基因工程的基本操作程序(优质课).ppt

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（）,A,大豆基因中内含子是能够编码蛋白质的序列,B,乳酸菌与酵母菌基因结构中都存在外显子和内含子,C,大肠杆菌基因与,RNA,聚合酶结合位点位于编码区的下游,D,水稻细胞基因的编码区中存在非编码序列,2,（多选）原核细胞与真核细胞基因结构的共同特点是（）,A,编码区都有能编码蛋白质的序列,B,编码区都是连续的,C,非编码区都能调控遗传信息的表达,D,非编码区都有,RNA,聚合酶结合的位点,D,ACD,1,、目的基因的获取,2,、基因表达载体的构建,3,、将目的基因导入受体细胞,4,、目的基因的检测与鉴定,知识点二,.,基因工程基本操作的四个步骤,有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用,载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。,一、目的基因的获取,(,一,),、目的基因主要是,_,编码蛋白质的基因,（二）、获取目的基因的常用方法有哪些,?,1,、从基因文库中获取,2,、利用,PCR,技术扩增,3,、人工合成,阅读教材,P8-11,如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。,1,、从基因文库中获取目的基因,（,1,）,.,基因文库,将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,种类,基因组文库：,含有一种生物的,全部,基因,部分基因文库：,只包含了一种生物的,部分,基因，,如：,cDNA,文库,提取某种生物的,全部,DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的,DNA,片段,将,DNA,片段与载体连接,重组载体,基因组文库,导入受体菌中储存,（,2,）,.,基因文库的构建方法,基因组文库的构建,提取某种生物的,某器官,或,特定发育时期,的,mRNA,单链,DNA,双链,cDNA,片段,重组载体,与载体连接,cDNA,文库,反（逆）转录酶,DNA,聚合酶,导入受体菌中储存,cDNA,文库的构建,-,逆转录法：,基因组,DNA,文库,cDNA,文库,基因组,DNA,文库与,cDNA,文库的比较,某生物体内全部,DNA,许多,DNA,片段,受体菌群体,限制酶,与运载体连接导入,基因组文库,cDNA,反转录,受体菌群体,与运载体连接导入,部分基因文库,（,cDNA,文库）,基因组,DNA,文库与,cDNA,文库的比较,某种生物某个时期的,mRNA,真核生物的基因用逆转录法得到的,cDNA,与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？,思考？,编码区,非编码区,非编码区,DNA,聚合酶,剪接有关的酶,RNA,聚合酶,mRNA,前体,mRNA,单链,DNA,cDNA,逆转录酶,转录,剪接,逆转录,复制,启动子,终止子,基因,不含,非编码系列,。即不含,非编码区,和,内含子,1.2,基因工程的基本操作程序,（第,2,课时）,（,1,）,（,2,）,（,2,）,（,7,）,（,9,）,（,8,）,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,（,5,）,（,6,）,（,3,）,（,4,）,（,9,）：,（,8,）：,复习回顾：,1,、,真核细胞的基因结构,某生物体内全部,DNA,许多,DNA,片段,受体菌群体,限制酶,与运载体连接导入,基因组文库,cDNA,反转录,受体菌群体,与运载体连接导入,部分基因文库,（,cDNA,文库）,基因组,DNA,文库与,cDNA,文库的比较,某种生物某个时期的,mRNA,基因组,DNA,文库与,cDNA,文库的比较,（,3,）构建基因文库的目的,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢,?,便于在,不知道目的基因核苷酸序列,的情况下，获得所需的目的基因。,依据：目的基因的有关信息。,如：根据基因的核苷酸序列,基因的功能,基因在染色体上的位置,基因的转录产物,mRNA,基因翻译产物蛋白质等特性,（,4,）从基因文库中得到目的基因的方法,直接分离法,(,鸟枪法,),1,、构建基因组,DNA,文库时，首先应分离细胞的,A,、染色体,DNA B,、线粒体,DNA,C,、总,mRNA D,、,tRNA,2,、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是,A,、某生物的全套基因就是一个基因文库,B,、将含有某种生物不同的许多,DNA,片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库,C,、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库,D,、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫,cDNA,文库,A,C,概念：,PCR,全称为,_,，是一项,在生物,_,复制,_,的核酸合成技术,条件：,_,、,_,、,_,、,_,原理：,_,方式：以,_,方式扩增，即,_,（,n,为扩增循,环的次数）,结果：,多聚酶链式反应,体外,特定,DNA,片段,DNA,复制,已知基因的核苷酸序列,（前提）,四种脱氧核苷酸,一对引物,耐热的,DNA,聚合酶（,Taq,酶,）,指数,2,n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,2,、利用,PCR,技术扩增目的基因,过程：,a,、,DNA,变性,（,90-95,）：双链,DNA,模板,在热作用下，,_,断裂，形成,_,b,、退火,（复性,55-60,）：系统温度降低，引 物与,DNA,模板结合，形成局部,_,。