第四节 金黄色葡萄球菌检验.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,金黄色葡萄球菌检验,金黄色葡萄球菌,(Staphyloccocus aureus Rosenbach),是人类的一种重要,病原菌,，隶属于,葡萄球菌属,（,Staphylococcus,），可引起多种严重,感染,。有“嗜肉菌,的别称。,概况,葡萄球菌属微球菌科，本菌有,19,个菌种，从人体上可检出,12,个种。,葡萄球菌属主要与皮肤腺体和温血动物的粘膜相关系，有些种是人及动物的条件致病菌。,金黄色葡萄球菌对人类有致病性，通常被称为病原性球菌。金黄色葡萄球菌可引起化脓性炎症，又称为化脓性球菌。,革兰氏阳性球菌,，直径为,0.8-1.0,微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的,簇群，如葡萄。,生物学特性,菌体形态及培养特征,大多数菌株产生类胡罗卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件。,生物学特性,菌体形态及培养特征,大多数菌株最适温度,30-37,，最适,pH,为,7.0-7.5,；,兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；,可在,15%,氯化钠和,40%,胆汁中生长。,一般用含,10%,氯化钠的大豆肉汤增菌或,7.5%,氯化钠肉汤增菌。,所有的毒株产生,凝固酶,，人和动物来源的菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。,产生蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和溶菌酶，大多数菌株可水解天然的动物蛋白，例如血红蛋白、纤维蛋白、卵白、酪朊和多肽类如明胶，水解脂类、吐温类和磷脂蛋白质，并释放脂肪酸；,生物学特性,生化特征,在血平板上可形成明显透明的溶血环。为,型溶血。,可产生卵磷脂，在卵黄高盐培养基上形成周围有白色沉淀环的菌落。,大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红试验、,VP,试验多为阳性，不产生靛基质，触酶阳性。,致病菌可产生凝血浆酶。,触酶试验（过氧化氢酶试验）,原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。,生物学特性,致病性,金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱,主要取决于其产生的,毒素和侵袭性酶,：,a.,溶血素,：外毒素，分,、,、,、,四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；,b.,杀白细胞素,：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；,c.,血浆凝固酶,：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；,d.,脱氧核糖核酸酶,：脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；,e.,肠毒素,：引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为,A,、,B,、,C,、,D,、,E,五种。,金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。,葡萄球菌皮肤感染,致病性,葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。,当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经,8-10,小时即可相当数量的肠毒素。,分布,在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。,作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，,50%,以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。,传播媒介为被该菌污染的食品，主要为淀粉类,(,如剩饭、米面、粥等,),、牛乳及乳制品，以及鱼、肉、蛋类等。被污染的食物在室温,20-22,放置,5,小时以上时，病菌大量繁殖，并产生肠毒素。,流行病学,季节分布，多见于春夏季；,中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率,83%,，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。,流行病学,金黄色葡萄球菌肠毒素,是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的,33%,，加拿大则更多，占,45%,，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。