GB 4789.6-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验.pdf

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B4 7 8 9 .62 0 1 6食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验2 0 1 6 - 1 2 - 2 3发布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局发 布G B4 7 8 9.62 0 1 6 前 言 本标准代替G B/T4 7 8 9.62 0 0 3 食品卫生微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验 。本标准与G B/T4 7 8 9.62 0 0 3相比, 主要变化如下: 标准名称修改为“ 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验” ; 增加了术语和定义、 缩略语; 增加了血清学试验中H抗原鉴定; 增加了P C R确认试验; 增加了附录A; 修改了设备和材料; 修改了培养基和试剂; 修改了检验程序; 修改了血清学试验中致泻大肠埃希氏菌所包括的O抗原群; 删除了肠毒素试验。G B4 7 8 9.62 0 1 61 食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验1 范围本标准规定了食品中致泻大肠埃希氏菌(d i a r r h e a g e n i cE s c h e r i c h i ac o l i) 的检验方法。本标准适用于食品中致泻大肠埃希氏菌的检验。2 术语和定义、 缩略语2.1 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1.1 致泻大肠埃希氏菌 D i a r r h e a g e n i cE s c h e r i c h i ac o l i一类能引起人体以腹泻症状为主的大肠埃希氏菌, 可经过污染食物引起人类发病。常见的致泻大肠埃希氏菌主要包括肠道致病性大肠埃希氏菌、 肠道侵袭性大肠埃希氏菌、 产肠毒素大肠埃希氏菌、 产志贺毒素大肠埃希氏菌( 包括肠道出血性大肠埃希氏菌) 和肠道集聚性大肠埃希氏菌。2.1.2 肠道致病性大肠埃希氏菌 E n t e r o p a t h o g e n i cE s c h e r i c h i ac o l i能够引起宿主肠黏膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤, 且不产生志贺毒素的大肠埃希氏菌。该菌是婴幼儿腹泻的主要病原菌, 有高度传染性, 严重者可致死。2.1.3 肠道侵袭性大肠埃希氏菌 E n t e r o i n v a s i v eE s c h e r i c h i ac o l i能够侵入肠道上皮细胞而引起痢疾样腹泻的大肠埃希氏菌。该菌无动力、 不发生赖氨酸脱羧反应、不发酵乳糖, 生化反应和抗原结构均近似痢疾志贺氏菌。侵入上皮细胞的关键基因是侵袭性质粒上的抗原编码基因及其调控基因, 如i p a H基因、i p a R基因( 又称为i n v E基因) 。2.1.4 产肠毒素大肠埃希氏菌 E n t e r o t o x i g e n i cE s c h e r i c h i ac o l i能够分泌热稳定性肠毒素或/和热不稳定性肠毒素的大肠埃希氏菌。该菌可引起婴幼儿和旅游者腹泻, 一般呈轻度水样腹泻, 也可呈严重的霍乱样症状, 低热或不发热。腹泻常为自限性, 一般2d3d即自愈。2.1.5 产志贺毒素大肠埃希氏菌 S h i g at o x i n - p r o d u c i n gE s c h e r i c h i ac o l i( 肠道出血性大肠埃希氏菌E n t e r o h e m o r r h a g i cE s c h e r i c h i ac o l i) 能够分泌志贺毒素、 引起宿主肠黏膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤的大肠埃希氏菌。有些产志贺毒素大肠埃希氏菌在临床上引起人类出血性结肠炎(HC) 或血性腹泻, 并可进一步发展为溶血性尿毒综合征(HU S) , 这类产志贺毒素大肠埃希氏菌为肠道出血性大肠埃希氏菌。