,c,、延伸,（,70-75,）：在,Taq,酶的作用下，从,引物处延伸，合成与模板互补的,_,_,。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,具体过程：,PCR,技术扩增与,DNA,复制的比较,PCR,技术,DNA,复制,相同点,原理,原料,条件,不同点,解旋方式,场所,酶,结果,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA,在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的,DNA,聚合酶,细胞内的,DNA,聚合酶,大量的,DNA,片段,形成整个,DNA,分子,?,1,个,DNA,分子进行,PCR,扩增,循环,4,次，理论上至少需要,几个引物,？,2,（,2,n,-1,）,(n,为循环次数,),（,2,4,-1,）,2=30,目的基因的,mRNA,单链,DNA,(,cDNA,）,双链,DNA,(,即目的基因,),反转录,合成,1,）反转录法：,以目的基因转录成的信使,RNA,为模板，反转录成互补的单链,DNA,，然后在酶的作用下合成双链,DNA,，从而获得所需的基因。,蛋白质,的氨基酸序列,mRNA,的核苷酸序列,结构基因,的核苷酸序列,目的,基因,推测,推测,化学合成,2,）根据已知的氨基酸序列合成,DNA,法：,3,、人工合成的目的基因,小结：三种目的基因获取方法的前提条件,1,、从基因文库中获取：,2,、利用,PCR,：,3,、人工合成：,适用于目的基因的序列为未知的情况,适用于目的基因的核苷酸序列为已知的情况,适用于目的基因不是很大且序列是已知的,2,、下列属于获取目的基因的方法的是,(),利用,mRNA,反转录形成 从基因组文库中提取,从受体细胞中提取 利用,PCR,技术,利用,DNA,转录 人工合成,A.B.C.D.,1,在已知,基因的核苷酸,序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是,A,、化学合成法,B,、基因组文库法,C,、,CDNA,文库法,D,、聚合酶链反应,3,、在基因工程中，把选出的一个目的基因（共,1000,个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是,460,个）放入,DNA,扩增仪中扩增,4,次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（）个,A.540,B.8100,C.17280,D.7560,二、基因表达载体的构建,基因工程的核心,1,、目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,2,、表达载体的组成,终止子,目的基因,标记基因等,启动子,它们各自的作用是什么,?,复制原点,+,目的基因,+,启动子,+,终止子,+,标记基因,启动子,：,位于基因的首端的一段特殊的,DNA,片断，它是,RNA,聚合酶识别和结合的部位，有了它才能,驱动基因转录出,mRNA,，最终获得蛋白质,终止子,：,位于基因的尾端的一段特殊的,DNA,片断，,能终止,mRNA,的转录,标记基因,的作用是,为了,鉴别,受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。,质粒,DNA,分子,限制酶处理,二个切口,两个黏性末端,四个切口,获得目的基因,DNA,连接酶,重组,DNA,分子（重组质粒）,同一种,3.,过程,:,载体,与,表达载体,的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分,DNA,片段。表达载体在载体基础上增加了,目的基因、启动子、终止子,三部分结构,用到的工具酶：,既用到限制酶切割载体，又用到,DNA,连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键,启动子、终止子,对于目的基因表达必不可少,目的基因不能单独进入受体细胞，,必需以表达载体的方式携带进去。,注意,一、目的基因的获取,1,、从基因文库中获取,2,、利用,PCR,技术扩增,3,、人工合成,种类,基因组文库：,含有一种生物的,全部,基因,部分基因文库：,只包含了一种生物的,部分,基因，,如：,cDNA,文库,课堂小结：,二、基因表达载体的构建,启动子、终止子、标记基因、目的基因,三、将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,（二）方法,将目的基因导入,植物细胞,将目的基因导入,动物细胞,将目的基因导入,微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入,_,内，并且在 受体细胞内维持,_,和,_,的过程,受体细胞,稳定,表达,1,、将目的基因导入植物细胞的方法：,（,1,）,农杆菌转化法,农杆菌特点：,易感染,双子叶,植物和,裸子,植物，对大多数,单子叶,植物没有感染能力,原理：,Ti,质粒上的,T-DNA,可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的,DNA,上。