,流行病学,肠毒素形成条件：,存放温度，在,37C,内，温度越高，产毒时间越短；,存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素；,食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。,耐受力,几乎所有的消毒试剂以及热加工过程对金黄色葡萄球菌都有严重的破坏作用,肠毒素可耐受,100 30,分钟不被破坏。,对于加工过的食品或食品加工设备而言，此菌或其肠毒素的存在通常作为卫生条件差的一种指标。,检验程序与操作方法,根据中华人民共和国国家标准：,食品卫生微生物学检验,GB4789.10-2010,金黄色葡萄球菌检验,操作流程,检样,25g(mL)+,稀释液,225mL,，均质,血浆凝固酶试验,7.5%,氯化钠肉汤或,10%,氯化钠胰酪胨大豆肉汤,BHI,肉汤和营养琼脂斜面,Baird-Parker,平板，血平板,涂片染色,36,1,，,18h24h,结果报告,36,1,B-P,平板,18h24h,或,45h48h,观察溶血,血平板,18h24h,检测步骤,增菌,利用金黄色葡萄球菌,耐盐,的特性（可耐受,15%,的氯化钠），用含,10%,氯化钠的胰酪胨大豆肉汤增菌。,检测步骤,分离,血平板,：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血平板上产生明显的溶血环。,血平板上其,典型菌落,呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血圈。,检测步骤,分离,BP,平板,：,胰蛋白胨、牛肉膏,和,酵母膏,提供碳源、氮源、硫、维生素和痕量矿物元素。,丙酮酸钠,是一种生长促进剂。,亚碲酸盐,对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有毒性，并使菌落产生黑色。,卵黄,提供营养和有利于观察卵磷脂环。,甘氨酸,和,氯化锂,对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。,检测步骤,分离,在,BP,平板上其,典型菌落,为：圆形，光滑突起，湿润，直径,2-3mm,，颜色呈灰色到黑玉色，边缘常为淡色（米黄色或灰白色略带灰色或黄色的白色），周围为一,混浊带,，在其外缘常有一,透明圈,。用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。,偶然会遇到不分解脂肪菌株，除无混浊带及透明圈外，其他外观基本相同。,长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落，其黑色常较典型菌落淡些，且外观可能粗燥，质地较干燥。,检测步骤,-,鉴定,金黄色葡萄球菌可以产生,凝固酶,，因此对其鉴别的主要实验是测定其凝固酶。,对于凝固不完全的菌株，可以通过一些其他实验来进一步,确认,，例如：厌氧葡萄糖发酵、溶葡萄球菌酶敏感性实验、耐热核酸酶实验等。,所有这些实验不能作为鉴别其产毒与否的依据。,25g,样品,+225ml,生理盐水,5mL,样品匀液（,1:10,）,+50mL,胰酪胨大豆肉汤,血平板,36,1,24hr,镜 检,营养肉汤,血浆凝固酶,实验,报告结果,定性,检测,36,1,24hr,36,1,24hr,36,1,6,h,r,BP,平板,25g,样品,+225ml,生理盐水,选三个连续梯度，每个梯度各取,3mL,加入,3,管胰酪胨大豆肉汤,将有生长的管划线接种,36,1,48hr,镜 检,营养肉汤,血浆凝固酶,实验,报告结果,MPN/g(mL),定量,检测,（,MPN,法）,36,1,48hr,36,1,24hr,36,1,6hr,适用于检测可能含有,少量,金黄色葡萄球菌，却带有,大量竞争菌,的样品,梯度稀释,25g,样品,+225ml,生理盐水,选三个连续梯度，每个梯度分别取,1mL,接种之至表面干燥的,BP,平板（如,0.4mL,，,0.3mL,，,0.3mL,）,平板计数（分别记录每种类型的菌落数）,36,1,48hr,镜 检,营养肉汤,血浆凝固酶实验,报告结果,金葡菌数,/g(mL),定量,检测,（平板法）,每种类型至少选取一个菌落,36,1,24hr,36,1,6hr,适用于检测金黄色葡萄球菌数,不小于,10/g,（,mL,）,的食品,梯度稀释,Petrifilm,TM,测试片法检验程序,检样,25g(mL)+225mL,稀释，匀质，,10,倍系列稀释,选择适宜稀释度的样品匀液，各取,1mL,分别加入纸片,361,24,2h,判读,没有菌落,只有典型紫红色菌落,将所有紫红色菌落计数为金黄色葡萄球菌,除典型紫红色菌落外其他颜色的菌落,加入确认反应片，,361,，培养,13h,有粉红色菌晕的菌落计数为金黄色葡萄球菌,报告,金黄色葡萄球菌,Petrifilm,TM,测试片，含具有显色功能、经改良的,Baird-Parker,培养基，对金黄色葡萄球菌的生长有很强的选择。金黄色葡萄球菌在测试片上生成为暗紫红色的菌落，可以直接完成鉴定和计数。,