基因工程操作程序.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,1.2 基因工程的基本操作程序,专题基因工程,知识回顾,：,1,、基因的本质是什么？,2,、生物的性状是由什么控制的？,3,、蛋白质的合成要经过哪两个阶段？,补：原核细胞的基因结构,非,编码区,非,编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与,RNA,聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA,聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，,RNA,聚合酶沿,DNA,分子移动，并以,DNA,分子的一条链为模板合成,RNA,。,转录完毕后，,RNA,链释放出来，紧接着,RNA,聚合酶也从,DNA,模板链上脱落下来。,不能转录为信使,RNA,，,不能编码蛋白质。,：能转录相应的信使,RNA,，,能,编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的基因结构,有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中最重要的是位于编码区上,游的,RNA,聚合酶结合位点。,启动子,补：真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,与,RNA,聚合酶,结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显,子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列,包括位于编码区上游的,RNA,聚合酶结合位点。,非,编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_,的,编码区是间隔的、,_,的,相同点,都由,能够编码蛋白质的,_,和具有调控作用的,_,区组成的,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,启动子与起始密码,终止子与终止密码,起始密码,终止密码,启动子,终止子,基因工程基本操作的四个步骤,1,、目的基因的获取,2,、基因表达载体的构建,3,、将目的基因导入受体细胞,4,、目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,1,、目的基因主要是指,_,编码蛋白质的结构基因,2,、获取目的基因的常用方法有哪些,?,（,1,）从基因文库中获取,（,2,）利用,PCR,技术扩增,（,3,）人工合成,(,一,),从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,基因文库,基因组文库,部分基因文库,（如,:,cDNA,文库）,1.,基因文库,基因组文库与部分基因文库的关系,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢,?,2.,基因文库的构建方法,供体细胞中的,DNA,许多,DNA,片段,运载体,限制酶,与载体连接,载入,受体细胞,产生特定性状,导入,外源,DNA,扩增,目的基因,分离,(,一,),从基因文库中获取目的基因,反转录法：,以目的基因转录成的信使,RNA,为模板，反转录成互补的单链,DNA,，,然后在酶的作用下合成双链,DNA,，,从而获得所需的基因。,目的基因的,mRNA,单链,DNA,反转录酶,2.,基因文库的构建方法,DNA,聚合酶,双链,DNA,(,目的基因,),根据已知的氨基酸序列合成,DNA,法,：,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使,RNA,序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA,的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,2.,基因文库的构建方法,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？,优点,缺点,直接法,反转录法,根据已知氨基酸合成,DNA,法,操作简便广泛使用,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦，,mRNA,很不稳定，要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,思考,:,为什么要构建基因文库,?,直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗,?,概念：,PCR,全称为,_,，是一项,在生物,_,复制,_,的核酸合成技术,条件：,_,、,_,、,_ _.,前提条件：,原理：,_,方式：,以,_,方式扩增，即,_,（,n,为扩增循,环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定,DNA,片段,DNA,复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA,聚合酶,指数,2,n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,(,二,),利用,PCR,技术扩增目的基因,PCR,循环,-,变性,PCR,循环,-,变性,PCR,循环,-,变性,PCR,循环,退火,PCR,循环,延伸,PCR,循环,延伸,PCR,循环,延伸,PCR,循环,延伸,过程：,a,、,DNA,变性,（,90-96,）：双链,DNA,模板,在热作用下，,_,断裂，形成,_,b,、,退火,（,复性,55-60,）：系统温度降低，引物与,DNA,模板结合，形成局部,_,。