第六章_____稳定性同位素示踪法.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章 稳定性同位素示踪法,概述：,1、1912年，,Thomson,首发现稳定性核素,20,Ne,和,22,Ne,（,氖）。,2、1929年，,Naude,发现了,15,N。,3、1937,年，,Urey,等首次报道人工生产,15,N,的方法。,4、1940年，先后获得具生物意义的,15,N、,18,O,和,3,H,大量生产。,5.1947年9月在美国,Wisconsin,大学召开了“同位素在生物学和医学中应用”专题讨论会，从此开始了,稳定性核素示踪技术应用的新纪元。,6.,近,20,年，稳定性核素示踪技术迅速发展，分离分析方法取得了较大突破，,13,C,、,2,H,、,18,O,、,15,N,广泛应用于生物学、医学、环保、农药、农学、微生物等研究领域。我国先后分离了,25,种元素的,100,多种稳定性核素，例如：,15,N,标记化合物就有,30,余,种。,几个概念,稳定性同位素,（,Stable isotope）,丰度,（,Abundance）,A,即某核在该组同位素中浓度(通常指人工加浓了 的),。,自然丰度,（,Natural,abundaa,）,A,自,(,A,O,),15,N：0.365%、,18,O:0.204%,原子百分超,（,Atom percent excess）,a,a=A-A,自,又称富集度（,Enrichment）,富集,15,N（Enriched,15,N）,贫化,15,N（Depeled,15,N),一.稳定性同位素示踪法的基本依据：,1.自然界中一种元素同位素组成是,相对恒定,2.同一元素的同位素具有,相同的化学性质,3.同一元素的同位素之间存在,质量差异,重要化学元素的稳定性同位素,元素 同位素 自然丰度 样品来源,H,1,H 99.985,新鲜的表面淡水,2,H(D)0.0147,B,10,B 18.46,意大利天然硼酸盐,11,B 81.54,C,12,C 98.892,捷克扑利兹石灰石,13,C 1.108,N,14,N 99.635,大气中的氮气,15,N 0.365,O,16,O 99.759,大气中的氧气,17,O,0.0374,18,O 0.2039,氮的同位素表,同位素 射线种类 半衰期 自然丰度,12,N,+,0.011S,13,N,+,9.96m,14,N,-99.635,15,N,-0.365,16,N,-,7.1S,17,N,-,4.15S,18,N,-,0.63S,稳定性同位素标记物的命名,1978年国际纯化学和化学联合会,IUPAC,的命名法,:,结构式:,15,N,HCl,或,15,NHCl,（,这样純的物质不存在),单标记化合物:,H,2,15,N-CO-NH,2,15,N-,尿素，例如,15,N,的丰度可为,5%，10%，15%,双标记化合物,(一个同位素):,H,2,15,N-CO-,15,NH,2,尿素,4.,混合标记化合物,:(,15,NH,2,),13,CO (,13,C,15,N),尿素,核素,A（%）,质量数,14,N,99.635 14,15,N,0.365 15,注意：由于同位素之间的质量差异，因此它们的物理、化学、生物化学等性质会有所不同，进行实验时，需注意,同位素效应,。,二.稳定性同位素示踪法的特点：,1.无放射性，无辐射效应及不良影响。,2.安全、对人无伤害。,3.无污染，不受环境条件限制。,4.无衰变，实验时间不受限制。,5.可进行放射性示踪法难以进行的实验。,例：,N,素中,T,最长的,13,N,：,T,=9.096m,一,三.,稳定性同位素分析法的基本流程,同位素引入生物体,动植物原始样品,仪器所需的待测样品,进样过程,质谱分析法 光谱分析法,记录,实验结果分析,四.