GB 5009.25-2016 食品安全国家标准 食品中杂色曲霉素的测定.pdf

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B5 0 0 9 .2 52 0 1 6食品安全国家标准食品中杂色曲霉素的测定2 0 1 6 - 1 2 - 2 3发布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局发 布G B5 0 0 9.2 52 0 1 6 前 言 本标准代替G B/T5 0 0 9.2 52 0 0 3 植物性食品中杂色曲霉素的测定 和S N/T2 4 8 32 0 1 0 进出口粮谷中柄曲霉素含量检测方法 液相色谱法 。本标准与G B/T5 0 0 9.2 52 0 0 3相比, 主要变化如下: 标准名称修改为“ 食品安全国家标准 食品中杂色曲霉素的测定” ; 增加了液相色谱-串联质谱法; 增加了液相色谱法。G B5 0 0 9.2 52 0 1 61 食品安全国家标准食品中杂色曲霉素的测定1 范围本标准规定了液相色谱-串联质谱法和高效液相色谱法测定杂色曲霉素的测定方法。本标准适用于大米、 玉米、 小麦、 黄豆及花生中杂色曲霉素的测定。第一法 液相色谱-串联质谱法2 原理试样中的杂色曲霉素乙腈-水溶液提取, 经涡旋、 超声、 离心, 取上清液经稀释, 通过固相萃取柱或免疫亲和柱净化、 浓缩、 甲醇-水溶液定容、 微孔滤膜过滤, 液相色谱分离, 电喷雾离子源离子化, 多反应离子监测检测, 同位素内标法定量。3 试剂和材料除非另有说明, 本方法使用的试剂均为分析纯, 水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 乙腈(CH3C N) : 色谱纯。3.1.2 甲醇(CH3OH) : 色谱纯。3.1.3 氯化钠(N a C l) 。3.1.4 磷酸氢二钠(N a2H P O4) 。3.1.5 磷酸二氢钾(KH2P O4) 。3.1.6 盐酸。3.1.7 氯化钾(K C l) 。3.2 试剂配制3.2.1 乙腈-水溶液(8 0+2 0) : 取8 0 0m L乙腈, 加2 0 0m L水, 混匀。3.2.2 乙腈-水溶液(4 0+6 0) : 取4 0 0m L乙腈, 加6 0 0m L水, 混匀。3.2.3 甲醇-水溶液(4 0+6 0) : 取4 0 0m L甲醇, 加6 0 0m L水, 混匀。3.2.4 甲醇-水溶液(7 0+3 0) : 取7 0 0m L甲醇, 加3 0 0m L水, 混匀。3.2.5 磷酸盐缓冲溶液( 以下简称P B S) : 称取8.0g氯化钠,1.2g磷酸氢二钠( 或2.9 2g十二水磷酸氢二钠) ,0. 2g磷 酸 二 氢 钾,0. 2g氯 化 钾, 用9 0 0 m L水 溶 解, 用 盐 酸 调 节p H至7. 4, 用 水 定 容至10 0 0m L。G B5 0 0 9.2 52 0 1 62 3.3 标准品3.3.1 杂色曲霉素标准品(C1 8H1 2O6,C A S号:1 0 0 4 8 - 1 3 - 2) : 纯度9 9%, 或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.3.2 1 3C1 8-杂色曲霉素同位素内标:2 5g/m L, 或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.4 标准溶液配制3.4.1 标准储备溶液(1 0 0g/m L) : 准确称取杂色曲霉素标准品1.0 0m g( 准确至0.0 1m g) , 用甲醇溶解并定容至1 0m L。溶液转移至试剂瓶中后, 密封后-2 0下保存, 保存期6个月。3.4.2 标准工作液(1g/m L) : 准确移取1.0 0m L的杂色曲霉素标准储备溶液至1 0 0m L容量瓶中, 用甲醇定容。