内含子的剪接机制,II,型内含子的,5,-,端和,3,-,端剪接位点序列为,5,GUGCGYnAG3,，符合,GUAG,规则。,II,型内含子的空间结构保守而复杂，其自我剪接的活性有赖于其二级结构和进一步折叠的构象，因此在细胞内的存在受到限制。在,II,型内含子特有的二级结构中，有,6,个茎环结构形成的结构域,(dl,d6),，在空间上靠近的,d5,和,d6,，构成催化作用的活性中心,(,图,8-18),。,在,II,型内含子剪接过程中，首先由内含子靠近,3,-,端,d6,结构中的分支点保守序列上,A,的,2,-OH,向,5,-,剪接位点的磷酸二酯键发动亲核攻击，形成外显子,1,的,3,-OH,，内含子,5,-,端的磷酸基与分支点,A,的,2,-OH,基形成,2,5,-,磷酸,二酯键,，产生套索结构，完成,第一次转酯反应,。接着，外显子,1,的,3,-OH,亲核攻击,3,-,剪接位点，切断,3,-,剪接位点的磷酸二酯键，并形成外显子,1,与外显子,2,之间的,3,5,-,磷酸二酯键，完成,第二次转酯反应,。经过两次转酯反应，两个外显子被连接在一起，并释放含有,套索结构的内含子,。,II,型内含子主要的转座事件是,归巢,(homing),，归巢的实质是以内含子,RNA,作为模板，,将逆转录合成的,DNA,插入靶位点,。逆转录反应由与,RNA,内含子结合的,RT,催化，属于靶位点为引物的逆转录,(target-primed reverse transcription),。如图,8-20,所示，归巢反应开始于双链,DNA,外显子连接点上,RNA,内含子在靶位点的反拼接,(reverse splicing),插入，这一步由,RNA,催化，,RT,协助，相当于由成熟酶协助的拼接反应的逆反应。随后，,RT,的,En,结构域在下游,9,bp,10,bp,的位置切开,DNA,的另一条链，再由,RT,催化，以被切开的,DNA,链作为引物进行逆转录反应。最后，通过,DNA,的修复合成和连接完成内含子的插入过程。,Splicing releases a mitochondrial group II,intron,in the form of a stable lariat.,8.5.3,内含子剪接机制的比较,从内含子的剪接机制来看，,I,型内含子、,II,型内含子和核,pre-mRNA,剪接的,III,型内含子是相似的，只有,tRNA,的,IV,型内含子剪接机制完全不同。,I,型内含子剪接与核,Pre-mRNA,剪接体切除内含子的主要区别是，剪接体内含子使用内含子自身的一个核苷酸，而,I,型内含子的剪接反应使用外源核苷酸，即鸟苷酸或鸟苷，因此在剪接过程中不能形成套索结构。,III,型内含子的剪接体内,snRNA,的整体形态和,II,型内含子自我剪接时的形态类似，特别是剪接体的,snRNA,和,II,型内含子的催化部位之间的结构和功能十分相似。可以认为，这些,snRNA,可能来自早期自我剪接系统的,II,型内含子,I,型内含子与,II,型内含子都能够完成自我剪接，不像,III,型内含子那样需要结构复杂的剪接体。正因为如此，,I,型内含子与,II,型内含子剪接的效率和调控远远比不上,III,型内含子。,I,型内含子的剪接反应使用外源,鸟苷酸或鸟苷,，,II,型内含子的转酯反应无需游离鸟苷酸或鸟苷的启动，由内含子,内部的腺苷酸,引起，也许,II,型内含子剪接的效率和精确度比,I,型内含子更好一些。,8.6,核酶,8.6.1,核酶的发现,1982,年,Cech,等研究原生动物嗜热四膜虫,rRNA,的转录后加工，发现,rRNA,的前体可以在鸟苷与镁离子存在下切除自身的内含子，将两个外显子拼接为成熟的,rRNA,分子，该反应不需要任何蛋白质类型的酶参与，因此,Cech,认为该,rRNA,前体具有催化功能，并将其命名为,核酶,(,ribozyme,).,Cech,和,Altman,因发现,Ribozyme,而获得,1989,年度诺贝尔化学奖。,1985,年,Cech,等通过进一步研究，从切除的内含子中分离得到,L19RNA,，可参与如转核苷酸反应、水解反应、转磷酸反应等。,L19RNA,催化的转核苷酸反应如图,8-21,所示，可以看出，,L19RNA,既可从寡聚,C,切除核苷酸,(,图,8-21,和,),，也可在寡聚,C,上添加核苷酸,(,图,8-21,和,),，其催化过程具备酶的所有基本特征。,核酶作用的特点：,1,，化学本质,RNA,2,，底物,RNA,肽键,-,葡聚糖分子酶,3,，反应特异性,4,，催化效率低,5,，产物,Reactions catalyzed by RNA have the same features as those catalyzed by proteins,although the rate is slower.The K,m,gives the concentration of substrate required for half-maximum velocity;this is an inverse measure of the affinity of the enzyme for substrate.The turnover number gives the number of substrate molecules transformed in unit time by a single catalytic site.,核酶的分类,8.6.3,核酶的结构,核酶的催化功能与其空间结构密切相关，已知有多种不同结构的核酶。例如，,I,型和,II,型自我剪接内含子、锤头型、,RNaseP,的,Ml RNA,、发夹型、丁型肝炎病毒,(hepatitis delta virus,HDV),的基因组和反基因组等。,锤头型、发夹型和,HDV,正负链核酶,均能促使自身或底物,RNA,裂解，产生,2,3,-,环磷酸酯和,5,-OH,锤头结构,(hammerhead structure),。锤头结构包含,3,个茎环区以及,13,个保守核苷酸构成的催化中心，可以由一条,RNA,链回折形成,(,图,8-22a),，也可由底物链和催化链共同构成,(,图,8-22b),，两种形式的锤头结构都可构成如图,8-22c,所示的空间结构，即酶的活性中心。事实上无论自我剪切型的核酶，或者酶与底物,RNA,之间，只要能形成锤头二级结构，并具备,11,13nt,的保守序列，就能在锤头结构,GUN,序列的,3,-,端自动发生剪切反应。,核酶的活性部位是暴露在分子表面的一段保守核苷酸区域，无论,RNA,分子形成的是二级或三级结构，都使得这个区域保持一种特定的分子环境，能使自身,RNA,分子断裂，或者使另一底物分子的磷酸二酯键断裂，或在切割一个磷酸二酯键的同时，形成另一个新的磷酸二酯键。核酶,RNA,与底物,RNA,之间的相互作用依赖于碱基配对，形成一种催化环境。,核酶是一种金属离子依赖酶,金属离子的结作用：,特异的结构作用或参与活性部位的化学过程,促进,RNA,整体折叠,二价金属离子（,Mg,2+,),与底物活性部位直接相互作用或参与过渡中间复合物的产生,