影响,15,N,引入丰度的因素,1.实验材料对,15,N,的稀释程度。,2.,N,素在不同部位分布的不均匀性,3.分析测定技术所能达到的精度。,15,N,示踪法引入,N,素肥料的丰度计算,参考公式,a,f,=,W,p,R,p,a,p,/,N,f,R,N,式中：,a,f,：N,素肥料的原子百分超,W,p,：,植物总重量（待测）,a,p,：,植物样品中原子百分超,R,p,：,植物样品中含,N,百分率,N,f,：,施纯,N,量,R,N,：N,肥利用率,注意事项：,1.同位素交换反应：,在一定条件下，标记的铵盐可与大气发生反应：,15,NH,+,4,水溶液+,14,NH,3,14,NH,+,4,水溶液+,15,NH,3,15,N,丰度高时应注意。,2.同位素效应：,藻类对,14,C、,13,C、,12,C,的吸收依次递减。,3.予测样品测定项目,五、质谱和光谱测定,15,N,原理,14,N,和,15,质量不同,质谱：把,N,2,离子化为,28,N-N,2,，,29,N-N,2，,30,N-N,2,使其 在,均匀磁场,中发生不同角度偏转,2,光谱：,28,N-N,2,：,谱线波长为,2976.8埃,29,N-N,2,：,谱线波长为,2982.9埃,30,N-N,2,：,谱线波长为,2988.6埃,-,入口,出口,加速电压,180,0,的均匀磁场,六.供仪器待测样品的制备、测量,1.对待测样品的要求：,(1)因为测量的是不同质量离子流的相对含量，因此，保证有一定的,N,量即可。一般要求含,N,量1,mg/ml,最少不低于0.5,mg。,(2),仪器的本底检查。,(3)离子峰的选择（,14,N,和,15,N,的峰比,28,N、,29,N,小10倍，选,28,N、,29,N、,30,N）。,(4),仪器精确度检查（检查去,O,2,后的空气或纯,N,气）。,2.分析样品的制备：,(1),K,氏法（,Kjeidali,）,质谱分析常用法。,A.,样品的消化：,（例：0.05,g,植样,+10,ml,浓,H,2,S0,4,+3.3gSe:CuSO,4,:K,2,SO,4,为1:10:100混合催化剂样液清亮再消煮5,h（,土,）或2,h(,植,)，温度120-140。样品予处理：水杨酸,硫酸法：5,g,干土或0.5,g,植样+12,ml,水杨酸：硫酸为50,g：1000ml,溶液中放置30,min，,再加2.5,g,硫代硫酸钠和15,ml,水，缓缓加热至停出起泡冷却常规消化）。,B.,蒸馏：,用蒸汽蒸馏将消化液中,NH,3,分离出来，并测定总,N。,方法：,消化液中加过量40%,NaOH,释放的,NH,3,被蒸汽逐出，经冷凝后被2%硼酸吸收，加入混合指示剂用标准硫酸滴定（设置一个标准液）。,此步骤将,NH,3,-N,转变成了,NH,4,+,-N（,铵态,N），,仪器分析适宜量,1,mgN,/,样品2-3,ml(,浓缩或稀释),。,(,制备好的样品送交仪器分析),以下在质谱仪上进行,C.,将,NH,4,+,-N,转化为,N,2,气:,在真空条件下，将上述样品与次溴酸钠反应，放出,N,气（在质谱仪内进行）详见书,15,N,章节。,制样时注意：,1.所有试剂纯度要高。,2.消化要完全。,3.防止样品间交叉污染（每个样品蒸馏前用蒸馏15,ml,乙醇洗器皿）。,4.,“,Y,”,型管及内部反应抽气须彻底，防其它气体干扰。,以下在光谱仪上进行,可用液体样品也可用干样品,(2).杜马法（,Dumas）,光谱分析中常用法,适用于含,N,量低（少于100,g）,的样品，光谱测量。,方法：,A,在放电管中装入,样品,，,氧化剂,（,CuO,）,及,吸收剂,（,CaO,）,抽真空，抽完后熔封放电管。,在马福炉中燃烧0.5-3,h（560）,样品，（,CaO,吸收,CO,2,和,H,2,O),以产生,N,2,气,。