基因工程第三组--核算的提取.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,核酸的提取,第三组：王诺菡 朱猛,黄伟男 于大伟,刘芳军 马强,张博 熊建云,杨帆 李志宽,提纲,前言,DNA,提取,DNA,提取的原则,DNA,提取的方法,RNA,提取,RNA,提取相关知识,RNA,提取方法及注意事项,DNA,和,RNA,提取常见问题分析,核酸提取方法在不同材料中的改进,前言,核酸包括,DNA,、,RNA,两种分子，在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体,DNA,为双链线性分子，原核生物的染色体,DNA,、质粒及真核细胞器,DNA,为双链环状分子；有些噬菌体,DNA,为单链环状分子；,大多数生物体内,RNA,分子均为单链线性分子并具有不同的结构特点，如真核生物,mRNA,分子多数在,3,端带有,polyA,结构。,DNA,提取,DNA,提取的原则,保证,DNA,一级结构的完整性,完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求,排除其它分子的污染,RNA,、蛋白质、多糖等,DNA,纯化要求,核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；,其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；,排除其它核酸分子的污染，如提取,DNA,分子时应去除,RNA,，反之亦然,.,DNA提取的方法,基因组,DNA,的提取,CTAB,法,SDS,法,质粒,DNA,的提取,碱裂解法,煮沸法,线粒体、叶绿体,DNA,的提取,差速离心结合,SDS,裂解法,基因组,DNA,提取主要方法,CTAB,法,适用于植物组织，真菌等,SDS,法,适用于动物组织，血液，细胞，细菌，酵母等,CTAB,法,(,植物,DNA,提取经典法,),原理,CTAB,（,hexadecyltrimethylammoniumbromide,，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。,该复合物在高盐溶液中（,0.7mol/L,NaCl,）是可溶,的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等,杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,注：,CTAB,溶液在低于,15,时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于,15,。,基因组,DNA,CTAB,法,TrisHC,（,pH8.0,）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；,EDTA,螯合,Mg,2,+,或,Mn,2,+,离子抑制,DNase,活性,；,NaCl,提供一个高盐环境使,DNP,充分溶解，存在于液相中；,CTAB,溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；,巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,组份,TrisHCl,（,pH8.0,）,EDTA,（,pH8.0,）,NaCl,CTAB,巯基乙醇,终浓度,100,mM,20,mM,1.4M,2%(W/V),0.1%,（,V/V,）使用前加入,CTAB,提取缓冲液的经典配方,基因组,DNA,CTAB,法,CTAB,提取缓冲液的改进配方,组份,TrisHCl,（,pH8.0,）,EDTA,（,pH8.0,）,NaCl,CTAB,PVP40,巯基乙醇,终浓度,100,mM,20,mM,1.4M,2%(W/V),5%(W/V),0.1%,（,V/V,）使用前加入,PVP,（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少,DNA,中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,CTAB,法流程图,植物材料,液氮研磨,细胞裂解,裂解液,抽提,上层溶液,酒精沉淀,离心洗涤,干燥溶解,DNA,溶 液,SDS,法,原理,SDS,阴离子去垢剂,核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。,溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；,溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；,对,DNase,、,RNase,有一定的抑制作用。