课题1_微生物的实验室培养.ppt

专题,2,微生物的培养与应用,课题,1,微生物的实验室培养,.,微生物的类群,微生物,原核类,:,真核类,非细胞类：,细菌、支原体、放线菌、蓝藻,个体微小、结构简单,酵母菌、霉菌、食用菌,真菌：,原生生物：,显微藻类、原生生物（如：草履虫、变形虫等）,病毒、类病毒、朊病毒,微生物的共同特点：,一,.,微生物基础知识,1.,细菌的形态,细菌主要是以二分裂的方式进行增殖（如右图）,2.,细菌的繁殖,3.,细菌的菌落,.,定义：,单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。,.,特征：,大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。,.,功能：,每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以,作为菌种鉴定的重要依据,。,几种菌落及其形态,几种菌落及其形态,微生物需要的五大类营养要素物质是：,.,微生物需要的营养物质及功能,1.,碳源,2.,氮源,3.,生长因子,4.,无机盐,5.,水,：凡是能为微生物提供所需碳元素的营养物质。,无机碳源：,CO,2,；,NaHCO,3,等,有机碳源：,糖类,、脂肪酸、花生粉饼、石油等,构成细胞物质和一些代谢产物,异养微生物的能源,.,概念,.,来源：,.,作用：,1.,微生物的碳源,无机氮源：,N,2,、,NH,4,+,、,NO,3,-,、,NH,3,等。,有机氮源：,尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等,凡是能够为微生物提供,N,元素的营养物质。,主要用于合成蛋白质、核酸及含,N,的代谢产物。,2.,微生物的氮源,.,概念：,.,来源：,.,作用：,3.,生长因子,.,常见的生长因子：,.,概念：,.,作用：,微生物生长不可缺少的微量有机物。,酶和核酸的组成成分。,维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。,.,培养基,培养基（培养液）是,由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的营养,基质。,1.,培养基的类型和用途,2.,不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方,(,参考教材附录内容,),3.,不管哪种培养基，一般都含有,水,、,碳源,、,氮源,、,无机盐,、,等,营养物质，另外还需要满足微生物生长对,pH,、,特殊营养物质,例如,:,生长因子,(,即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶,),以及,氧气,、,二氧化碳,、,渗透压,等,的要求。,划分标准,培养基种类,特点,用途,物理性质,化学成分,天然培养基,合成培养基,用途,鉴别培养基,培养基的种类,不加凝固剂,加凝固剂，如琼脂,工业生产,观察微生物的运动、分类鉴定,微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种,含化学成分不明确的天然物质,工业生产,培养基成分明确,分类、鉴定,在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长,培养、分离出特定微生物,在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物,鉴别不同种类微生物,选择培养基,液体培养基,半固体培养基,固体培养基,液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,back,半固体培养基：,(,是否运动,),无动力,有动力,(,弥散,),固体培养基：菌落,.,无菌技术,1.,无菌技术的概念,无菌操作泛指,在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,常用的无菌技术有消毒和灭菌,消毒,灭菌,概念,指使用,较为温和,的物理或化学方法仅杀死,物体表面或内部一部分,对人体有害的微生物,(,不包括芽孢和孢子,),指使用,强烈,的理化因素杀死,物体内外所有,的微生物，包括芽孢和孢子,常用方法,煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法,灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌,适用对象,操作空间、液体、双手等,接种环、接种针、玻璃器皿，培养基等,2,、常用消毒和灭菌方法,煮沸消毒法：,巴氏消毒法：,化学药剂消毒法：,紫外线消毒法：,灼烧灭菌,100,；,5-6min,；部分细胞和芽孢,75,，,30min,；,80,，,15min,；牛奶,干热灭菌,高压蒸汽灭菌,消毒,灭菌,酒精，氯气,灼烧,灭菌,干热灭菌箱,高压蒸汽灭菌锅,煮沸,消毒,法,巴氏消毒法,化学药剂（,70%,酒精等）,紫外线,针对不耐高温的液体,接种室、超净工作台,灼烧灭菌,干热灭菌,高压蒸汽灭菌,接种工具（接种环等）,吸管、培养皿等玻璃器皿,实验操作者的双手,培养基,1,、消毒方法,2,、灭菌方法,1.,无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.,请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。,培养细菌用的培养基与培养皿,玻棒、试管、烧瓶和吸管,实验操作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（,1,）、（,2,）需要灭菌；（,3,）需要消毒。,P,15,16,旁栏思考,二,.,实验操作,(,以培养大肠杆菌为例,),.,制备牛肉膏蛋白胨培养基,1.,计算,2.,称量,3.,溶化,4.,灭菌,:,将锥形瓶放入高压蒸气灭菌锅，在压力为,100kPa,、温度为,121,，灭菌,15,30min,。培养皿放入干热灭菌箱，在,160-170,灭菌,2h,。,5,.,倒平板,:,待培养基冷却到,50,左右时，在酒精灯附近倒平板。,2d,后观察平板，无杂菌污染才可用来接种,。