G B4 7 8 9.62 0 1 62 2.1.6 肠道集聚性大肠埃希氏菌 E n t e r o a g g r e g a t i v eE s c h e r i c h i ac o l i肠道集聚性大肠埃希氏菌不侵入肠道上皮细胞, 但能引起肠道液体蓄积。不产生热稳定性肠毒素或热不稳定性肠毒素, 也不产生志贺毒素。唯一特征是能对H e p - 2细胞形成集聚性黏附, 也称H e p - 2细胞黏附性大肠埃希氏菌。2.2 缩略语下列缩略语适用于本文件。2.2.1 D E C: 致泻大肠埃希氏菌 D i a r r h e a g e n i cE s c h e r i c h i ac o l i2.2.2 E P E C: 肠道致病性大肠埃希氏菌 E n t e r o p a t h o g e n i cE s c h e r i c h i ac o l i2.2.3 E I E C: 肠道侵袭性大肠埃希氏菌 E n t e r o i n v a s i v eE s c h e r i c h i ac o l i2.2.4 E T E C: 产肠毒素大肠埃希氏菌 E n t e r o t o x i g e n i cE s c h e r i c h i ac o l i2.2.5 S T E C: 产志贺毒素大肠埃希氏菌 S h i g a t o x i n - p r o d u c i n gE s c h e r i c h i ac o l i2.2.6 EHE C: 肠道出血性大肠埃希氏菌 E n t e r o h e m o r r h a g i cE s c h e r i c h i ac o l i2.2.7 E A E C: 肠道集聚性大肠埃希氏菌 E n t e r o a g g r e g a t i v eE s c h e r i c h i ac o l i2.2.8 e s c V: 蛋白分泌物调节基因,g e n ee n c o d i n gL E E - e n c o d e dt y p e s e c r e t i o ns y s t e mf a c t o r2.2.9 e a e: 紧密素基因,g e n ee n c o d i n g i n t i m i nf o rE s c h e r i c h i ac o l ia t t a c h i n ga n de f f a c i n g2.2.1 0 b f p B: 束状菌毛B基因,b u n d l e - f o r m i n gp i l u sB;2.2.1 1 s t x1: 志贺毒素基因,S h i g a t o x i no n e2.2.1 2 s t x2: 志贺毒素基因,S h i g a t o x i nt w o2.2.1 3 l t: 热不稳定性肠毒素基因,h e a t - l a b i l ee n t e r o t o x i n2.2.1 4 s t: 热稳定性肠毒素基因,h e a t - s t a b l ee n t e r o t o x i n2.2. 1 5 s t p(s t I a) : 猪源热稳定性肠毒素基因,h e a t - s t a b l ee n t e r o t o x i n si n i t i a l l yd i s c o v e r e di nt h ei s o l a t e s f r o mp i g s2.2.1 6 s t h(s t I b) : 人 源 热 稳 定 性 肠 毒 素 基 因,h e a t - s t a b l ee n t e r o t o x i n si n i t i a l l yd i s c o v e r e di nt h ei s o l a t e s f r o mh u m a n2.2.1 7 i n v E: 侵袭性质粒调节基因,i n v a s i v ep l a s m i dr e g u l a t o r2.2.1 8 i p a H: 侵袭性质粒抗原H基因,i n v a s i v ep l a s m i da n t i g e nH - g e n e2.2.1 9 a g g R: 集聚黏附菌毛调节基因,a g g r e g a t i v ea d h e s i v e f i m b r i a er e g u l a t o r2.2.2 0 u i d A:-葡萄糖苷酶基因,- g l u c u r o n i d a s eg e n