浙江大学生物化学实验甲 奥赛-质粒DNA的小批量提取与酶切鉴定.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,质粒,DNA,的提取与酶切鉴定,（一）质粒,DNA,的提取与电泳鉴定,1,、质粒简介,质粒是一种寄生性的自主复制子，存在于细菌等细,胞中，为双链闭环的,DNA,分子，大小为,1kb200kb,之间，具有自主复制和转录的能力，但其复制和转录要利用宿主细胞（细菌）编码的一些酶和蛋白质。,2,、分离纯化质粒的原理,分离纯化质粒,DNA,主要是利用宿主细菌,DNA,与质,粒,DNA,之间的差异来进行的。,（一）质粒,DNA,的提取与电泳鉴定,细菌,DNA,与质粒,DNA,形状上均为双链环形，但二者的分子量相差较大，细菌,DNA,的分子量在,10,9,D,左右，而质粒,DNA,的分子量仅为,10,6,10,7,D,，,提取纯化质粒的过程中，细菌,DNA,大多断裂成线状分子，而质粒,DNA,则多数仍为双链环状，从而即可将二者分开。,本试验采用微量碱变性法来分离纯化质粒,DNA,，具体的分离纯化原理如下：,0,细菌,（含质粒）,溶菌酶,（震荡）,破细胞壁,SDS,NaOH,（细菌,DNA,和质粒,DNA,均通过碱变性成为线状分子）,破细胞膜,冰醋酸,细菌,DNA,与变性蛋白和细胞碎片缠,绕在一起（不能复性）,质粒,DNA,经复性后变为共价闭合环状,离心,沉淀：细菌,DNA,、,细胞碎片等,上清：质粒,DNA,、,RNA,、,可溶性蛋白等,酚：氯仿,离心,下层：酚，氯仿,中层：变性蛋白,上清（水层）：质粒,DNA,、,RNA,等,无水乙醇,离心,上清：可溶性杂质等,沉淀：质粒,DNA,、,RNA,等,RNase,质粒,DNA,（一）质粒,DNA,的提取与电泳鉴定,质粒,DNA,的天然结构为共价闭环（超螺旋）结构，但在制备过程中，由于各种因素的影响，同一质粒,DNA,的分子可能呈现出如下几种构型：,超螺旋型（共价闭环）质粒,DNA,：,（,cccDNA,）超螺旋状。,开环质粒,DNA,：（,ocDNA,）,质粒,DNA,的两条链中有一条链发生一处或多处断裂，从而形成松弛的环状分子。,线状质粒,DNA,：（,linearDNA,）,质粒,DNA,的两,条链在同一处断裂，从而变为线状分子。见,图,1,（一）质粒,DNA,的提取与电泳鉴定,电泳时，由于分子形状的不同，三种质粒,DNA,的,泳动行为不同，根据电泳迁移率从小到大的顺序分别为开环质粒,DNA,、,线状质粒,DNA,和超螺旋质粒,DNA,。,3,、,DNA,的琼脂糖凝胶电泳鉴定原理,核酸是一种两性电解质（碱基、磷酸），在,pH8.0,下，核酸带负电荷，电泳时向正极移动，根据核酸分子所带电荷的多少，分子的大小及构型的差异，可用电泳的方法对核酸进行分离和鉴定。,（一）质粒,DNA,的提取与电泳鉴定,电泳中所使用的支持介质有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶，核酸中常用琼脂糖凝胶。,不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离,200bp50kb,的,DNA,片断，通过在琼脂糖溶液中加入低浓度的莹光染料溴乙锭（,EB,），,在紫外光下即可检测出,10ng,的,DNA,条带。,当用琼脂糖凝胶电泳法检测质粒,DNA,样品时，根,据条带的位置即可知道质粒,DNA,的三种构型及其比例。,（一）质粒,DNA,的提取与电泳鉴定,此外，还可了解质粒样品中的杂质，如,RNA,、,染色体,DNA,、,蛋白质等的污染程度。电泳时如用已知分子量的核酸作对照，还可测定样品核酸的分子量。,4,、材料与试剂,、试验材料,本实验所用质粒为重组的,pBSKS,质粒。其中质粒,pBSKS,来源于大肠杆菌，其物理图谱见,图,1.2,。,（一）质粒,DNA,的提取与电泳鉴定,经在,BamH,和,Hind,切点间连接上一个大小为,1.7kb,的片段，即成为重组的,pBSKS,质粒。见,图,1.3,。,、试验试剂,试验试剂及使用时的注意事项解说详见,P144,及,P147,。,标准核酸的分子量见,图,1.4,。,5,、操作步骤,、质粒的提取,（一）质粒,DNA,的提取与电泳鉴定,质粒提取的操作方法及注意事项解说详见,P145,。,、电泳鉴定,胶浓度：,0.70.8%,上样量：,5ul,质粒,+1ul,上样缓冲液,各步操作方法及注意事项解说详见,P148,。,6,、实验结果及处理,仔细观察纯化过程中各步试验现象。,仔细观察电泳后荧光带的显示情况，据此绘制电泳图谱并对图谱进行简要说明。,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,1,、限制性内切酶简介,限制性内切酶或限制性核酸内切酶（,Restriction Enzyme or Restriction,Endonuclease,）,是指能辨认双链,DNA,分子中的特异碱基序列，并在此序列处以内切方式将,DNA,双链同时切断的一类酶。,根据它们的作用特点，可将其分为三类：,类和,类酶，在同一种酶分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用，,类酶由于切割位点随机，,类酶则由于切割位点不对称，因此这两类酶的作用都不大。,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,类酶由两种酶组成，一种为限制性核酸内切酶，另一种为独立的甲基化酶。其中，对我们最为有用的是,类酶中的限制性核酸内切酶。