,高盐,(,KAc,或,NH4Ac),或降低温度（冰浴）,使蛋白质及多糖杂质沉淀,上清液中的,DNA,用酚,/,氯仿抽提,乙醇沉淀水相中的,DNA,SDS,提取缓冲液的配方,组份,TrisHCl,（,pH8.0,）,EDTA,（,pH8.0,）,NaCl,SDS,终浓度,100,mM,20,mM,1.4M,2%(W/V),TrisHCl,（,pH8.0,）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；,EDTA,螯合,Mg 2,+,或,Mn,2,+,离子，抑制,DNase,活性；,NaCl,提供一个高盐环境，使,DNP,充分溶解，存在于液相中；,SDS,裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；,SDS,法流程图,动物组织细胞,组织匀浆,细胞裂解,裂解液,抽提,上层溶液,酒精沉淀,离心洗涤,干燥溶解,DNA,溶 液,基因组,DNA,其它裂解方法,根据细胞裂解方式的不同有：,物理方式：玻璃珠、超声波、研磨、冻融,化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解,生物方式：酶法,基因组,DNA,纯化的方法,吸附材料结合法：,吸附材料,纯化原理,硅质材料,高盐低,pH,值结合核酸,低盐高,pH,值洗脱,阴离子交换树脂,低盐高,pH,值结合核酸,高盐低,pH,值洗脱,磁珠,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的,质粒,DNA,提取,碱裂解法,煮沸法,碱裂解法原理,染色体,DNA,比质粒,DNA,分子大得多，且染色体,DNA,为线状分子，而质粒,DNA,为共价闭合环状分子,当用碱处理,DNA,溶液时，线状染色体,DNA,容易发生变性，共价闭环的质粒,DNA,在回到中性,pH,时即恢复其天然构象；,变性染色体,DNA,片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒,DNA,分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,碱裂解法流程图,对数期菌体,溶液,I,充分重悬,溶液,II,裂解,上清液,抽提,上层溶液,酒精沉淀,离心洗涤,干燥溶解,DNA,溶 液,溶液,III,中和,细胞器,D NA,提 取,线粒体,叶绿体,差速离心法原理,是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。,将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。,DNA,提取基本步骤,基因组,DNA,新鲜材料，低温保存,血液基因组,DNA,提 取选择有核细胞,细胞培养时间不能过长,含病毒的液体材料提取前先富集,质粒,DNA,对数期的菌体,培养时应加入筛选压力,低拷贝或大质粒，应加大菌体用量,菌株不要频繁转接（质粒丢失）,材料准备,细胞裂解,核酸分离,纯化,核酸溶解保存,核酸沉淀,基因组DNA,材料过多影响裂解，导致DNA量 少，纯度低,针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：,植物材料液氮研磨,动物组织匀浆或液氮研磨,组培细胞蛋白酶K,细 菌溶菌酶破壁,酵 母破壁酶或玻璃珠,质粒DNA,菌体量适当,，,除净培养基,变性的时间不要过长（5分钟）,控制复性时间，避免基因组D NA的 污染,G,菌、酵母细胞酶或机械处理,材料准备,细胞裂解,核酸分离,纯化,核酸溶解保存,DNA,提取基本步骤,核酸沉淀,DNA,提取基本步骤,采用吸附材料吸附分离DNA，应提供相应的缓冲体系,采用有机溶剂（酚/氯 仿）抽提时应充分而轻柔的混匀,离心分离两相时，应保证一定的转速和时间,针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,材料准备,细胞裂解,核酸分离,纯化,核酸溶解保存,核酸沉淀,DNA,提取基本步骤,蛋白质的去除：,酚/氯仿抽提,使用变性剂（SDS、异硫氰酸胍等）,蛋白酶处理,材料准备,细胞裂解,核酸分离,纯化,核酸溶解保存,核酸沉淀,DNA,提取基本步骤,多糖的去除：,多糖水解酶,在提取缓冲液中加1/2体 积氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。,用PEG8000代 替乙醇沉淀DNA：在500 LDNA液 中加入200l 20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。