e2.2.2 1 a s t A: 集聚热稳定性毒素A基因,e n t e r o a g g r e g a t i v eh e a t - s t a b l ee n t e r o t o x i nA2.2.2 2 p i c: 肠定植因子基因,p r o t e i n i n v o l v e d i n i n t e s t i n a l c o l o n i z a t i o n2.2.2 3 L E E: 肠细胞损伤基因座,L o c u so f e n t e r o c y t ee f f a c e m e n t2.2.2 4 E A F:E P E C黏附因子,E P E Ca d h e s i v e f a c t o r3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下:3.1 恒温培养箱:3 61,4 21。3.2 冰箱:25。3.3 恒温水浴箱:5 01,1 0 0或适配1.5m L或2.0m L金属浴(9 51 0 0) 。3.4 电子天平: 感量为0.1g和0.0 1g。3.5 显微镜:1 01 0 0。G B4 7 8 9.62 0 1 63 3.6 均质器。3.7 振荡器。3.8 无菌吸管:1m L( 具0.0 1m L刻度) ,1 0m L( 具0.1m L刻度) 或微量移液器及吸头。3.9 无菌均质杯或无菌均质袋: 容量5 0 0m L。3.1 0 无菌培养皿: 直径9 0mm。3.1 1 p H计或精密p H试纸。3.1 2 微量离心管:1.5m L或2.0m L。3.1 3 接种环:1L。3.1 4 低温高速离心机: 转速1 30 0 0r/m i n, 控温48。3.1 5 微生物鉴定系统。3.1 6 P C R仪。3.1 7 微量移液器及吸头:0.5L2L,2L2 0L,2 0L2 0 0L,2 0 0L10 0 0L。3.1 8 水平电泳仪: 包括电源、 电泳槽、 制胶槽( 长度1 0c m) 和梳子。3.1 9 8联排管和8联排盖( 平盖/凸盖) 。3.2 0 凝胶成像仪。4 培养基和试剂4.1 营养肉汤: 见A.1。4.2 肠道菌增菌肉汤: 见A.2。4.3 麦康凯琼脂(MA C) : 见A.3。4.4 伊红美蓝琼脂(EMB) : 见A.4。4.5 三糖铁(T S I) 琼脂: 见A.5。4.6 蛋白胨水、 靛基质试剂: 见A.6。4.7 半固体琼脂: 见A.7。4.8 尿素琼脂(p H 7.2) : 见A.8。4.9 氰化钾(K C N) 培养基: 见A.9。4.1 0 氧化酶试剂: 见A.1 0。4.1 1 革兰氏染色液: 见A.1 1。4.1 2 B H I肉汤: 见A.1 2。4.1 3 福尔马林( 含3 8%4 0%甲醛) 。4.1 4 鉴定试剂盒。4.1 5 大肠埃希氏菌诊断血清。4.1 6 灭菌去离子水。4.1 7 0.8 5%灭菌生理盐水。4.1 8 T E(p H 8.0) : 见A.1 3。4.1 9 1 0P C R反应缓冲液: 见A.1 4。4.2 0 2 5mm o l/L M g C l2。4.2 1 d NT P s:d AT P、d T T P、d G T P、d C T P每种浓度为2.5mm o l/L。4.2 2 5U/LT a q酶。4.2 3 引物。4.2 4 5 0T A E电泳缓冲液: 见A.1 5。4.2 5 琼脂糖。G B4 7 8 9.62 0 1 64 4.2 6 溴化乙锭(E B) 或其他核酸染料。4.2 7 6上样缓冲液: 见A.1 6。4.2 8 M a r k e r: 分子量包含1 0 0b p、2 0 0b p、3 0 0b p、4 0 0b p、5 0 0b p、6 0 0b p、7 0 0b p、8 0 0b p、9 0 0b p、10 0 0b p、15 0 0b p条带。4.2 9 致泻大肠埃希氏菌P C R试剂盒。5 检验程序致泻大肠埃希氏菌检验程序见图1。图1 致泻大肠埃希氏菌检验程序G B4 7 8 9.62 0 1 65 6 操作步骤6.1 样品制备6.1.1 固态或半固态样品固体或半固态样品, 以无菌操作称取检样2 5g, 加入装有2 2 5m L营养肉汤的均质杯中, 用旋转刀片式均质器以80 0 0r/m i n 1 00 0 0r/m i n均质1m i n 2m i n; 或加入装有2 2 5m L营养肉汤的均质袋中, 用拍击式均质器均质1m i n 2m i n。