-2 0下保存, 保存期3个月。3.4.3 同位素内标工作液(1.0g/m L) : 准确移取杂色曲霉素同位素内标(2 5g/m L)0.4 0 m L至1 0m L容量瓶中, 用甲醇定容。-2 0下保存, 保存期3个月。3.4.4 标准系列工作溶液: 准确移取标准工作液适量至5m L容量瓶中, 加入5 0L1.0g/m L的同位素内标工作液, 用甲醇-水溶 液 (7 0+3 0) 定 容 至 刻 度 ( 含 杂 色 曲 霉 素 浓 度 为1n g/m L、2n g/m L、5n g/m L、1 0n g/m L、2 0n g/m L、3 0n g/m L、4 0n g/m L、5 0n g/m L系列标准溶液) , 临用前配制。3.5 材料3.5.1 免疫亲和柱: 柱容量6 0 0n g( 柱容量验证方法参见B.2) 。3.5.2 固相萃取柱:N -乙烯吡咯烷酮和二乙烯基苯共聚物填料柱(2 0 0m g/6m L) , 或相当者。使用前分别用5m L甲醇和5m L水活化。3.5.3 微孔滤膜:0.2 2m。4 仪器和设备4.1 液相色谱-串联质谱仪: 配电喷雾离子源。4.2 高速粉碎机4.3 涡旋混合器。4.4 超声波发生器。4.5 天平: 感量为0.0 1g和0.0 0 00 1g。4.6 离心机: 转速60 0 0r/m i n。4.7 固相萃取装置( 带真空泵) 。4.8 氮吹仪。4.9 试验筛:1mm2mm孔径。5 分析步骤5.1 试样制备样品用高速粉碎机将其粉碎后过1mm2mm孔径试验筛, 混合均匀后取试样1 0 0g用于检测。5.2 试样提取称取5g均质试样( 精确至0.0 1g) 至5 0m L离心管中( 花生和黄豆样品: 称取2g均质试样) , 加入G B5 0 0 9.2 52 0 1 63 1 0 0L同位素内标工作液, 加入2 0 .0m L乙腈-水溶液(8 0 + 2 0) , 涡旋混匀后超声1 0m i n, 在60 0 0r/m i n下离心1 0m i n, 取上清液备用。5.3 净化5.3.1 固相萃取柱净化准确移取2.0m L上述上清液用水稀释至8m L待上样。将上样液转移至活化好的固相萃取柱中, 控制样液以约3m L/m i n的速度稳定下滴。上样完毕后,依次加入5m L的乙腈-水溶液(4 0+6 0) 、5m L的甲醇-水溶液(4 0+6 0) 淋洗。待淋洗结束后, 用真空泵抽干固相萃取柱, 加入6m L乙腈洗脱, 控制流速为约3m L/m i n, 用真空泵抽干固相萃取柱, 收集洗脱液。在6 0下用氮气缓缓吹至干, 用甲醇-水溶液(7 0+3 0) 定容至1.0m L, 涡旋3 0s溶解残留物,0.2 2m滤膜过滤, 收集滤液于进样瓶中以备进样。按同一操作方法做空白试验。5.3.2 免疫亲和柱净化准确移取2m L上述上清液, 加入2 8m LP B S混匀。将5 0m L一次性注射器筒与亲和柱的顶部相连。将上述样液移至注射器筒中, 调节下滴速度, 控制样液以约3m L/m i n的速度稳定下滴。待样液滴完后, 往注射器筒内依次加入1 0m LP B S和1 0m L水, 以稳定流速淋洗免疫亲和柱。待水滴完后, 用真空泵抽干亲和柱。在亲和柱下部放置1 0m L刻度试管, 取下5 0m L的注射器筒, 加入2m L乙腈洗脱亲和柱, 控制约3m L/m i n的自然下滴速度, 收集全部洗脱液至刻度试管中, 用真空泵抽干亲和柱。在6 0下用氮气缓缓地将洗脱液吹至干, 用甲醇-水溶液(7 0+3 0) 定容至1.0m L, 涡旋3 0s溶解残留物,0.2 2m滤膜过滤, 收集滤液于进样瓶中以备进样。按同一操作方法做空白试验。注:可根据实验室实际情况, 选择上述净化方法中的一种净化方法即可。