第03章 细胞生物学的研究方法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 细胞生物学的研究方法,Chapter 3 How cells are studied,第四类研究方法,第三类研究方法,第二类研究方法,Cell,V,生化化学分析技术,其它实验技术,细胞生理学技术,第一类研究方法,形态观察技术,第一节 形态观察技术,普通光镜,特殊光镜,形态观察,扫描式电子显微镜,扫描隧道电子显微镜,透射式电子显微镜,冰冻蚀刻技术,紫外光显微镜,暗视野显微镜,相差显微镜,微分干涉差显微镜,荧光显微镜,激光共聚焦显微镜,光学显微镜,电子显微镜,目镜,物镜,集光器,载物台,光源,1.,普通光镜的结构,:,（一）普通光学显微镜,一、光学显微镜,第一节 形态观察技术,2.,普通光镜的成像原理,2,图像,样品,光线,聚光器,物镜,光学显微镜的光路图,第一节 形态观察技术,移动臂,蜡或树脂包埋的样品,切片用钢刀,样品切片蜡带,伸展在盖玻片和,载玻片之间的切片,切片机,(,microtome):,第一节 形态观察技术,在普通光学显微镜下，细胞结构呈,半透明状,，不易看清。,染色的原理,往往将标本切片进行,染色,提高可辨程度,。,第一节 形态观察技术,未染色,已染色,1.,紫外光显微镜,紫外线显微镜以紫外线,(,波长介于,400,nm,与,X,射线之间,),为光源，分辨率可提高,1,倍，可以看到许多在普通光学显微镜下看不到的胶体颗粒。,此外，核酸和有些蛋白质可吸收一定波长的紫外线，因而这种显微镜可用来,测定细胞核中的核酸含量,。,（二）特殊光学显微镜,第一节 形态观察技术,然而，波长越短的紫外线越不易穿透普通玻璃，故必须用以特殊材料（如石英、萤石,(,CaF2)、,碳酸锂等）制造的光学玻璃来制作显微镜透镜，,造价较高,。,另外，紫外线显微镜还要求配置有照相装置，,价格比较昂贵,。,第一节 形态观察技术,实用性较差,2.,暗视野显微镜,这种显微镜使照明光线不能直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜。,第一节 形态观察技术,中央遮光板,暗视野聚光器的设计原理,第一节 形态观察技术,视野的背景黑,物体的边缘亮,利用这种显微镜能见到小至,5,nm,的质点，分辨率比普通显微镜高了,40,倍,，有一些细胞器，如核、线粒体，均清晰可见。,3.,相差显微镜,荷兰物理学家,F.Zernike(1932)：,提高了活细胞结构的反差，从而解决了对活细胞观察的难题。,获诺贝尔物理奖,(1953),第一节 形态观察技术,(phase contrast microscope),特点,：在聚光器或光源上加了一,环形光阑,(,annular diaphragm),在物镜中加了一,环形相板,(,annular phase plate),。,相差显微镜的构造,:,上有一环形区，制成凹槽或凸起（亦可涂上特殊物质）：,环形区的设计深度（或高度）恰好可使通过此区的光线提前或延后,1/4,光程差。,环形光阑,环形相板,使透过聚光器的光线形成,空心光锥,，焦聚到标本上。,第一节 形态观察技术,相差显微镜,的光路图解,第一节 形态观察技术,根据设计，,只有未透过标本的直射光可通过相板环形区,，,而透过标本的偏折光则由相板其他部分通过,。两组光线和轴后发生干涉现象。,两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成,暗反差,（,正反差,）,结构比周围介质更加变暗。,未透过标本的直射光（通过相板环形区,）与,透过标本的偏折光（由相板其他部分通过）,和轴,后发生,干涉,：,第一节 形态观察技术,S-D,S,D,如果为,凹形相板,：,通过样品的光线延后,1/4,-1/4,-1/4,则两组光波相加，振幅加大，形成,亮反差,（负反差）,标本结构比周围介质更加变亮。,第一节 形态观察技术,S+D,S,D,如果为,凸性相板,：,由于标本的各种结构的厚度和折射系数不同，在相差显微镜下显示出不同的明暗度。,-1/4,+1/4,4.,微分干涉差显微镜,Nomarski,(1952),在相差显微镜原理的基础上发明的：又称,Nomarski,相差显微镜，其优点是,能显示结构的三维立体投影影像,。,第一节 形态观察技术,(differential interference contrast(DIC)microscope),与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大。,DIC,显微镜首先,DIC,利用的是,偏振光,。此外，除了物镜外，还增加了四个光学组件：,偏振器,(,polarizer)、,DIC,棱镜,、,DIC,滑行器,和,检偏器,(,analyzer)。,DIC,显微镜使细胞的细微结构立体感特别强，适合于显微操作。目前像,基因注入,、,核移植,等生物工程的显微操作常在这种显微镜下进行。