,B,冷却至室温后在光谱仪上测定,纯样品火焰为,粉红色,或,淡黄色,有,CO,2,呈,白色,，有水呈,黄色,）,注意：,如果是,液体样品,。需用,Pyrex,玻璃管（1,cm 2mm）,吸满样液，烘干后再放入放电管。,CuO,、,CaO,使用前用700高温烘干除去,CO,2,，H,2,O，,并在12-18,Kg/cm,2,压力下制成棒状,备光谱分析,仪器分析方法步骤：,1、通电予热仪器10分钟，,打开,光电倍增管高压。,2、放电管,装入,燃烧室固定架上。,3、,开,高频发生器电源，使放电管中样品放电发光。,4、,选择,适宜放大倍数对,28,N、,29,N、,30,N,峰分别进行放大，在2970,A,0,-2990A,0,之间扫描。,5、,放下,记录笔，,接通,扫描开关，划出,28,N、,29,N、,30,N,峰高。,6、,求得,平均峰高，,计算,15,N,丰度。,七,15,N,实验结果计算,14、15,的质量比28、29、30的小10倍，不参加运算,当,15,N,丰度小于5%:,R,=,质量为28离子流强度/质量为29离子流强度,此时,30,N,的流子离强度很小，,1.丰度,：,A,=1/2R+1,100%,(1),当,15,N,丰度大于5%,R,=,质量为29离子流强度/质量为30离子流强度,A,=2/R,+2,100%,或者由质量为28、29、30的峰值直接算出：,A,=,29+230/2（28+29+30),100%,以下以植物材料实验为例进行计算，其计算原理也适用于动物等，共同的条件是在一个相对封闭系统内开展实验。（若是用,32,P,等实验，计算时把原子百分超换成比强度即可）,2.植样的原子百分超:,a,p,a,p,=A-A,自,（2）,（,A,自,=0.365%或空白实验值）,3.植物从肥料中摄取,N,的%:,N,dff,植物中,N,有多少%是来自于肥料（,Percentage of in the plant derived from the fertilizer），,可以是根、茎、叶、果实的任一,N,dff,N,dff,=,a,p,/,a,f,100%（,设,N,素来源于土壤和肥料二方面）（3）,af,：,肥料,N,的原子百分超（或动物饲料,N,的原子百分超，此时又多了一个动物排泄因素）。,上片解释见第五章第37片同位素稀释法,4、植物从土壤中摄取,N,的%,（,Percentage of in the plant tissue derived from the soil）:,N,dfs,N,dfs,=1-,N,dff,(4),5、,植物中来自肥料的,N,量:,N,pf,N,pf,=,植物总,N,量,a,p,/,a,f,（5）,N,pf,+,N,ps,=,植物中总,N,量（已在定,N,中测定,K,氏定,N,法）設总,N,来源于,土壤,和,肥料，,则：,6.植物中来自土壤,N,的量：,N,ps,N,ps,=,总,N-,N,p,f,(6),7.,N,素利用率：,R,=,N,p,f,/,N,f,100%(7),N,f,：,施入纯,N,的总量,8.,土壤,A,值：,A,值,=,N,dfs,/,N,dff,N,f,(Kg/,公顷)（8）,A,值：,表示土壤有效供应,N,素量(用,A,值可以解释为什么,某种土壤,适合于种植,某种植物,),。,(来自：,A,值/,N,dfs,=,N,f,/,N,dff,),9,、,N,素回收率：,R,回,=已检出的,N,f,量/,N,f,100%(9),10、N,素损失率：,R,失,=100%-,R,回,(10),以上公式适用,32,P,等放射性物质（以比强为单位）等计算。,练习题：,蕃茄实验地中施用,15,N-,尿素纯,N20Kg/,亩，收获后测得植物含,N,量为30,Kg/,亩，植物样品的,15,N,丰度为0.67%，,15,N-,尿素的,15,N,丰度为1.37%，设自然丰度为0.37%，尿素的含,N,量为40%。