,倒平板操作,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.,为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,问题讨论,1.,培养基灭菌后，需要冷却到,50,左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,3.,平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.,在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：,平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,.,纯化大肠杆菌,平板划线法,和,稀释涂布平板法,。,微生物的接种的,常用接种方法有,：,平板划线法,是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。,在划线培养后，可以分离到由,一个细胞,繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，就是,菌落,1.,平板划线法,根霉 曲霉 青霉,将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环,_,在,_,旁冷却接种环，并打开棉塞,将试管口通过火焰,.,将已,_,的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液,左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，,划,_,条平行线，盖上皿盖。,注意不要划破培养基,。,.,将试管通过火焰，并塞上棉塞,火焰,冷却,三至五,灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的,_,开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。,注意不要将最后一区的划线与第一区相连。,末端,烧红,将平板,_,放入培养箱中培养。,倒置,答：操作的第一步,灼烧接种环,是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。,每次划线前灼烧接种环,是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，随着划线次数的增加，菌种的数目逐渐减少，以得到菌落。,划线结束后灼烧接种环,能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,问题讨论,1.,为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,2.,在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.,在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：,划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,2.,稀释涂布平板法,稀释涂布平板法,是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。,在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成,单个的菌落,。,稀释涂布平板法,1.,将分别盛有,9mL,水的,6,支试管灭菌，并按,10,1,10,6,的顺序编号。,2.,用移液管吸取,1mL,培养的菌液，注入第二支试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。,3.,从,10,1,倍稀释的试管中吸取,1mL,稀释液，注入,10,2,倍稀释的试管中，重复第,2,步的操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。,注意：,移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管离火焰,12cm,处,.,3.,微生物的恒温培养（恒温箱）,37,12h-24h,。,答：,应从操作的各个细节保证,“,无菌,”,。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。,问题讨论,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第,2,步应如何进行无菌操作？,三,.,菌种的保存,接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于,4,冰箱保存。,.,长期保存：,甘油冷冻管藏法,.,临时保藏：,四、课题成果评价,（一）培养基的制作是否合格,如果未接种的培养基在恒温箱中保温,1,2 d,后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。,（二）接种操作是否符合无菌要求,如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习,。,（三）是否进行了及时细致的观察与记录,培养,12 h,与,24 h,后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。,本课题知识小结,:,课堂练习,1.,下列有关平板划线操作的叙述，不正确的是（）,A.,第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养基和培养物。,B.,每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种。,C.,在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液。,D.,划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,C,课堂练习,2.,如图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为,12345,。下列操作方法正确的是（）,A.,操作前不用做任何处理。,B.,划线操作须在火焰上进行。,C.,在,5,区域中才可以得到所需菌落。,D.,在,12345,区域中划线前后都要对接种环灭菌。,D,课堂练习,3.,为了保持菌种的纯净需要进行菌种的保藏，下列有关叙述不正确的是（）,A.,对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。,B.,临时保藏的菌种一般是接种到试管的固体培养基上。,C.,临时保藏的菌种容易被污染或产生变异。,D.,对于需要长期保存的菌种，可以采用,-4,低温保藏的方法。,D,