5.4 仪器参考条件5.4.1 色谱参考条件a) 液相色谱柱:C1 8柱, 柱长1 0 0mm, 内径2.1mm, 粒径1.8m, 或相当色谱柱;b) 流动相:A相: 水,B相: 甲醇;c) 梯度洗脱条件:7 0% B(0m i n 5m i n) ,1 0 0% B(5m i n 8m i n) ,7 0% B(8m i n 1 2m i n) ;d) 流速:0.2m L/m i n;e) 色谱柱柱温:4 0;f) 进样量:1 0L。5.4.2 质谱参考条件a) 检测方式: 多离子反应监测(MRM) ;b) 质谱条件及离子选择参数参见表A.1;c) 子离子扫描图参见图A.1图A.2;d) 液相色谱-质谱图见图A.3。5.5 标准曲线制作将标准系列工作溶液按浓度由低到高注入液相色谱-串联质谱仪中, 测得相应色谱峰的峰面积, 以标准系列工作溶液中杂色曲霉素的浓度为横坐标, 杂色曲霉素色谱峰的峰面积与同位素内标色谱峰的峰面积的比值为纵坐标, 绘制标准曲线。G B5 0 0 9.2 52 0 1 64 5.6 试样溶液的测定将试样溶液注入液相色谱-串联质谱仪中, 测得相应色谱峰的峰面积, 根据标准曲线得到试样溶液中杂色曲霉素的浓度。如试样溶液中杂色曲霉素的浓度超出线性范围, 则需适当减少取样量按5.2、5.3处理试样后重新测定。5.7 定性试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较, 变化范围在2.5%之内。待测化合物定性离子色谱峰的信噪比3, 定量离子色谱峰的信噪比1 0。每种化合物的质谱定性离子必须出现, 至少应包括一个母离子和两个子离子, 而且同一检测批次,对同一化合物, 样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比, 其允许偏差不超过表1规定的范围。表1 定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度5 0%2 0%5 0%1 0%2 0%1 0%允许相对偏差2 0%2 5%3 0%5 0%6 分析结果的表述试样中杂色曲霉素的含量按式(1) 计算:X=Vmf(1) 式中:X 试样中杂色曲霉素的含量, 单位为微克每千克(g/k g) ; 由标准曲线得到的试样溶液中杂色曲霉素的浓度, 单位为纳克每毫升(n g/m L) ;V 最终定容体积, 单位毫升(m L) ;m 试样的称样量, 单位克(g) ;f 稀释倍数(f=1 0) ;计算结果保留三位有效数字。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的2 0%。8 其他称取大米、 玉米及小麦试样5g时, 其检出限为0.6g/k g, 定量限为2g/k g; 称取黄豆及花生试样2g时, 其检出限为1.5g/k g, 定量限为5g/k g。G B5 0 0 9.2 52 0 1 65 第二法 液相色谱法9 原理样品中的杂色曲霉素用乙腈-水溶液提取, 经均质、 涡旋、 超声、 离心等处理, 取上清液用磷酸盐缓冲液稀释, 免疫亲和柱净化、 洗脱, 氮气吹干浓缩、 流动相定容、 微孔滤膜过滤, 液相色谱分离紫外检测器检测。外标法定量。1 0 试剂和溶液除非另有说明, 本方法使用试剂均为分析纯, 水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。1 0.1 试剂和标准样品1 0.1.1 乙腈(CH3C N) : 色谱纯。1 0.1.2 甲醇(CH3OH) : 色谱纯。1 0.1.3 氯化钠(N a C l) 。1 0.1.4 磷酸氢二钠(N a2H P O4) 。1 0.1.5 磷酸二氢钾(KH2P O4) 。1 0.1.6 盐酸。1 0.1.7 氯化钾(K C l) 。1 0.2 试剂配制1 0.2.1 乙腈-水溶液(8 0+2 0) : 取8 0 0m L乙腈, 加2 0 0m L水, 混匀。1 0.2.2 乙腈-水溶液(5 0+5 0) : 取5 0 0m L乙腈, 加5 0 0m L水, 混匀。