用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,报 告 人：王浩丞,2012,年,4,月,26,日,用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,主要内容,DNA-DNA,杂交,16SrDNA,在细菌分类鉴定的应用,几种“看家基因”（,Housekeeping genes,）,在细菌分类鉴定的应用,DNA-DNA,杂交,现代细菌分类学中，,DNA-DNA,分子杂交一直认为是作为细菌分类和鉴定的,“黄金法则”,。,基本原理：使用,DNA,解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的,DNA,在体外变性（高温或,pH),，并在合适的条件下,(,盐类浓度和温度），使互补的碱基重新配对，测量杂交百分数,(,常以同源,%,表示；也有称碱基相似性,%,）百分数越高，杂交的两种,DNA,之间碱基线性序列的相似性就越高，说明它们之间的亲缘关系也就越近。,常见的几种方法：（,1,）标记法,（,2,）吸光度法,（,3,）荧光强度法等,DNA-DNA,杂交,核酸杂交目前常采用固相杂交法，将待测菌株双链核酸解成单链固定在硝酸纤维素滤膜等固相支持物上，置入含有经标记的并解链的参照菌株的单链核酸,(,探针,),液中复性，形成新的双链核酸，测定杂合双链的相对放射性强度来确定菌株问的同源性程度。,计算公式：,结果的判定：一般认为核酸杂交同源性小于,20,为不同菌属，,20,60,为属内紧密相,关的种，,60,70,为同种内不同亚种，,大,于,70,为同一亚种,。,DNA-DNA,杂交,16SrDNA,在细菌分类鉴定的应用,细菌核糖体的,RNA,含有,3,种类型，即,23srRNA,、,16 S,rRNA,和,5 S,rRNA,，它们含有的核苷酸分别约为,2900,个，,1 540,个和,120,个。,20,世纪,60,年代末，,Woese,等学者开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类，他通过比较各类生物细胞的,rRNA,特征序列，认为,16 s,rRNA,及其类似的,rRNA,基因序列作为生物系统发育指标最为合适。,其,主要依据,为，它们为细胞所共有，其功能同源且最为古老，既含有保守序列又含可变序列，分子大小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应。,16s,rRNA,和,16s,rDNA,的区别：,16S,中的,S,是一个沉降系数，亦即反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标，值越高，说明分子越大。,rDNA,和,rRNA,中的小写字母,r,是,ribosome(,核糖体,),的缩写。,rDNA,指的是基因组中编码核糖体,RNA,（,rRNA,）分子的对应的,DNA,序列，也就是编码,16S,rRNA,的基因。,rRNA,指的是,rDNA,的转录产物，它是构成核糖体的重要成分，,核糖体由许多小的,rRNA,分子组装而成，,其序列包含,10,个可变区（,variable region,）和,11,个恒定区（,constant region,），其中,V1,、,V2,、,V3,和,V4,共,4,个高变区，尤其是,V2,这一高变区，由于其进化速度相对较快，其中所包含的信息，足够用于物种属及属以上分类单位的比较分析。因此，,Johes,S W,和,Neller,H F,等报道测定,16 S,rDNA,基因的部分序列即可达到鉴定的目的,16SrRNA,基因结构图,第一，由于,16 S,rDNA,具有高度保守性，且分子小、包含的信息量较少，对于亲缘关系较近的细菌，其分辨率不高。,第二，,16 S,rDNA,序列分析只能在属的水平上区分细菌，而在水平分类这个环节上仍然需要借助其他手段加以辅助分析。,16s,rRNA,序列和,DNA-DNA,同源性相关关系的研究表明,:,序列的相性不在,99.8%,以上就不能达到,70%,以上,DNA-DNA,的同源性。,16s,rRNA,总共约有,1500bp,0.2%,的不同相当于,3,个碱基。由于数据库中的数据不一定完全而且个人读取数据也可能出现错读,因此由,16s,rRNA,序列鉴定种是很难的。,16s,rRNA,的同源性分析最适用于属及属以上的远缘关系。目前,已对,2000,种,(,约相当于,50%),以上的真细菌的,16s,rRNA,进行了测序,不同菌属的,16s,rRNA,序列同源性为,70%,95%,细菌核心基因（看家基因）,虽然说细菌的基因组的大小和基因段是千差万别，但是无论多么小，它们必须包含有所有的信息去允许细菌去执行多种必要的功能，给予细胞维持内部的,代谢平衡的能力,，,复制和进化,，这,三种,主要的活细胞的功能。细胞经常能够吸收代谢物但其不是功能蛋白，因此，它们必须去依赖它们自有的基因产物去执行不要的功能。,1.,信息的存储和加工,DNA,的代谢：,（,1,）基本的复制功能（,2,）,DNA,的修复、限制和 修饰,RNA,的代谢 ：,（,1,）基本的转运功能,（,2,）,翻译,（,3,）,RNA,的降解,2,蛋白质的加工、折叠、分泌,3,细胞的结构和细胞壁的加工,4,活跃且处于中间的代谢,gyrB,基因,gyrB,基因是普遍存在于细菌内编码,DNA,促旋酶中,B,亚单位蛋白的基因，属于信息通路中与,DNA,复制、限制、修饰或修复有关的蛋白编码基因。