,过程：,（,2,）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体,DNA,打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,常用于单子叶植物的转化方法,（,2,）,基因枪法,微弹轰击法,特点：成本高,适用于,单子叶植物,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,（,3,）花粉通道法,（,3,）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加,DNA,（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得,2,、将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法,程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物,3,、将目的基因导入微生物细胞,原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少,方法：,用,Ca,2+,处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收,DNA,分子,（一）、检测,1,、检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,(,关键步骤,),.,首先取出转基因生物的基因组,DNA,.,用含目的基因的,DNA,片段用放射性同位素等作标记,以此做探针,.,使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体,DNA,中,（,1,）,方法,:,DNA,分子杂交,（,2,）过程,:,四、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,归纳步骤,DNA,分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的,DNA,分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,P,15,思考与探究,（二）、鉴定（个体生物学水平）,2,、检测目的基因是否转录出了,mRNA,3,、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,:,分 子 杂 交,方法,:,抗原抗体杂交,过程,:,用上述探针和转基因生物的,mRNA,杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了,mRNA,目的基因的表达和检测,抗虫鉴定 抗病鉴定,活性鉴定等,抗原抗体杂交法,DNA-RNA,分子杂交法,DNA,分子杂交法,受体是否具有,转基因特征,个体水平,目的基因是否翻译,目的基因是否转录,目的基因是否导入,分子水平,方法,检测对象,检测,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,方法,DNA,分子杂交,表达检测,转录检测,分子杂交,翻译检测,抗原抗体,杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定,抗病鉴定,活性鉴定等,个体水平的鉴定,目的基因的表达和检测,归纳,:,基因工程的基本操作程序,获取目的基因,从基因文库,利用,PCR,化学方法人工合成,构建基因表达载体,目的基因、启动子、终止子、标记基因,将目的基因导入受体细胞,农杆菌转化法、显微注射法,目的基因的检测与鉴定,检测：是否插入、转录、翻译,鉴定：,练习,1,：,(2008,理综山东卷,),为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。,（,1,）获得耐盐基因后，构建重组,DNA,分子所用的限制性内切酶作用于图中的,处，,DNA,连接酶作用于,处。（填“,a”,或“,b”,）,a,a,练习,1,：,(2008,理综山东卷,),为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。,（,2,）将重组,DNA,分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和,法。,（,3,）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用,技术，该技术的核心是,和,。,（,4,）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的,作探针进行分子杂交检测，又要用,方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。,基因枪法（花粉管通道法）,植物组织培养,脱分化和再分化,耐盐基因,一定浓度盐水浇灌,1,）以下说法正确的是 （,）,A,、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,B,、质粒是基因工程中唯一的运载体,C,、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接,D,、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,2,）不属于质粒被选为基因运载体的理由是,A,、能复制 （）,B,、有多个限制酶切点,C,、具有标记基因,D,、它是环状,DNA,D,练习,3,）有关基因工程的叙述中，错误的是（）,A,、,DNA,连接酶将黏性末端的碱基对连接起来,B,、限制性内切酶用于目的基因的获得,C,、目的基因须由运载体导入受体细胞,D,、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,4,）有关基因工程的叙述正确的是 （）,A,、限制酶只在获得目的基因时才用,B,、重组质粒的形成在细胞内完成,C,、质粒都可作为运载体,D,、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,练习,5,）基因工程是在,DNA,分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （）,A,、人工合成目的基因,B,、目的基因与运载体结合,C,、将目的基因导入受体细胞,D,、目的基因的检测和表达,C,练习,