1 0.2.3 磷酸盐缓冲溶液( 以下简称P B S) : 称取8.0g氯化钠,1.2g磷酸氢二钠( 或2.9 2g十二水磷酸氢二钠) ,0.2g磷酸二氢钾,0. 2g氯化 钾, 用9 0 0 m L水溶解, 用盐 酸调节p H至7. 4, 用水 定容至10 0 0m L。1 0.3 标准品杂色曲霉素标准品(C1 8H1 2O6,C A S号:1 0 0 4 8 - 1 3 - 2) : 纯度9 9%, 或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。1 0.4 标准溶液配制1 0.4.1 标准储备溶液(1 0 0g/m L) : 准确称取杂色曲霉素标准品1.0m g( 准确至0.0 1m g) , 用乙腈溶解并定容至1 0m L。溶液转移至试剂瓶中后, 密封后-2 0下保存, 保存期6个月。1 0.4.2 标准工作液(1g/m L) : 准确移取1 0 0L的杂色曲霉素标准储备溶液至1 0m L容量瓶中, 用乙腈定容。此溶液浓度为1g/m L。-2 0下保存, 保存期3个月。1 0.4.3 标准系列工作溶液: 准确移取标准工作液适量至5m L容量瓶中, 用乙腈-水溶液(5 0+5 0) 定容至刻度( 含杂色曲霉素浓度为5n g/m L、1 0n g/m L、2 5n g/m L、5 0n g/m L、7 5n g/m L、1 0 0n g/m L系列标准溶液) , 临用前配制。G B5 0 0 9.2 52 0 1 66 1 0.5 材料1 0.5.1 免疫亲和柱: 柱容量6 0 0n g( 柱容量验证方法参见B.2) 。1 0.5.2 微孔滤膜:0.2 2m。1 1 仪器和设备1 1.1 液相色谱仪: 配紫外检测器。1 1.2 高速粉碎机1 1.3 涡旋混合器。1 1.4 超声波发生器。1 1.5 天平: 感量为0.0 1g和0.0 0 00 1g。1 1.6 离心机: 转速60 0 0r/m i n。1 1.7 固相萃取装置( 带真空泵) 。1 1.8 氮吹仪。1 1.9 试验筛:1mm2mm孔径。1 2 分析步骤使用不同厂商的免疫亲和柱, 在样品的上样、 淋洗和洗脱的操作方面可能略有不同, 应该按照供应商所提供的操作说明书要求进行操作。1 2.1 试样制备样品用高速粉碎机将其粉碎后过1mm2mm孔径试验筛, 混合均匀后取试样1 0 0g用于检测。1 2.2 试样提取称取5g已均质试样( 精确至0.0 1g) 至5 0m L离心管中, 加入2 0.0m L乙腈-水(8 0+2 0) , 涡旋混匀后超声1 0m i n, 在60 0 0r/m i n下离心1 0m i n, 取上清液备用。1 2.3 试样净化准确移取2m L上述上清液, 加入2 8m LP B S混匀。将5 0m L一次性注射器筒与亲和柱的顶部相连。将上述样液移至5 0m L注射器筒中, 调节下滴速度, 控制样液以约3m L/m i n的速度稳定下滴。待样液滴完后, 往注射器筒内依次加入1 0m LP B S和1 0m L水, 以稳定流速淋洗免疫亲和柱。待水滴完后, 用真空泵抽干亲和柱。在亲和柱下部放置1 0m L刻度试管, 取下5 0m L的注射器筒, 加入2m L乙腈洗脱亲和柱, 控制约3m L/m i n的自然下滴速度, 收集全部洗脱液至刻度试管中, 用真空泵抽干亲和柱。在6 0下用氮气缓缓地将洗脱液吹至干, 用乙腈-水(5 0+5 0) 定容至1.0m L, 涡旋3 0s溶解残留物,0.2 2m滤膜过滤, 收集滤液于进样瓶中以备进样。按同一操作方法做空白试验。