6.1.2 液态样品以无菌操作量取检样2 5m L, 加入装有2 2 5m L营养肉汤的无菌锥形瓶( 瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠) , 振荡混匀。6.2 增菌将6.1制备的样品匀液于3 61培养6h。取1 0L, 接种于3 0m L肠道菌增菌肉汤管内, 于4 21培养1 8h。6.3 分离将增菌液划线接种MA C和EMB琼脂平板, 于3 6 1 培养1 8h2 4h, 观察菌落特征。在MA C琼脂平板上, 分解乳糖的典型菌落为砖红色至桃红色, 不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色; 在EMB琼脂平板上, 分解乳糖的典型菌落为中心紫黑色带或不带金属光泽, 不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色。6.4 生化试验6.4.1 选取平板上可疑菌落1 0个2 0个(1 0个以下全选) , 应挑取乳糖发酵, 以及乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落, 分别接种T S I斜面。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、 尿素琼脂(p H 7.2) 和K C N肉汤。于3 61培养1 8h2 4h。6.4.2 T S I斜面产酸或不产酸, 底层产酸, 靛基质阳性,H2S阴性和尿素酶阴性的培养物为大肠埃希氏菌。T S I斜面底层不产酸, 或H2S、K C N、 尿素有任一项为阳性的培养物, 均非大肠埃希氏菌。必要时做革兰氏染色和氧化酶试验。大肠埃希氏菌为革兰氏阴性杆菌, 氧化酶阴性。6.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统, 可从营养琼脂平板上挑取经纯化的可疑菌落用无菌稀释液制备成浊度适当的菌悬液, 使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定。6.5 P C R确认试验6.5.1 取生化反应符合大肠埃希氏菌特征的菌落进行P C R确认试验。注:P C R实验室区域设计、 工作基本原则及注意事项应参照 疾病预防控制中心建设标准 ( 建标1 2 72 0 0 9) 和国家卫生和计划生育委员会( 原卫生部) (2 0 1 0) 医疗机构临床基因扩增管理办法 附录( 医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则) 。6.5.2 使用1L接种环刮取营养琼脂平板或斜面上培养1 8h2 4h的菌落, 悬浮在2 0 0L0.8 5%灭菌生理盐水中, 充分打散制成菌悬液, 于1 30 0 0r/m i n离心3m i n, 弃掉上清液。加入1m L灭菌去离子水充分混匀菌体, 于1 0 0水浴或者金属浴维持1 0m i n; 冰浴冷却后,1 30 0 0r/m i n离心3m i n, 收集上清液; 按11 0的比例用灭菌去离子水稀释上清液, 取2L作为P C R检测的模板; 所有处理后的D NAG B4 7 8 9.62 0 1 66 模板直接用于P C R反应或暂存于4 并当天进行P C R反应; 否则, 应在-2 0 以下保存备用(1周内) 。也可用细菌基因组提取试剂盒提取细菌D NA, 操作方法按照细菌基因组提取试剂盒说明书进行。6.5.3 每次P C R反应使用E P E C、E I E C、E T E C、S T E C/EHE C、E A E C标准菌株作为阳性对照。同时,使用大肠埃希氏菌AT C C2 5 9 2 2或等效标准菌株作为阴性对照, 以灭菌去离子水作为空白对照, 控制P C R体系污染。致泻大肠埃希氏菌特征性基因见表1。表1 五种致泻大肠埃希氏菌特征基因致泻大肠埃希氏菌类别特征性基因E P E Ce s c V或e a e、b f p BS T E C/EHE Ce s c V或e a e、s t x1、s t x2E I E Ci n v E或i p a HE T E Cl t、s t p、s t hE A E Ca s t A、a g g R、p i cu i d A6.5.4 P C R反应体系配制。每个样品初筛需配置1 2个P C R扩增反应体系, 对应检测1 2个目标基因,具体操作如下: 使用T E溶液(p H 8.0) 将合成的引物干粉稀释成1 0 0m o l/L储存液。根据表2中每种目标基因对应P C R体系内引物的终浓度, 使用灭菌去离子水配制1 2种目标基因扩增所需的1 0引物工作液( 以u i d A基因为例, 如表3) 。