研究生基本实验技能培训.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,研究生科研实验教学基地建设基本实验技能培训,首都医科大学附属北京朝阳医院,基础医学研究中心,梁燕,85231624,liangyan1990,主要内容,1.DNA,的提取,DNA,提取原理,DNA,提取方法,操作注意事项,2.PCR,PCR,体系和循环条件,PCR,操作步骤,操作注意事项,3.,琼脂糖凝胶电泳,凝胶电泳原理,电泳方法步骤,操作注意事项,1.DNA,的提取,DNA,提取原理,DNA,提取方法,操作注意事项,1.1,基因组,DNA,提取原理,既要将,DNA,与蛋白质、脂类和糖类等分离，,又要保持,DNA,分子的完整。,仪器准备：,台式离心机,、,恒温水浴锅,、紫外分光光度计、移液器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）、镊子（灭菌）、离心管架,试剂准备：,试剂盒、无水乙醇等,1.2,基因组,DNA,提取,试剂盒,试剂盒内容,操作步骤,（重点）,向,52ml,的缓冲液,GD,中加入,68ml,无水乙醇，并标记；向,50ml,的缓冲液,PW,中加入,200ml,无水乙醇，并标记；,取,200ul,全血，加入,20ul,的蛋白酶,K,溶液，混匀；,加入,200ul,缓冲液,GB,，充分颠倒混匀，,56,放置,10,分钟，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮。,加入,200ul,无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。,将吸附柱,CB3,放入收集管中准备好，将上述溶液移到吸附柱,CB3,中，,12000rpm,离心,30,秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；如果步骤,5,的溶液不能一次加完，可以再次重复步骤,6,；,向吸附柱中加,500ul,的缓冲液,GD,，,12000rpm,离心,30,秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；,操作步骤,（重点）,7.,向吸附柱中加入,700ul,漂洗液,PW,，,12000rpm,离心,30,秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；,向吸附柱中加入,500ul,漂洗液,PW,，,12000rpm,离心,30,秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；,将吸附柱和收集管,再次离心,，,12000rpm,离心,2,分钟,，将吸附柱至于室温放置数分钟；,将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜,中间位置悬空滴加,50-200ul,洗脱缓冲液,TB,，室温放置,2-5,分钟，,12000rpm,离心,2,分钟，将溶液收集到离心管中；,测,OD,值，计算,DNA,浓度和纯度；或电泳估计,DNA,浓度。,计算公式：,OD260/OD280=1.7-1.9,DNA,浓度,(,ug/ul,)=OD26050,稀释倍数,/1000,OD260=0.1,稀释倍数,=250,DNA,浓度,=0.150 250/1000=1.25,ug/ul,操作注意事项,避免样品反复冻融,56,水浴摇匀可消除,GB,中的沉淀,使用台式离心机，室温离心,2.PCR,PCR,体系和循环条件,PCR,操作步骤,操作注意事项,仪器准备：,PCR,仪，微型离心机、移液器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）、镊子（灭菌）、离心管架,试剂准备：,ddH2O,PCR Buffer,，,dNTP,，引物，,PCR,聚合酶，,DNA,模板,2.1 PCR,体系和循环条件,（重点）,BclI,PCR,Total volume,25ul,*,2,ddH,2,O,16.5ul,33ul,10Buffer,2.5ul,5ul,dNTP,(25mM),2ul,4ul,Primer F(10mM),1ul,2ul,Primer R(10mM),1ul,2ul,Ex,Taq,(1U/ul),1ul,2ul,Sum,24ul,48ul,48/2=24ul,Template DNA,（,0.1ug/ul),1ul,1ul,60,，,30s,72,，,30s,95,，,30s,95,，,30s,（预变性）,72,，,30s,（后延伸）,30cycles,2.2 PCR,操作步骤,（重点）,计算好所需扩增的,PCR,体系；,打开,PCR,仪预热，设置,PCR,循环条件；,准备试剂，融化，离心，置于冰上，备用；,按顺序加样，混匀，离心，分装；,加入模板,DNA,，混匀，离心；,放入,PCR,仪，,Start,。,2.3 PCR,操作注意事项,避免试剂反复冻融,计算总量，顺序加样,更换吸头，避免污染,3.,琼脂糖凝胶电泳,凝胶电泳原理,电泳方法步骤,操作注意事项,3.1,琼脂糖凝胶电泳原理,DNA,分子带负电荷，在直流电场中由负极移向正极；,其移动速度与线性,DNA,片段长度成反比。,配置,1%,的胶：称,1g,琼脂糖于适当大小三角瓶中，倒入,100ml,的,1*TAE,，微波炉加热至完全融化；,待凝胶温度降至,50-60,度时，加入,1ul,的,EB,（,10mg/ml),，摇匀，将胶倒入放好梳子的电泳板中，自然冷却,30-60,分钟；,轻轻拔掉梳子，将胶放入电泳槽中，倒入,1*TAE,，没过加样孔；,按照,1ul,上样,Buffer+5ul,的,DNA,混合后，点样；每排留一个孔加,DNA marker,；,100V,电泳,30,分钟，凝胶成像仪照相。,3.2,琼脂糖凝胶电泳方法,（重点）,3.3,电泳操作注意事项,带手套操作,EB,凝胶冷却时间至少,30,分钟,凝胶完全融化,M II-3 II-2 II-1 I-2 I-1 0,应用,BclI,/RFLP,多态位点进行基因连锁分析,374,211,163,小 结,1.DNA,的提取,DNA,提取原理,DNA,提取方法,操作注意事项,2.PCR,PCR,体系和循环条件,PCR,操作步骤,操作注意事项,3.,琼脂糖凝胶电泳,凝胶电泳原理,电泳方法步骤,操作注意事项,作 业,实验记录,姓名，日期，试剂批号等,实验设计,DNA,提取步骤,PCR,体系和循环条件,配胶和电泳方法,