1 2.4 仪器参考条件a) 液相色谱柱:C1 8柱, 柱长1 5 0mm, 内径4.6mm, 粒径3.5m, 或相当者;b) 流动相:A相: 水,B相: 乙腈;c) 梯度洗脱条件:5 5% B(0 m i n7.5 m i n) ,1 0 0% B(7.5 m i n1 0 m i n) ,5 5% B(1 0 m i nG B5 0 0 9.2 52 0 1 67 1 5m i n) ;d) 流速:0.8m L/m i n;e) 色谱柱柱温:4 0;f) 进样量:1 0 0L;g) 紫外检测器条件: 检测波长为3 2 5n m。1 2.5 标准曲线的制作将标准系列工作溶液按浓度由低到高注入液相色谱仪进行测定, 测得相应色谱峰的峰面积, 以标准系列工作溶液中杂色曲霉素的浓度为横坐标, 杂色曲霉素色谱峰的峰面积为纵坐标, 绘制标准曲线。1 2.6 试样溶液的测定将试样溶液注入液相色谱仪进行测定, 测得相应色谱峰的峰面积, 根据标准曲线得到试样溶液中杂色曲霉素的浓度。1 3 分析结果的表述试样中杂色曲霉素的含量按式(2) 计算:X=Vmf(2) 式中:X 试样中杂色曲霉素的含量, 单位为微克每千克(g/k g) ; 根据试样中杂色曲霉素的色谱峰面积, 经计算所得的浓度, 单位为纳克每毫升(n g/m L) ;V 最终定容体积, 单位毫升(m L) ;m 试样的称样量, 单位克(g) ;f 稀释倍数(f=1 0) 。计算结果保留三位有效数字。1 4 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的2 0%。1 5 其他称取大米、 玉米、 小麦、 黄豆及花生5g时, 其检出限为6g/k g, 定量限为2 0g/k g。第三法 薄层色谱法1 6 原理试样中的杂色曲霉素经提取、 净化、 浓缩、 薄层展开后, 用三氯化铝显色, 再经加热产生一种在紫外光下显示黄色荧光的物质, 根据其在薄层上显示的荧光最低检出量来测定样品中杂色曲霉素的含量。G B5 0 0 9.2 52 0 1 68 1 7 试剂和溶液除非另有说明, 本方法使用试剂均为分析纯, 水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。1 7.1 试剂和材料1 7.1.1 三氯甲烷(CHC l3) 。1 7.1.2 正己烷(C6H1 4) 。1 7.1.3 甲醇(CH3OH) 。1 7.1.4 苯(C6H6) 。1 7.1.5 冰乙酸(CH3C OOH) 。1 7.1.6 甲酸(HC OOH) 。1 7.2 试剂配制1 7.2.1 乙酸溶液: 取9 5m L乙酸和5m L水混匀。1 7.2.2 氯化钠浓度(4 0g/L) : 称取4g氯化钠(N a C l) 溶于1 0 0m L乙醇中, 混匀。1 7.2.3 三氯化铝-乙醇溶液(2 0 0g/L) : 称取2 0g三氯化铝(A l C l36 H2O) 溶于1 0 0m L乙醇中, 过滤,备用。1 7.2.4 杂色曲霉素标准使用液: 用苯将1 0g/m L的杂色曲霉素标准溶液稀释成每毫升相当于1.0g和0.4 0g的杂色曲霉素标准溶液。避光, 放置于4冰箱中保存。1 8 仪器和设备1 8.1 小型粉碎机。1 8.2 样筛( 筛孔尺寸为0.8 5 0mm和2mm) 。1 8.3 电动振荡器。1 8.4 全玻璃浓缩器。1 8.5 玻璃板:1 0c m1 0c m与1 0c m1 8.5c m两种。1 8.6 展开槽: 内长1 0c m、 宽4.5c m、 高1 7c m与内长1 1.5c m、 宽6 0c m、 高1 9c m。1 8.7 玻璃喷雾器。1 8.8 空气泵或油泵。1 9 分析步骤1 9.1 提取大米、 玉米、 小麦、 黄豆及花生: 称取2 0.0 0g过0.8 5mm筛孔的大米、 玉米、 小麦及黄豆粉碎样品( 花生粉碎样品过2 mm的筛孔) , 置于具塞锥形瓶中, 加8 0 m L甲醇-氯化钠溶液(9 0+1 0) , 振荡3 0m i n, 过滤。收集样品液4 0m L( 黄豆、 花生样品则取2 0m L, 加入2 0m L提取剂) , 移入2 5 0m L分液漏斗中, 再加入2 5m L氯化钠溶液( 使甲醇与水之体积比为5 5+4 5) 和2 5m L石油醚, 振摇2m i n, 静置分层。