将1 0引物工作液、1 0P C R反应缓冲液、2 5mm o l/L M g C l2、2.5mm o l/Ld NT P s、 灭菌去离子水从-2 0 冰箱中取出, 融化并平衡至室温, 使用前混匀;5U/LT a q酶在加样前从-2 0冰箱中取出。每个样品按照表4的加液量配制1 2个2 5L反应体系, 分别使用1 2种目标基因对应的1 0引物工作液。表2 五种致泻大肠埃希氏菌目标基因引物序列及每个P C R体系内的终浓度c引物名称引物序列c菌株编号及对应G e n b a n k编码引物所在位置终浓度n(m o l/L)P C R产物长度(b p)u i d A- F5- A T G C C A G T C C A G C G TT T TT G C - 3E s c h e r i c h i ac o l iDH 1 E c 1 6 9(a c c e s s i o nn o .C P 0 1 2 1 2 7.1)1 6 7 3 8 7 0-1 6 7 3 8 9 00.214 8 7u i d A- R5- AAA G T G T G G G T C AA TAA TC AGG AAG T G - 31 6 7 5 3 5 6 - 1 6 7 5 3 3 00.2e s c V- F5- A T T C T G G C T C T C T T CT T CT T TA T GG C TG - 3E s c h e r i c h i ac o l iE 2 3 4 8/6 9(a c c e s s i o nn o .FM 1 8 0 5 6 8.1)4 1 2 2 7 6 5 - 4 1 2 2 7 3 80.45 4 4e s c V- R5- C G T C C C C T T T TA C AAA C TT C AT C GC - 34 1 2 2 2 2 2 - 4 1 2 2 2 4 60.4e a e- Fa5- A T T A C C A T C C A C A C AG A CG G T - 3EHE C(a c c e s s i o nn o .Z 1 1 5 4 1.1)2 6 5 1 - 2 6 7 10.23 9 7e a e- Ra5- A C A G C G T G G T T G G A TC AAC C T - 33 0 4 7 - 3 0 2 70.2b f p B- F5- GA C A C C T C A T T G C T GAAGT C G - 3E s c h e r i c h i ac o l iE 2 3 4 8/6 9(a c c e s s i o nn o . FM 1 8 0 5 6 9.1)3 7 9 6 - 3 8 1 60.19 1 0G B4 7 8 9.62 0 1 67 表2( 续)引物名称引物序列c菌株编号及对应G e n b a n k编码引物所在位置终浓度n(m o l/L)P C R产物长度(b p)b f p B- R5- C C A G AA C A C C T C C G TT A TG C - 34 7 0 2 - 4 6 8 30.1s t x1 - F5- C GA T G T T A C G G T T T GT T AC T GT G AC A GC - 3s t x1 - R5- AA T G C C A C G C T T C C CA GAA T TG - 3E s c h e r i c h i ac o l iE D L 9 3 3(a c c e s s i o nn o .A E 0 0 5 1 7 4.2)2 9 9 6 4 4 5 - 2 9 9 6 4 1 80.22 9 9 6 2 0 2 - 2 9 9 6 2 2 30.22 4 4s t x2 - F5- G T T T T G A C C A T C T T CG T CT G AT T AT T GA G - 3s t x2 - R5- A G C G T A AG G C T T C T GC T GT G AC - 3E s c h e r i c h i ac o l iE D L 9 3 3(a c c e s s i o nn o .A E 0 0 5 1 7 4.2)1 3 5 2 5 4 3 - 1 3 5 2 5 7 10.41 3 5 2 8 6 6 - 1 3 5 2 8 4 50.43 2 4l t- F5- G AA C A G GA G G T T T C TG C GT T AG G TG - 