,限制性核酸内切酶广泛存在于原核生物中，,1970,年由,H.O.Smith,等从流感嗜血菌中最先分离得到。现已发现近几百种,(498,种,),。,该类酶能识别,DNA,分子中的特异序列，并在此序列处切断,DNA,双链。,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,绝大多数限制性内切酶的识别序列为,4,个,6,个碱基对，该序列具回文对称结构，且富含,GC,。（,即旋转,180,0,后与原来结构相同），少数酶可识别更长的序列或兼并序列。,限制性内切酶切割后的,DNA,片断，有的产生粘性末端，有的产生平末端。如：,、产生粘末端的酶,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,BamH,：,G G A T C C Hind,：,A A G C T T,C C T A G G T T C G A A,两条链的断裂位置是交错地担又对称地围绕着一个对称轴排列。,、产生平末端的酶：,Hae,：,G G C C,C C G G,两条链的断裂位置处在一个对称结构的中心。常用限制性内切酶的酶切位点可参见有关书藉。,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,限制性内切酶由于能识别特异顺序并进行切割，因而在基因重组、序列分析、基因组甲基化分析及基因物理图谱的绘制等技术中被广泛应用。,2,、重组质粒,pBSKS,的酶切图谱,重组质粒,pBSKS,的酶切图谱见,图,1.5,。,、由图可见，实验所用的,BamH,和,Hind,在质粒,pBSKS,上均为单切点的限制性内切酶，,、,pBSKS,经这两种酶切割后可产生大小二片段，大片段为,2.96kb,，小片段为,1.7kb,。,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,如为完全酶切，电泳后应产生这两个片段的电泳图谱，由此即可对提取的质粒进行鉴定。,3,、操作方法,（,1,）、酶切反应体系,试剂,体积（,ul,）,ddH,2,O,10,10buffer,2,质粒,6,（约,15ug),BamH,1,（约,10U,）,Hind,1,（约,10U,）,总体积,20,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,加样顺序：水,-,缓冲液,-DNA-,酶，酶总是最后才加入到反应体系中。,各组分加完后可轻弹管壁，使混合均匀，并用离心机短暂离心至管底。切忌振荡混匀！,（,2,）、酶切条件,将离心管置于,37,保温,2h,，使酶切完全，备用。,（,3,）、电泳鉴定,胶浓度：,0.81.0%,上样量：,10ul,质粒,+2ul,上样缓冲液,各步操作方法及注意事项解说详见,P148-,P149,。,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,4,、实验结果及处理,仔细观察电泳后荧光带的显示情况，据此绘制电泳图谱并对图谱进行简要说明。,注意与未经酶切的质粒的电泳图谱相比较。,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,5,、单酶切反应标准体系的建立,在建立酶切反应体系时主要需考虑两个关键因素：加入的,DNA,量,和酶量。,根据定义，在,50,l,体系中，,1,单位的限制性内切酶即可在,60,分钟内完全切割,1,g,的底物,DNA,。,但是，目前大多使用,5,10,倍量的过量酶来切割,DNA,，以利于克服由于,DNA,来源不同、质量和纯度不同而造成的实验失败。,1,、一般的反应体系如下：,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,2,、反应条件,反应时间：,12,小时，一般,1.5,小时。,可加入过量的酶以缩短反应时间。,对于许多酶，都可以用更少单位的酶消化,16,小时。,反应温度：一般,37,，但应注意因酶而异。,反应体系,ddH,2,O,10buffer,DNA,酶,10,ul,用水补足到,10,ul,1,ul,0.1ug,1U,20,ul,用水补足到,20,ul,2,ul,0.5ug,5U,50,ul,用水补足到,50,ul,5,ul,1ug,10U,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,3,、终止反应,若消化后的,DNA,不需要进行后续的实验操作，可用终止液终止反应（,50%,甘油、,50,mM,EDTA,（,pH 8.0,）和,0.05%,溴酚蓝）。按每,50,l,反应体系中加入,10,l,的比例进行。,若消化后的,DNA,需要进行后续的实验操作，可用热失活法终止（,65,或,85,保温,2030,分钟）。,也可利,用商业化的离心柱或酚,/,氯仿抽提去除内切酶。,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,6,、影响限制性酶切反应的因素,DNA,纯度、缓冲液、温度及限制酶本身都会影响酶的活性。,1,、,DNA,纯度,待切割的,DNA,应当已去除酚、氯仿、乙醇、,EDTA,、变性剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。,DNA,样品中蛋白含量过高、高浓度的,RNA,等对酶切均有影响。,酶切体系中,DNA,浓度过高也会导致酶切失败。