上层石油醚溶液置锥形瓶中, 下层溶液仍移入原分液漏斗中, 再用2 5m L石油醚提取一次。最后将两次上层的石油醚溶液合并, 加入2 5m L甲醇-氯化钠溶液(5 5+4 5) 黄豆、 花生样品则加入2 5m L甲醇-氯化钠溶液(7 0+3 0) , 振摇3 0s , 将下层并于原甲醇水层中, 重复用甲醇-氯化钠溶液(5 5+4 5) 提G B5 0 0 9.2 52 0 1 69 取两次 黄豆、 花生样品重复用甲醇-氯化钠溶液(7 0+3 0) 提取1次 , 以提取该层的杂色曲霉素。下层溶液合并后加3 0m L三氯甲烷( 黄豆、 花生样品除加三氯甲烷外, 再加1 3m L氯化钠溶液, 使甲醇与水的体积比为5 5+4 5) , 振摇2m i n, 静置。待上层混浊液有部分澄清时, 即可将下层溶液经放有约1 0g无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于蒸发皿中。于分液漏斗中再加1 0m L三氯甲烷, 重复提取1次, 将该下层溶液和用少量三氯甲烷洗滤器的洗液一并放入蒸发皿中。将蒸发皿放置于6 5水浴上挥干, 然后再在冰浴上放置2m i n 3m i n, 加1.0m L苯将残留物充分混匀, 置入小试管中。或将以上蒸发皿中残留物用三氯甲烷移于浓缩管中, 于6 5 用减压吹气法浓缩至干, 加入1.0m L苯, 供色谱测定, 此1m L大米、 玉米及小麦样液各相当于1 0g样品,1m L黄豆与花生样液则各相当于5g样品。1 9.2 测定1 9.2.1 单向展开法1 9.2.1.1 薄层板的制备称取约5g硅胶G, 加相当于硅胶量2倍3倍左右的水, 用力研磨1m i n2m i n至成糊状后立即倒于涂布器内, 推成1 0c m1 0c m, 厚度0.3mm的薄层板五块。在空气中干燥约1 5m i n后, 在1 0 0活化2h, 取出, 放干燥器中保存。一般可保存2d 3d, 若放置时间较长, 可再活化后使用。1 9.2.1.2 点样取两块1 0c m1 0c m薄层板, 在距板下端各0.8c m1c m基线上滴加标准使用液与样液如下: 距左边缘0.8c m1c m处各滴加1 0L标准使用液(0.4g/m L) , 在距左边缘4c m处各滴加8 0L样液( 黄豆、 花生样品为4 0L) , 然后在第二块板的样液点上加滴1 0L标准使用液(0.4g/m L) , 在滴加样液时可用吹风机冷风边吹边加。1 9.2.1.3 展开1 9.2.1.3.1 横向展开: 展开剂是乙醚-正己烷-苯-三氯甲烷-甲酸(3+9+1.5+1.5+0.6)1 5.6m L( 由于此混合液不成一相, 每一展开槽的用量须单独配制) 。用前充分摇匀, 一并倒入槽内使用。将靠近标准点的一边, 放入槽内展至9c m左右取出挥干。1 9.2.1.3.1 纵向展开: 展开剂为苯-甲醇-冰乙酸(9 0+8+2或9 2.5+6+1.5)1 5m L。将靠近标准点与样液点的一边放入槽内, 展开9c m左右取出挥干。1 9.2.1.4 显荧光在薄层板上喷三氯化铝-乙醇溶液(2 0 0g/L) , 置8 0加热1 0m i n, 立即在紫外光灯( 波长3 6 5n m)下观察结果, 待薄层板冷却后再薄薄的喷第2次( 不需加热) , 可直接观察结果。1 9.2.1.5 观察与评定结果在紫外光灯下观察, 若第2板的第2点在标准点的相应处出现最低检出量, 而在第1板的相同位置上未出现荧光点, 则样品中杂色曲霉素含量在5g/k g( 黄豆、 花生样品为2 0g/k g) ; 若出现荧光强度与标准点的最低检出量的荧光强度相等, 而且此荧光点又同第二板样液的标准点相重叠, 则样品中杂色曲霉素含量为5g/k g( 黄豆、 花生样品为2 0g/k g) ; 若出现荧光强度比标准点的最低检出量强, 则根据其荧光强度估计减少滴加微升数, 或将样液稀释后再滴加不同微升数, 直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。