在大多数细菌中，以单拷贝的形式存在细菌基因组的,rnpA,rmpH,dnaA,dnaN,recF,gyrB,rnpA,基因簇中。编码的是唯一一种能诱导,DNA,负超螺旋的拓扑异构酶一,DNA,促旋酶的,B,亚单位蛋白,GyrB,。,DNA,促旋酶是一种细菌,型拓扑异构酶，在,DNA,复制及,DNA,超螺旋结构的维持过程中起着重要的作用。,（,1,）,gyrB,基因序列全长约为,1,21,4 kb,，平均碱基替换率为每,100,万年变化,0,7,0,8,，比,16SrDNA,的每,5000,万年变化,1,的速度快。,（,2,）由于其作为蛋白编码基因，其所固有的遗传密码子的兼并性使得,DNA,序列可以发生较多的变异而不改变氨基酸序列，尤其是密码子的第,3,位碱基，这就使得,gyrB,基因序列在区分和鉴定细菌近缘种方面，比非蛋白编码基因,16 S,rDNA,具有更高的分辨率。,Kasai,在对小单孢菌属,(Micromonospora)15,个有效描述的种和,4,个亚种的,gyrB,序列的研究中，得到了与基于,16 S,rDNA,序列相似的系统发育关系，但种内关系结果不同。经过与,DNA,DNA,杂交的比较分析，结果表明：基于,gyrB,序列的分类,关系更符合,DNA,DNA,杂交结果。,Daug,在利用,gyrB,基因比较肠杆菌科,(,Enterobacteriaceae,),不同属的系统进化关系时发现，与,16 S,rRNA,相比，,gyrB,序列比较适用于属内或属间关系的比较分析。,Soler,等用,gyrB,和,rpoD,序列分析,气单胞菌属,(,Aeromonas,),的系统发育时发现，这,2,个基因具有相同的置换率,(,小于,2,),和相似的变异位点,(,分别为,34,和,32,),，分别用,gyrB,、,rpoD,或结合这,2,个基因的序列分析的结果均与已有分类结果一致。在种内水平上，,gyrB,对相近的种具有很高的分辨率，,rpoD,能把混杂在一起的种区分开来，综合这,2,个基因的序列分析能更好地区分相近的分类单元。,Wang,等对,枯草芽孢杆菌属,的,16S,rRNA,基因、,gyrB,基因序列和,DNA,DNA,hybridization,比较发现，,gyrB,基因序列的相似性在,75.4%95%,之间，而且结果与,DNA,DNA,hybridization,的一致性很高。,rpoB,:,核糖核酸聚合酶是在所有的生物体内在转录以及最终的目标是控制基因表达的调控路径。,rpoB,基因编码五个亚单位中的一种，,亚单位基因所编码的。,rpoB,基因已经用于在临床微生物中的细菌的分子鉴定,它是细菌的一个核心基因。其可变区域位于,2300bp,到,3300bp,之间，,sodA,基因,其具有锰的金属依赖性依赖。超氧化物歧化酶歧化酶（编码超氧化物歧化酶,超氧化物歧化酶可以催化超氧阴离子的歧化反应产生氧分子和过氧化氢。,groEL,:,编码一种热休克蛋白,60Kda,。,recN,:,编码一个重组修复蛋白,多种看家基因的用于进化分析的比较,16Srrna,：,14681478bp,sodA:435bp,rpoB,:680BP,gyrB,；,458bp,groEL,:757bp,Partial sequence comparison of the,rpoB,sodA,groEL,and,gyrB,genes within the genus Streptococcus,Partial,recN,gene sequencing:a new tool for identification and phylogeny within the genus Streptococcus,Olga O.,Glazunova,Didier,Raoult,and,Ve,ronique,Roux,研究了,65,株链球菌（其中有,58,个种和,9,个亚种）,在不同种的细菌类型中，,16SrRNA,的基因序列的相似性是,88.8%,到,99.7%,之间，,sodA,基因的序列相似性是,63.6%,到,100%,，,ropB,序列的相似性是在,76.1%,到,97.6%,之间。,gyrB,基因序列的相似性是在,64.6%,到,97.5%,之间，,groEL,的序列相似性是在,72.6%,到,96.6%,。,recN,基因序列的相似性是从,56.4%,到,98.2%,之间,16SrRNA,序列相似性在两种亚种之间是从,97.6%,到,99.9%,。,sodA,基因的序列相似性是,88%,到,98.9%,，,ropB,序列的相似性是在,97.95,到,99.6%,之间。,gyrB,基因序列的相似性是在,93.7%,到,98.5%,之间，,groEL,的序列相似性是在,93.9%,到,98.8%,。,recN,基因序列的相似性是从,98%,到,89.8%,之间,.,Nucleotide sequence similarities between species and,divergence between subspecies of the genus Streptococcus,recN,represents the best tool to identify streptococci and to study evolution in this group of bacteria,。,系统发育分析和分子鉴定不用当仅仅基于一个所推荐的基因因为可能的基因复制、侧面基因的转移或者缺失，可能导致错误的结果，,16Srna,的基因的部分测序时细菌种类鉴定的第一步，它能够从属的水平和新种类的识别中鉴定出分离株和已公认的 菌株,(,Stackebrandt,et al,，,2002,）,谢谢大家！,