,求：1、每亩施入尿素量？2、肥料,N,素的利用率？3.,A,值?,解：,ap,=0.67-0.37=0.3%,af,=1.37-0.37=1.0%,Ndff,=,ap,/,af,=0.3/1.0=30%,Npf,=,Np,Ndff,=30Kg/,亩,30%=9,Kg/,亩,施入尿素量：,W=20/40%=,80Kg/,亩,肥料,N,素利用率：,R=,Npf,/,Nf,=9/20=,45%,A,值=,Ndfs,/,Ndff,Nf,=70%/30%,20Kg/,亩=,46.7,Kg/,亩,（土壤中可供蕃茄生长的每亩有效,N-,当然不是全部被吸收,A,值愈大说明土壤的供,N,能力愈强）,下列研究方法：,1.测根瘤数目和干物质产量。早、有无？,2.氮素平衡法。十分烦琐。,3.比较固,N,作物和非固,N,作物总,N,量差异。,4.乙炔还原法。简单、灵敏。,5.乙炔还原成乙烯，存在转换因子（,3,个）。,15,N,示踪与生物固氮(以下各方法简讲),工业固氮（,Haber,-Bosch,反应）：,N,2,+3H,2,催化剂/45，200在气压 2,NH,3,生物固氮：,N,2,+6H,+,+,xATP,6e,-,/,固氮酶 2,NH,3,+,xADP,+,xPi,6.同位素法：,15,N,2,还原法,（,Burris,1941）:,充,15,N,2,密室进行,NdfA,=,a,样,/,a,气,100%,固氮量=,NdfA,总,N,量,同,位,素稀释法,（,J、O、Legg,等，1975），,15,N,施入土壤,NdfA,=1-,a,固,/,a,非,A,N,值法,（,M、Fried,等，1975），田间种固,N、,非固,N,NdfA,=(As+,Afix,-As),NdfF,/,Af,As、,Af,、,Afix,分别代表土壤、肥料、大豆有效,N,量。,NdfF,:,来自肥料,N,素的比例。,八、,13,C,示踪法,1样品的制备：,（1）样品碳转化为,BaCO,3,：,干氧化法（,Pregl,）:,如上图,湿氧化法（,Weinhouse,1948）,(2）BaCO,3,CO,2,转化：,BaCO,3,+0.5%,HCl,:,饱和,NaCl,(1:4)(,真空、冷却),2测量：,CO,2,在质谱中经电子轰击产生多种分子离子和原子离子。,13,C%=1/R+1,100%R=45/44,其中：45示（,13,C,16,O,16,O）,+,和（,12,C,16,O,17,O）,+,，44,示,12,C,16,O,16,O,+,（m/e）,（,12,C,16,O,17,O）,+,可用校正峰解决。,九.,18,O,示踪法：,样品制备：也是转化成,CO,2,，,很少用,O,2,、N,2,O,2,、NO,2,。,如：平衡法：,H,2,18,O+C,16,O,2,=H,2,16,O+C,18,O,2,碳酸盐与酸反应，直接放出,C,18,O,2,。,硅酸盐（2000真空炉）,18,O,2,和,C,反应成,C,18,O,2，,1：1HgCl:Hg（CN）,2,氧化有机样品（,Aubar,等1955）,测定：记录44（,12,C,16,O,16,O）,+,和46,12,C,16,O,18,O,+,离子流强度：,18,O%,=1/2R+1,100%R=44/46,有时也取：,R=32/34（O,2,样品）,R=28/30 （,12,C,16,O,+,）（,12,C,18,O）,+,十.,2,H,示踪法：,样品制备：有机态,HH,2,O1000,锡丝,H,2,或直接把,H,2,O,引入质谱（低丰度不宜）,测定：记录3（,HD）,+,和2（,H,2,）,+,2,H%=1/2R+1,100%R=2/3,7,