3l t- R5- C T T T C A A T G G C T T T TT T TT G GG A GT C - 3E s c h e r i c h i ac o l iE 2 4 3 7 7 A(a c c e s s i o nn o .C P 0 0 0 7 9 5.1)1 7 0 3 0 - 1 7 0 5 40.11 7 6 8 4 - 1 7 6 5 90.16 5 5s t p- F5- C C T C T T T T A G Y C A G AC A RC T GAA TC A ST T G - 3s t p- R5- C AG G C A G G A T T A C AAC AAA G TT C AC A G - 3E s c h e r i c h i ac o l iE C 2 1 7 3(a c c e s s i o nn o .A J 5 5 5 2 1 4.1) / / /E s c h e r i c h i ac o l iF 7 6 8 2(a c c e s s i o nn o .AY 3 4 2 0 5 7.1)1 9 7 9 - 1 9 5 0/ / /1 4 - 4 30.41 8 2 3 - 1 8 4 9/ / /1 7 0 - 1 4 40.41 5 7s t h- F5- T G T C T T T T T C A C C T TT C GC T C - 3s t h- R5- C G G TA C AAG C A G G A TT A CAA CA C - 3E s c h e r i c h i ac o l iE 2 4 3 7 7 A(a c c e s s i o nn o . C P 0 0 0 7 9 5.1)1 1 3 8 9 - 1 1 4 0 90.21 1 5 5 9 - 1 1 5 3 70.21 7 1i n v E- F5- C GA TA G A T G G C G A G AAA TT A TA T CC C G - 3i n v E- R5- C GA T C A A GA A T C C C TAA CA GAAG AA T CA C - 3E s c h e r i c h i ac o l is e r o t y p eO 1 6 4(a c c e s s i o nn o .A F 2 8 3 2 8 9.1)9 2 1 - 8 9 50.21 5 6 - 1 8 40.27 6 6i p a H- Fb5- T T G A C C G C C T T T C C GA TAC C - 3E s c h e r i c h i ac o l i 5 3 6 3 8(a c c e s s i o nn o .C P 0 0 1 0 6 4.1)1 1 4 7 1 - 1 1 4 9 00.16 4 7G B4 7 8 9.62 0 1 68 表2( 续)引物名称引物序列c菌株编号及对应G e n b a n k编码引物所在位置终浓度n(m o l/L)P C R产物长度(b p)i p a H- Rb5- A T C C G C A T C A C C G C TC A GA C - 31 2 1 1 7 - 1 2 0 9 80.1a g g R- F5- A C G C A G AG T T G C C T GA TAAA G - 3a g g R- R5- AA T A C A GAA T C G T C AG C AT C AG C - 3E s c h e r i c h i ac o l ie n t e r o a g g r e g a t i v e1 7 - 2(a c c e s s i o nn o . Z 1 8 7 5 1.1)5 9 - 7 90.24 5 8 - 4 3 60.24 0 0p i c- F5- AG C C G T T T C C G C A G AA G CC - 3p i c- R5- AAA T G T C AG T G A A C CG A CG A TT G G - 3E s c h e r i c h i ac o l i 0 4 2(a c c e s s i o nn o .A F 0 9 7 6 4 4.1)3 7 0 0 - 3 6 8 20.22 5 9 0 - 2 6 1 30.21 1 1 1a s t A- F5- T G C C A T C AA C A C A G TA TAT C CG - 3a s t A- R5- A C G G C T T T G T A G T C CT