,材料准备,细胞裂解,核酸分离,纯化,核酸溶解保存,核酸沉淀,DNA,提取基本步骤,多酚的去除：,加入还原剂：巯 基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等,加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG，可防止酚类与DNA的 结合,盐离子的去除：,70的乙醇洗涤,材料准备,细胞裂解,核酸分离,纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA,提取基本步骤,预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀,加入1/10体 积的NaAc（pH5.2，3M）更 充分沉淀,晾干DNA，让乙醇充分挥发,材料准备,细胞裂解,核酸分离,纯化,核酸溶解保存,若长期储存建议使用T E缓冲液溶解,pH值为8.0，可防止DNA发生酸解,核酸沉淀,分离核酸注意事项,温度不要过高，高温如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。,控制,PH,范围（,PH4,到,10,）,保持一定离子强度,减少物理因素对核酸的机械剪切力,防止核酸的生物降解,细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构,所用器械和一些试剂需要高温灭菌，提取缓冲液中需加入核酸酶抑制剂,RNA,提取及常见问题分析,RNA,提取及常见问题分析,RNA,提取相关知识,RNA,提取方法及注意事项,RNA,提取常见问题分析,细胞中,RNA,的含量,10,7,个细胞,10g,30mg,动物组织,30100mg,植物组织,rRNA,占,80-85%,mRNA,占,15%,mRNA,的应用,RTPCR,Northern,杂交,cDNA,文库构建,mRNA,末端快速扩增,(RACE),差异表达,(DDRTPCR),引物延伸反应,体外转录,RNA,标记,RNA,酶保护试验,RNA,微注射,(RNAMicroinjection),RNA,的不稳定性,内因,:,核糖残基的,2,和,3,位置带有羟基,易,被水解,外因,:,内源、外源,RNA,酶含量丰富,加热后仍,能够正确折叠恢复活性,不易失活,提取,RNA,的注意事项,经常更换新手套。皮肤和实验室用品上可能有,RNase,会导致,RNase,污染,塑料器皿可用,0.1%DEPC,水浸泡,410,小时,再灭菌,玻璃器皿可在,180,烘烤,4,小时,塑料制品和枪头避免交叉污染,常用的,RNA,酶抑制剂,焦碳酸二乙酯,(DEPC),与,RNA,酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,强烈但不彻底的,RNA,酶抑制剂,异硫氰酸胍,目前是最有效的,RNA,酶抑制剂,裂解组织的同时也使,RNA,酶失活。,常用的,RNA,酶抑制剂,RNasin,从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。可以和多种,RNA,酶结合,使其失活,氧钒核糖核苷复合物,由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和,RNA,酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制,RNA,酶的活性,SDS,、尿素、硅藻土等,RNA,提取流程示意图,研磨或匀浆,动植物材料,细胞裂解,加入裂解液,(TRNzol),氯仿,离心,水相,有机相,PH 5.7,RNA,基因组DNA,纯化,RNA,提取流程示意图,等体积异丙醇沉淀,70%,乙醇洗涤沉淀,晾干溶解,RNA,吸附柱,去蛋白液,漂洗,洗脱,传统方法,:,有机溶剂抽提,得率高,柱纯化法,:,纯度高,无有机溶剂,水相,RNA,R,NA,提取基本步骤,材料准备,TRNzol,裂解细胞,加入氯仿抽提,RNA,沉淀,柱纯化,RNA,溶解,保存,植物组织选取杂质少生长较快的幼,嫩部,培养细胞除尽培养液,消化系统的组织选取杂质少的部位,细菌和酵母需要破壁处理,样品切成小块投入液氮或专门的,RNA,样品储存液中保存,液氮研磨时不要使液氮挥发净,R,NA,提取基本步骤,异硫氰酸胍、酚,(TRNzol),裂解细胞灭活,RNase,TRNzol,要与细胞组织充分接触,裂解尽量充分,材料准备,TRNzol,裂解细胞,加入氯仿抽提,RNA,沉淀,柱纯化,RNA,溶解,保存,R,NA,提取基本步骤,材料准备,TRNzol,裂解细胞,加入氯仿抽提,RNA,沉淀,柱纯化,RNA,溶解,保存,氯仿抽提时充分混匀,离心分离两相,保证一定的转速和时,间,使蛋白质、多糖和,DNA,分布到有,机相和中间层,RNA,留在水相中,注意避免吸入中间层,不慎吸入再次用有机溶剂抽提,R,NA,提取基本步骤,材料准备,TRNzol,裂解细胞,加入氯仿抽提,RNA,沉淀,柱纯化,RNA,溶解,保存,异丙醇低温沉淀,RNA,高盐低,pH,值,核酸与硅胶膜结合,70%,乙醇洗涤,晾干,用经,DEPC,处理过的水或专门的试,剂来洗脱或溶解,RNA,-70,分装保存或加入,RNase,抑,制剂,(RNAsafe),DNA,和,RNA,提取常见问题及注意事项,问题一：,DNA,降解,1.,材料不新鲜、反复冻融或细胞衰老,2.,提取操作过于剧,烈，,DNA,被打断,3.,外源核酸酶污染,1.,低温保存，避免反复冻融。