在喷三氯化铝第1、2次后分别进行观察评定, 两次结果应一致。若结果为阳性, 则将薄层板放暗处1 0m i n, 再观察一次, 如样品仍为阳性, 进一步作确证试验, 即在距薄层板(1 0c m1 8.5c m) 下端3c m的基线上滴加一个点的1 0L标准使用液(0.4g/m L) 与3个点的样液,G B5 0 0 9.2 52 0 1 61 0 每点1 6L。在样液的一个点上再加滴1 0L标准使用液(0.4g/m L) , 另一点上再加滴1 0L标准使用液(1g/m L) 。于各点上再加一小滴三氟乙酸, 放暗处反应1 0m i n, 热风吹5m i n, 使薄层板上的温度不高于4 0, 用冰乙酸-苯(1 0+9 0) 展开1次2次, 直至杂色曲霉素衍生物与杂质分开为止。展开时要避光, 以下显荧光步骤同1 9.2.1.4。最后将板在紫外光灯下观察, 如样液为阳性, 应产生与杂色曲霉素标准重叠的衍生物。确证法的最低检出量: 大米、 玉米、 小麦均为2 5g/k g( 黄豆、 花生样品均为5 0g/k g) 。1 9.3 分析结果的表述试样中杂色曲霉素的含量按式(3) 计算:X=0.0 0 4V1DV210 0 0m(3) 式中:X 杂色曲霉素的含量, 单位为微克每千克(g/k g) ;0.0 0 4 杂色曲霉素的最低检出量, 单位为微克(g) ;V1 样液浓缩后体积, 单位为毫升(m L) ;D 浓缩样液的总稀释倍数;V2 出现最低荧光时滴加样液的体积, 单位为毫升(m L) ;10 0 0 换算系数;m 浓缩样液中所相当的试样质量, 单位为克(g) 。结果表示到测定值的整数位。G B5 0 0 9.2 52 0 1 61 1 附 录 A质谱条件及离子源控制条件A.1 质谱参考条件如下:a) 离子源: 电喷雾电离源(E S I) , 正离子监测;b) 毛细管电压:3.5k V;c) 锥孔电压:1 4 5V;d) 干燥器温度:3 2 5;e) 干燥器流速:4 8 0L/h;f) 雾化器压力:1 7 2k P a;g) 鞘气温度:3 5 0;h) 鞘气流速:6 0 0L/h;i) 喷嘴电压:5 0 0V;j) 电子倍增管电压:+3 0 0V。A.2 离子选择参数见表A.1。表A.1 离子选择参数表化合物名称母离子(m/z)定量离子(m/z)碰撞能量e V定性离子(m/z)碰撞能量e V离子化方式杂色曲霉素3 2 5.02 8 0.83 53 0 9.82 0E S I+1 3C1 8-杂色曲霉素3 4 3.02 9 6.93 53 2 6.92 0E S I+A.3 杂色曲霉素的离子扫描图见图A.1。图A.1 杂色曲霉素的离子扫描图G B5 0 0 9.2 52 0 1 61 2 A.4 1 3C1 8-杂色曲霉素的离子扫描图见图A.2。图A.2 1 3C1 8-杂色曲霉素的离子扫描图A.5 杂色曲霉素及其同位素标准溶液的子离子质谱图见图A.3。图A.3 杂色曲霉素及其同位素标准溶液的子离子质谱图G B5 0 0 9.2 52 0 1 61 3 附 录 B液相色谱图B.1 杂色曲霉素标准溶液的液相色谱图杂色曲霉素标准溶液的液相色谱图见图B.1。图B.1 1 0 0n g/m L杂色曲霉素标准溶液的液相色谱图B.2 免疫亲和柱柱容量验证方法在9 0m L的P B S中加入1 8L1 0 0g/m L杂色曲霉素标准储备溶液, 充分混匀。分别取同一批次3根免疫亲和柱, 每根柱的上样量为3 0m L。经上样、 淋洗、 洗脱, 收集洗脱液, 氮气吹干, 用乙腈-水溶液(5 0+5 0) 定容至1.0m L, 用液相色谱仪分离测定杂色曲霉素的含量。结果判定: 结果杂色曲霉素4 8 0n g( 即回收率8 0%) 为可用柱。