T CC A T - 3E s c h e r i c h i ac o l iE C O R3 3(a c c e s s i o nn o . A F 1 6 1 0 0 1.1)2 - 2 30.41 0 3 - 8 30.41 0 21 6Sr DNA - F5- G GA G G C A G C AG T G G GAA TA - 31 6Sr DNA - R5- T GA C G G G C G G T G T G TA C AA G - 3E s c h e r i c h i ac o l i s t r a i nS T 2 7 4 7(a c c e s s i o nn o .C P 0 0 7 3 9 4.1)1 4 9 5 8 5 - 1 4 9 6 0 30.2 51 5 0 6 4 5 - 1 5 0 6 2 60.2 51 0 6 2 ae s c V和e a e基因选作其中一个;bi n v E和i p a H基因选作其中一个;c表中不同基因的引物序列可采用可靠性验证的其他序列代替。表3 每种目标基因扩增所需1 0引物工作液配制表引物名称体积/L1 0 0m o l/Lu i d A- F1 0n1 0 0m o l/Lu i d A- R1 0n灭菌去离子水1 0 0-2(1 0n)总体积1 0 0 注:n 每条引物在反应体系内的终浓度( 详见表2) 。G B4 7 8 9.62 0 1 69 表4 五种致泻大肠埃希氏菌目标基因扩增体系配制表试剂名称加样体积/L灭菌去离子水1 2.11 0P C R反应缓冲液2.52 5mm o l/L M g C l22.52.5mm o l/Ld N T P s3.01 0引物工作液2.55U/LT a q酶0.4D NA模板2.0总体积2 56.5.5 P C R循环条件。预变性9 45m i n; 变性9 43 0s, 复性6 33 0s, 延伸7 21.5m i n,3 0个循环;7 2延伸5m i n。将配制完成的P C R反应管放入P C R仪中, 核查P C R反应条件正确后, 启动反应程序。6.5.6 称量4.0g琼脂糖粉, 加入至2 0 0m L的1T A E电泳缓冲液中, 充分混匀。使用微波炉反复加热至沸腾, 直到琼脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液。待琼脂糖溶液冷却至6 0左右时, 加入溴化乙锭(E B) 至终浓度为0.5g/m L, 充分混匀后, 轻轻倒入已放置好梳子的模具中, 凝胶长度要大于1 0c m, 厚度宜为3mm5mm。检查梳齿下或梳齿间有无气泡, 用一次性吸头小心排掉琼脂糖凝胶中的气泡。当琼脂糖凝胶完全凝结硬化后, 轻轻拔出梳子, 小心将胶块和胶床放入电泳槽中, 样品孔放置在阴极端。向电泳槽中加入1T A E电泳缓冲液, 液面高于胶面1mm2mm。将5LP C R产物与1L6上样缓冲液混匀后, 用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下胶孔, 小心上样于孔中; 阳性对照的P C R反应产物加入到最后一个泳道; 第一个泳道中加入2L分子量M a r k e r。接通电泳仪电源,根据公式: 电压=电泳槽正负极间的距离(c m)5V/c m计算并设定电泳仪电压数值; 启动电压开关,电泳开始以正负极铂金丝出现气泡为准。电泳3 0m i n 4 5m i n后, 切断电源。取出凝胶放入凝胶成像仪中观察结果, 拍照并记录数据。6.5.7 结果判定。电泳结果中空白对照应无条带出现, 阴性对照仅有u i d A条带扩增, 阳性对照中出现所有目标条带,P C R试验结果成立。根据电泳图中目标条带大小, 判断目标条带的种类, 记录每个泳道中目标条带的种类, 在表5中查找不同目标条带种类及组合所对应的致泻大肠埃希氏菌类别。表5 五种致泻大肠埃希氏菌目标条带与型别对照表致泻大肠埃希氏菌类别目标条带的种类组合E A E Ca g g R,a s t A,p i c中一条或一条以上阳性E P E Cb f p B(+/-) ,e s c Va(+) ,s t x1(-) ,s t x2(-)S T E C/EHE Ce s c Va(+/-) ,s t x1(+) ,s t x2(-) ,b f p B(-)e s c Va(+/-) ,s t x1(-) ,s t x2(+) ,b f p B(-)e s c Va(+/-) ,s t x1(+) ,s t x2(+) ,b f p B(-)E T E Cl t,s t p,s t h中一条或一条以上阳性E I E Ci n v Eb(+)u i d Ac(+/-) a在判定E P E C或S E T C/EHE C时,e s c V与e a e基因等效;b在判定E I E C时,i n v E与i p a H基因等效。