,第一节 形态观察技术,DIC,显微镜,暗视野显微镜,相差显微镜,普通显微镜,荧光显微镜的成象原理,5.,荧光显微镜,第一节 形态观察技术,分裂细胞的,免疫荧光图像,不同荧光染料,标记,抗 体,抗原,(,细胞的蛋白质成分,),特异性结合,6.,激光共聚焦显微镜,第一节 形态观察技术,(,Laser,Confocal,Microscope,LCM),光源：,通过共聚焦可进行光学切片,对固相、液相物体均可进行观察,特点：,激光,Q550MW型LCM,4.,冰冻蚀刻技术,2.,扫描式电子显微镜,3.,扫描隧道电子显微镜,1.,透射式电子显微镜,二、电子显微镜,第一节 形态观察技术,电镜问世的必然性,分辨力的概念及其提高方法,分辨力,(,resolution),是指,显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,，通常是用相邻两点间的距离来表示，可通过公式换算出：,可见光波长为,400700,nm，,显微镜分辨率的最小数值不会小于,0.2,m,，,这一数值是光学显微镜分辨率的极限。,镜口率的大小决定于镜口角的大小和物镜与标本间介质折射率的大小,第一节 形态观察技术,电镜问世的必然性,限制显微镜分辨率的关键因素是,光的波长,，一般光学显微镜的最大放大倍数为,10001500,。,小于,0.2,m,的一些细微结构，称为,亚显微结构,(,submicroscopic structure),或,超微结构,(,ultrastructure,)，,在光学显微镜下无法看清。,要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。,0.2,m,放大倍数,=,显微镜的分辨率,人肉眼的分辨率,0.2,m,镜口率,折射率,光源波长,(,nm),第一节 形态观察技术,表,各种光及电子束的波长,Ruska,(19331938),便选择了电子束为光源来突破光学显微镜分辨率的极限，发明了,透射电子显微镜,(,transmission electron microscope,TEM)。,电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。,第一节 形态观察技术,V,1,电子显微镜与光镜的成像原理比较：,第一节 形态观察技术,电子显微镜与光镜的主要区别,电 镜,光 镜,电子束,可见光,电磁透镜,玻璃透镜,电磁聚焦,机械聚焦,超薄切片,(0.05,m),石蜡切片,(110,m),光 源,透 镜,聚焦方式,切片厚度,图 像,彩色图像,黑白图像,第一节 形态观察技术,由于电子束不能透过玻璃，因此用于电镜的标本须制成厚度仅有,0.05,m,的,超薄切片,，并放在铜网上。这种切片需要用超薄切片机,制作。电子显微镜的放大倍,数最高可达近,百万倍,。,1.,透射电子显微镜,超薄切片,铜网,第一节 形态观察技术,透射式电子显微镜,(,TEM),第一节 形态观察技术,它是将标本表面上发射出的,次级电子,，被带样电荷的栅极收集后，即向,电子显象管,发送信号，在荧光屏上显示出,与电子束同步的扫描图像,。图像为,立体形象,，反映了标本表面的真实结构。,2.,扫描电子显微镜,用来观察标本的,表面形态结构,。,第一节 形态观察技术,(scanning electron microscope,SEM),扫描式电子显微镜,第一节 形态观察技术,耳听毛的扫描电镜图像,第一节 形态观察技术,3.,扫描隧道显微镜,其关键部件是有一个,加上一定电压的精密探针,，当探针接近物质时，由于隧道效应而有电子飞出，从而在探针与物质之间有电流通过。,Binnig,、,Rohrer,等(1981),发明：,荣获,1986,年诺贝尔奖,！,据量子力学中隧道效应设计，用来显示晶体表面原子布阵,第一节 形态观察技术,(scanning tunneling microscope,STM),当探针沿物质表面扫描时，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图象化，即可显示出原子水平的凹凸形形态。,探针,物质,第一节 形态观察技术,扫描隧道显微镜的分辨率很高（,横向为,0.1-0.2,nm,纵向可达,0.001,nm,）。,扫描隧道显微镜能直接观察,生物大分子,(如,DNA、RNA,和蛋白质等,),的原子布阵,，也能观察一些,生物结构,(,如生物膜、细胞壁等,),的原子排列,。在生物学研究中发挥着重要作用，将把生物学研究推进到,纳米科学水平,。,其优越之处：,三态,（固态、液态和气态）,物质均可进行观察,。,第一节 形态观察技术,扫描隧道电子显微镜下金原子的晶格排列图像,第一节 形态观察技术,亦称冰冻断裂,(,freeze-fracture)，,是研究生物膜内部结构的一种有用的技术，关于膜结构的许多资料即是利用这种方法取得的。,4.,冰冻蚀刻技术,冰冻断裂技术也是研究细胞内部各种细胞器结构的有用手段。,第一节 形态观察技术,(freeze-etching),将标本于,-100,干冰中或,-196,液氮中，,超低温冰冻,。