,c,、,延伸,（,70-75,）：在,Taq,酶的作用下，从引物的,3,端,延伸，合成与模板互补的,_,。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,DNA,双链,单链,变性（加热）,复性（缓慢冷却）,DNA,分子的热变性原理：,变性的目的：,复性的目的：,解开双链,有利于引物,和引物,与两条单链的结合,PCR,技术与体内,DNA,复制的区别：,1.PCR,不需要解旋酶；体内,DNA,复制需要；,2.PCR,需要耐热的,DNA,聚合酶（常用,TaqDNA,聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；,3.PCR,一般要经历三十多次循环，而生物体内,DNA,复制需要生物体自身的复制。,1.,用一定的,_,切割,质粒，使其出现一个切,口，露出,_,。,2.,用,_,切断目,的基因，使其产生,_,_,。,(,二,),基因表达载体的构建,核心,3.,将切下的目的基因片段插入质粒的,_,_,处，,再加入适量,_,，形成了一个重组,DNA,分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA,连接酶,相同,质粒,DNA,分子,限制酶处理,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA,连接酶,重组,DNA,分子（重组质粒）,核心,同一种,(,二,),基因表达载体的构建,4.,过程,:,5.,基因表达载体的,组成：,复制原点,+,目的基因,+,启动子,+,终止子,+,标记基因,它们有什么作用？,(,三,),将目的基因导入受体细胞,转化,:,方法,将目的基因导入,植物细胞,将目的基因导入,动物细胞,将目的基因导入,微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入,_,内，并且在 受体细胞内维持,_,和,_,的过程,受体细胞,稳定,表达,1,、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法,（,1,）农杆菌介绍,（,2,）原理及适用范围,(,三,),将目的基因导入受体细胞,2,、将目的基因导入动物细胞,（,1,）方法：显微注射法,（,2,）程序：,(,三,),将目的基因导入受体细胞,3,、将目的基因导入微生物细胞,（,1,）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？,（,2,）方法：,大肠杆菌的转化方法：,首先用,Ca,2+,（,常用氯化钙）处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中,DNA,分子的生理状态，这种细胞称为,感受态细胞,。,第二步是将重组表达载体,DNA,分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收,DNA,分子，完成转化过程。,四、目的基因的检测和鉴定,目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传性状，只有通过,检测与鉴定,才能知道。这是检查基因工程是否成功的一步。,你认为需要检测哪几方面的内容？怎么做？,首先,，要检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。,检测方法是采用,DNA,分子杂交技术。,其次,，还需要检测目的基因是否转录出了,mRNA,，,这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。,检测方法是采用,DNA,分子杂交技术。,最后,，检测目的基因是否翻译成蛋白质。,检测方法是进行,抗原,-,抗体杂交。,第四，个体生物学水平的鉴定：,一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。,有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。,思考：,请你写出目的基因在受体细胞中，遗传信息的传递过程。,基因在不同生物的体内控制合成的蛋白质是一样的，这说明了什么？,1,、基因工程是在,DNA,分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步是 （）,A,、,人工合成目的基因,B,、,目的基因与运载体结合,C,、,将目的基因导入受体细胞,D,、,目的基因的检测和表达,C,2,）有关基因工程的叙述中，错误的是,（）,A,、,DNA,连接酶将黏性末端的碱基对连接起来,B,、,限制性内切酶用于目的基因的获得,C,、,目的基因须由运载体导入受体细胞,D,、,人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,3,、水母发光蛋白由,236,个氨基酸构成，其中有三种氨基酸构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记。在转基因技术中，这种蛋白质的作用是（,）,A.,促使目的基因导入宿主细胞中,B.,促使目的基因在宿主细胞中复制,C.,使目的基因容易被检测出来,D.,使目的基因容易成功表达,C,4,、干扰素是治疗癌症的重要物质，人血液中每升只能提取,0.05g,干扰素，因而其价格昂贵，平民百姓用不起。但美国有一家公司用遗传工程方法合成了价格低廉、药性一样的干扰素，其具体做法是：,（,1,）从人的淋巴细胞中提取能指导干扰素合成的,，并使之与一种叫做质粒的,DNA,结合，然后移植到酵母菌内，从而用酵母菌来,。,（,2,）酵母菌能用,方式繁殖，速度很快，所以，能在较短的时间内大量生产,。利用这种方法不仅产量高，并且成本也较低。,基因,产生,干扰素,出芽,干扰素,体内,DNA,复制的条件：,解旋酶,DNA,母链,4,种脱氧核苷酸,DNA,聚合酶,打开,DNA,双链,模板,合成子链原料,催化子链合成,