c9 7%以上大肠埃希氏菌为u i d A阳性。G B4 7 8 9.62 0 1 61 0 6.5.8 如用商品化P C R试剂盒或多重聚合酶链反应(MP C R) 试剂盒, 应按照试剂盒说明书进行操作和结果判定。6.6 血清学试验( 选做项目)6.6.1 取P C R试验确认为致泻大肠埃希氏菌的菌株进行血清学试验。注:应按照生产商提供的使用说明进行O抗原和H抗原的鉴定。当生产商的使用说明与下面的描述可能有偏差时, 按生产商提供的使用说明进行。6.6.2 O抗原鉴定6.6.2.1 假定试验: 挑取经生化试验和P C R试验证实为致泻大肠埃希氏菌的营养琼脂平板上的菌落,根据致泻大肠埃希氏菌的类别, 选用大肠埃希氏菌单价或多价OK血清做玻片凝集试验。当与某一种多价OK血清凝集时, 再与该多价血清所包含的单价OK血清做凝集试验。致泻大肠埃希氏菌所包括的O抗原群见表6。如与某一单价OK血清呈现凝集反应, 即为假定试验阳性。6.6.2.2 证实试验: 用0.8 5%灭菌生理盐水制备O抗原悬液, 稀释至与M a cF a r l a n d3号比浊管相当的浓度。原效价为11 6 013 2 0的O血清, 用0.5%盐水稀释至14 0。将稀释血清与抗原悬液于1 0mm7 5mm试管内等量混合, 做单管凝集试验。混匀后放于5 01水浴箱内, 经1 6h后观察结果。如出现凝集, 可证实为该O抗原。表6 致泻大肠埃希氏菌主要的O抗原D E C类别D E C主要的O抗原E P E CO 2 6O 5 5O 8 6O 1 1 1 a bO 1 1 4O 1 1 9O 1 2 5 a cO 1 2 7O 1 2 8 a bO 1 4 2O 1 5 8等S T E C/EHE CO 4O 2 6O 4 5O 9 1O 1 0 3O 1 0 4O 1 1 1O 1 1 3O 1 2 1O 1 2 8O 1 5 7等E I E CO 2 8 a cO 2 9O 1 1 2 a cO 1 1 5O 1 2 4O 1 3 5O 1 3 6O 1 4 3O 1 4 4O 1 5 2O 1 6 4O 1 6 7等E T E CO 6O 1 1O 1 5O 2 0O 2 5O 2 6O 2 7O 6 3O 7 8O 8 5O 1 1 4O 1 1 5O 1 2 8 a cO 1 4 8O 1 4 9O 1 5 9O 1 6 6O 1 6 7等E A E CO 9O 6 2O 7 3O 1 0 1O 1 3 4等6.6.3 H抗原鉴定6.6.3.1 取菌株穿刺接种半固体琼脂管,3 61 培养1 8h2 4h, 取顶部培养物1环接种至B H I液体培养基中, 于3 61培养1 8h2 4h。加入福尔马林至终浓度为0.5%, 做玻片凝集或试管凝集试验。6.6.3.2 若待测抗原与血清均无明显凝集, 应从首次穿刺培养管中挑取培养物, 再进行2次3次半固体管穿刺培养, 按照6.6.3.1进行试验。7 结果报告7.1 根据生化试验、P C R确认试验的结果, 报告2 5g( 或2 5m L) 样品中检出或未检出某类致泻大肠埃希氏菌。7.2 如果进行血清学试验, 根据血清学试验的结果, 报告2 5g( 或2 5m L) 样品中检出的某类致泻大肠埃希氏菌血清型别。G B4 7 8 9.62 0 1 61 1 附 录 A培养基和试剂A.1 营养肉汤A.1.1 成分蛋白胨 1 0.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g蒸馏水10 0 0m LA.1.2 制法将以上成分混合加热溶解, 冷却至2 5左右校正p H至7.40.2, 分装适当的容器。1 2 1 灭菌1 5m i n。A.2 肠道菌增菌肉汤A.2.1 成分蛋白胨1 0.0g葡萄糖5.0g牛胆盐2 0.0g磷酸氢二钠8.0g磷酸二氢钾2.0g煌绿0.0 1 5g蒸馏水10 0 0m LA.2.2 制法将以上成分混合加热溶解, 冷却至2 5左右校正p H至7.20.2, 分装每瓶3 0m L。1 1 5 灭菌2 0m i n。A.3 麦康凯琼脂(MA C)A.3.1 成分蛋白胨2 0.0g乳糖1 0.0g3号胆盐1.5g氯化钠5.0g中性红0.0 3g结晶紫0.0 0 1g琼脂1 5.0gG B4 7 8 9.62 0 1 61 2 蒸馏水10 0 0m LA.3.2 制法将以上成分混