,然后用冷刀骤然将标本冲断开，升温后冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面结构,蚀刻,(,etching)。,蚀刻,断裂,(2),冰冻蚀刻技术的操作步骤,:,第一节 形态观察技术,蚀刻后，再向断裂上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下，此膜即为,复膜,(,replica)。,复膜,复膜显示出了标本蚀刻面的形态，可置于透射电镜下观察。电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。,第一节 形态观察技术,(3),细胞冰冻断裂后的电镜图像,第一节 形态观察技术,主要电镜制样技术,小 结,电镜三维重构,冷冻蚀刻和冷冻断裂,负染技术,超薄切片,包埋,切片,固定,染色,扫描电镜技术,第二节 生物化学分析技术,二、免疫细胞化学,三、分子生物学定位技术,四、放射自显影术,五、超离心技术,六、分子杂交技术,七、,PCR,技术,一、组织化学与细胞化学技术,八、层析技术,一、组织化学和细胞化学技术,组织化学和细胞化学染色方法,(,histochemical,and,cytochemical,staining method),依据化学反应原理，对无色透明细胞的某些成分进行定性和定位研究。,细胞化学染色是利用染色剂可同细胞的某种成份发生反应而着色的原理，从而得以对某种成份进行研究和分析。,利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。,第二节 生物化学分析技术,最典型的组织化学显示法是,Feulgen,反应显示法,(,Feulgen,reaction)。,此法由,Feulgen,和,Rossenbeck,(1924),发明，对,DNA,的反应具有高度专一性。,其原理是,:,标本经稀盐酸水解后，,DNA,分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。,Schiff,试剂中的无色品红与醛基反应，形成含有醌基的化合物，醌基为发色团，呈现出,紫红色,。,第二节 生物化学分析技术,免疫细胞化学是根据免疫学原理，利用,抗体,同特定,抗原,结合，对抗原进行专一定位测定的技术。,如果将抗体结合上,标记物,，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。,二、免疫细胞化学,(,immunocytochemistry,),第二节 生物化学分析技术,常用的标记物有,荧光素,和,酶,：,标记荧光素的称为,免疫荧光法,(,immunofluorescent,technique)，,常用的萤光素有异硫氰酸荧光素,(,FITC)、,罗丹明,(,rhodamine,),等。,标记酶的称为,酶标免疫法,(,enzyme-,labelled,antibody method)，,常用的酶有辣根过氧化物酶,(,horseradish,peroxidase,),等，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物或有色物，从而显示出抗原的存在部位。,第二节 生物化学分析技术,抗体与抗原的结合方法可分为,以下,两种：,第二节 生物化学分析技术,直接法,间接法,将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位,在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的,次级抗体,与,初级抗体,反应，从而使初级反应得到放大，增强显示效果,间接免疫细胞化学法的原理示意图,次级,抗体,初级,抗体,标记物,第二节 生物化学分析技术,第一抗体（一抗）,第二抗体（二抗）,用荧光素标记抗体所显示出的细胞中几种蛋白质的分布状态,第二节 生物化学分析技术,IRS-1,IRS-1+Bcl-2,Bcl-2,Enzyme-Linked,ImmunoSorbent,Assay（ELISA),此颜色深浅可用酶标仪精确地测定出来,如,酶联免疫吸附试验,酶与底物反应产生有色产物，颜色深浅代表了反应的强弱,卤虫孵化腺细胞的,ELISA,染色照片,(,樊,廷俊等,2003),三、分子生物学方法的基因表达定位研究,第二节 生物化学分析技术,1,为转,GFP,基因的烟草单细胞；,2,为转,SCaM1-GFP,融合基因的烟草单细胞；,3,为转,SCaM4-GFP,融合基因的烟草单细胞。,质壁分离后转基因烟草单细胞的激光共聚焦显微镜观察,细胞壁,细胞膜,细胞核,细胞壁,细胞壁,细胞膜,细胞核,细胞膜,细胞核,细胞核,细胞膜,细胞壁,细胞核,细胞膜,放射性同位素发射出的各种射线能使照相乳胶中的溴化银晶体还原,(,感光,),。利用放射性物质使照相乳胶膜产生该物质自身影像的技术，称为,放射自显影术,。