建议酶切反应的,DNA,浓度为,0.1-0.4ug/ul,。,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,另外，应注意甲基化的,DNA,会抑制某些酶的切割效率。,2,、内切酶,内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。,为避免污染，每次吸取酶时都需用新的吸管头。,酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应加好并已预混合）。,加入的酶量在底物（,DNA,）一定的条件下，酶量投入越多则酶切效果越好。,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,但如酶量超过反应体系的,10,时，会造成体系中甘油过量（因,酶,的储存液中含有,50,的甘油），而使酶产生,Star,活性。,因此，酶量的加入原则：不超过反应总体积的,10,，在能切开的条件下越少越好。,3,、,缓冲液,每一种酶厂家都提供有相应的最佳缓冲液，可保证几乎,100%,的酶活性。,有的酶要求,100g/ml,的,BSA,以实现最佳活性。不需要,BSA,的酶如果加了,BSA,也不会受太大影响。,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,按盐离子浓度缓冲液可分为三大类：高盐、中盐和低盐。每种酶都有自己的盐浓度需求。,缓冲液配制为,10,的母液，酶切时需稀释,10,倍。,常规酶切中均选用最佳缓冲液进行酶切反应，,联合酶切时，可根据厂商提供的联合酶切的缓冲液选择表选择缓冲液或采用万能缓冲液。,4,、,混合,这是非常重要然而常常被忽略的一步，想要反应完全，必须使反应液充分混合。,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,推荐用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。,注意：不可振荡！,5,、反应温度,常规酶切反应均在,37,进行,但有些酶的最佳反应温度并不是此温度，如,SmaI,，最适反应温度为,30,，故最好根据所选用的酶确定反应温度。,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,当采用联合酶切进行实验时尤其要注意选择的反应温度是否都满足两者的要求，如果有一个酶的最适温度不符，建议分步酶切。,6,、反应时间,常规酶切反应时间为,1.5,小时，但可根据酶切对象和酶的用量将保温时间延长,2,3,小时，有时甚至可以过夜。,一般来说，在,DNA,量固定的前提下，长时间酶切所需的酶量可适当减少，所以在大剂量酶切,DNA,时，可以考虑酶切过夜。,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,7,、双酶切的解决方法,在,DNA,重组实验中，经常会用双酶切（甚至是,3,个酶切鉴定）鉴定重组子或获得不同粘性末端的,DNA,片段，,应注意，如采用两种限制酶进行切割，则必须分别提供各自的最适盐浓度。,若两者可用同种缓冲液，则可同时水解，否则低盐浓度的限制酶必须先用，待调节盐浓度后，再用高盐浓度的限制酶水解。,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,也可在第一个酶切反应完成后，将第一个酶变性除去后再进行第二个酶切反应。,应注意厂商提供的联合酶切缓冲液中并不包括所有类型的酶，即使提供了“万能缓冲液”，有些酶的联合酶切也不一定能取得比较好的效果。,通用的解决方法有两种：,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,（,1,）分步酶切法,即先选择一个酶，采用此酶的最佳反应条件进行酶切，酶切完全的,DNA,进行沉淀后再溶解，然后选用第二个酶进行最佳反应。,在酶切时，一般选择便宜的酶进行酶切沉淀，而后再进行第二个酶的酶切反应。,此方法通用性较强，联合酶切也比较完全，但较耗时，而且,DNA,再沉淀后有部分损失，要求开始时,DNA,的投入量要比较高。,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,（,2,）同步酶切法,取两种酶的最佳缓冲液各,50,加入到酶切反应体系中，并同时加入两种酶进行反应。,特别是对不同厂商提供的酶进行联合酶切时，即可节约时间也可取得比较好的酶切效果。,8,、酶切失败的原因及处理办法,酶切失败主要表现为两方面：,（,1,）不完全酶切甚至是,DNA,基本未发生酶切。主要原因有：,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,a,、缓冲体系不合适，可进行重新酶切。,b,、酶量加入过少或酶已失活。增加酶量或换用新酶。,c,、反应时间不够。延长反应时间。,d,、,DNA,样品杂质含量高，可采用稀释酶切或将,DNA,样品重新抽提后酶切。,（,2,）,DNA,被降解（不成带状），主要原因是：,DNA,样品中含有痕量的,DNA,酶，建议重新抽提质粒除去,DNA,酶。,（二）、质粒,DNA,的酶切鉴定,（,3,）、出现多余的带。主要原因有：,a,、酶量过多，出现了星号活力。,b,、,DNA,样品中有杂,DNA,。,图,1.1,图,1.2,图,1.3,2.96kb,1.7kb,重组,pBSKS,质粒,(4.66kb),BamH,Hind,图,1.5,图,1.4,图,1.5,