,2.,液氮研磨或匀浆组织，应在解冻前加入裂解缓冲液,3.,增加裂解液中螯合剂的含量,4.,细胞裂解后操作应尽量轻柔,5.,试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌,6.DNA,分 装保存于缓冲液，避免反复冻融,问题二：,DNA,样品不纯,1.DNA中含有蛋白,、多糖、多酚类杂质,2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应,3.DNA中残留有金属离,子,1.重新纯化DNA,，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）,2.重新沉淀DNA,，让酒精充分挥发,3.增加70 乙醇洗涤的次数（2-3次）,问题三：,DNA,提 取量少,1.实验材料不佳或量少,2.破壁或裂解不充分,3.沉淀不完全,4.洗涤时DNA丢 失,1.,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料,2.,动植物要匀浆研磨充分；,G,菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁,3.,高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加,PK,的用量）,4.,低温沉淀，延长沉淀时间,5.,加辅助物，促进沉淀,6.,洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,RNA提取常见问题一：样品不纯,1.,蛋白,2.,多糖多酚,3.DNA,4.,离子,1.,保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心,2.,增加有机溶剂抽提的次数，用吸附柱纯化,3.,减少处理样品的量,4.,加入不含,RNase,的,DNase,处理；再次纯化,RNA,提取常见问题二：得率低,1.样品太多或太少,2.RNA在柱子上未洗出,3.洗出液中有酒精,1.减少或增加样品使用量,2.加入RNaseFree,放置几分钟再离心,3.漂洗后再次离心,RNA,提取常见问题三：降解,1.,样品不新鲜或保存不当,2.,RNase,污染,3.RNA,溶液储存不当,1.,取新鲜的样品；取样后立即放入液氮或储存液保存,2.,研磨样品及时补充液氮,3.,严格处理相应的器具和试剂,4.70,冻存，分装使用,核酸提取方法在不同材料中的改进,核酸提取方法在不同材料中的改进,对于不同的材料相对应的改进方法不同,，,我们简要为大家介绍几种：,可以采用不同氯化钠浓度比差别法来抽提,DNA,蛋白,得到一个较为理想的氯化钠浓度（不同植物所需浓度不同）,;,用,SDS,处理材料后再用氯仿,-,异戊醇抽提除去蛋白质，并且用十二烷基硫酸钠代替十二烷基磺酸钠配制,SDS,能够更方便、易配；加入乙醇脱水析出,DNA,时，则通过用旋转法作顺时针摇动析出,DNA,代替用滴泵反复吸乙醇析出的,DNA,使脱水析出的丝状,DNA,能顺着势能相互缠绕成团析出,确保丝状,DNA,分子不被人为断裂,。,核酸提取方法在不同材料中的改进,在葡萄总,DNA,的提取方法改进中，党尉,尉亚辉等以葡萄幼叶为材料,分别采用溴化十六烷基三甲基铵,(CTAB),法、高盐低,pH,法、简易法、高盐沉淀法和改良十二烷基硫酸钠,(SDS),法,5,种方法提取总,DNA,，对所得,DNA,溶液进行定量、定性分析和综合比较。结果显示高盐低,pH,法、高盐沉淀法综合效果较好,改良,SDS,法所得,DNA,纯度最佳。,马利华，武安全等则巧用,DNA,凝胶回收柱提纯种子,RNA,。禾谷作物种子中含有大量淀粉，由于多糖与,RNA,溶解性非常相似，所以很难提取和纯化其中的,RNA,。而经过尝试，发现,DNA,凝胶回收柱不仅可用于纯化回收琼脂糖凝胶上的,DNA,，同样可用于纯化富含多糖的植物,RNA,。该结合法避免了先提取再纯化的繁琐操作，省去了苯酚,-,氯仿的抽提，免去了,RNA,反复沉淀溶解等步骤。试验结果表明该方法是一种简捷、高效，能较为彻底除去种子,RNA,中的多糖杂质的新方法。,核酸提取方法在不同材料中的改进,朱新霞，艾尼江等则采用改进的,CTAB,法同步提取棉花,DNA,和,RNA,，他们在水相中加入,licl,溶液在,-20,放置一段时间后，则,RNA,会特异性的沉淀下来，而,DNA,会继续留在水相中，通过离心可使,RNA,分离出来。而留在上清液中的,DNA,会和预冷的异丙醇较快生成絮状物被分离出来。提取步骤中使用的乙酸钠和低浓度的乙醇，不仅可以帮助去除多糖，还可以去除色素类物质。,杜何为，孙川则通过对,CTAB,法的改进得到了纯度较高、较为完整的小麦总,RNA,，他们在小麦总,RNA,的提取过程中，省略了液氮研磨，而是直接将,RNA,提取液和小麦幼苗组织混在一起研磨。,Thank You!,