,放射自显影的切片用染料染色后，便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或定量测定。,四、放射自显影术,第二节 生物化学分析技术,(autoradiography),由于有机大分子均含有碳、氢原子，故实验室一般常选用,14,C,和,3,H,标记,(,14,C,和,3,H,均为弱,放射性同位素，半衰期长,:,14,C,为5730年;,3,H,为12.26年),。,一般,常用,3,H,胸腺嘧啶脱氧核苷来显示,DNA，,用,3,H-,尿嘧啶核苷显示,RNA。,在研究,蛋白质,和,粘多糖,时，则分别选用,3,H-,氨基酸和,3,H-,甘露糖,、,3,H-,岩藻糖,等。,第二节 生物化学分析技术,常用,3,H,胸腺嘧啶脱氧核苷显示,DNA,的放射自显影图像,第二节 生物化学分析技术,放射自显影技术与电镜技术结合，也可进行,电镜自显影,（,electron-microscopic autoradiography,）。,电镜自显影照片,要研究细胞的各中结构和成分的化学性质和生理功能，需要把它们分离和抽提出来进行研究。,离心是研究亚细胞成分和生物大分子的必要手段。,细胞匀浆后，悬液中含有各种细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体等）及各种大分子。要想把它们一一分离开，只利用普通低速离心机是很难做到的。,五、超离心技术,第二节 生物化学分析技术,离心机结构与原理示意图,马达,冷冻,真空,沉降物,转子,装甲室,第二节 生物化学分析技术,转速为,1000025000,r/min（,离心力小于,89000,g）,的离心机称为,高速离心机,；,转速超过,25000,r/min,（,离心力大于,89000,g,）,者称为,超速离心机,。,目前超速离心机的最高转速可达,80000,r/min,，,离心力超过,500000,g,。,第二节 生物化学分析技术,被离心的物质所受的,离心力,不仅与,转速,有关，而且还同,物质到转头中心的距离,有关。因此要准确表示离心条件要用离心力，而不单是转速。,离心力,(,g),是由,角速度,和,旋转半径,(,R),的大小决定的，单位为克，计算公式如下,:,g=,2,R,(2,n),2,3600,980,R,g=,第二节 生物化学分析技术,各种颗粒在离心场中的沉降速度不同，这取决颗粒的,大小,、,形状,和,密度,，也与,离心力,以及,悬液介质的密度,和,粘度,有关。,式中,S,为沉降系数,(秒)；,R,为沉降颗粒到转头中心的距离,(,半径，,cm)；,为角速度，以每秒转动的弧度表示；,t,为时间,(秒),。,当颗粒受到的净离心力（离心力与浮力之差）与溶剂的摩擦阻力达到平衡时，单位离离心场强度的沉降速度为定值，此即为,沉降系数,(,sedimentation coefficient,S)。,第二节 生物化学分析技术,根据分离的对象和目的不同，超离心技术可分为两大类：,用于制备和纯化亚细胞成分和大分子，目的是制备样品,分析和测定制剂中大分子的种类和性质,(,浮力密度和分子量等,),制备离心,(,preparative,cetrifugation,),分析离心,(,analytical centrifugation),第二节 生物化学分析技术,利用肝脏制备各种亚细胞组分的制备离心过程示意图,匀浆物,肝脏,上清夜,完整,细胞,完整,细胞,1000g,20min,核,线粒体,溶酶体,过氧化物酶体,微粒体,内质网,100000g,120min,105000g,20min,DNase,静置,20,min,10000g,20min,核糖体,第二节 生物化学分析技术,差速离心,密度梯度离心,CsCl,密度,梯度离心,蔗糖密度,梯度离心,第二节 生物化学分析技术,低速离心,中速离心,高速离心,超高速离心,细胞匀浆,细胞,核仁,细胞骨架,大细胞器,小细胞器,核糖体,大分子,离心,样品,蔗糖的稳定梯度,慢速沉降成分,快速沉降成分,分画,样品,蔗糖的不连续梯度,低浮力密度成分,高浮力密度成分,流式细胞分选术,(,fluorescence-associated cell sorting,FACS,),激光,细胞悬液,鞘液,液滴加电信号,探测器,超声波振摇器,加负电的液滴,加正电的液滴,细胞收集容器,细胞收集容器,废液容器（未探测细胞）,第二节 生物化学分析技术,核酸杂交原理示意图,第二节 生物化学分析技术,六、分子杂交技术,原理,：具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成,DNA-DNA、DNA-RNA,或,RNA-RNA,杂交的双链分子。,这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有,互补关系,。,第二节 生物化学分析技术,(molecular hybridization),在,高,pH,值,下，染色体,DNA,解链，带标记的核酸探针即可与染色体一定部位的互补单链,DNA,杂交。,这种方法既可检测,DNA,序列,，也可检测,RNA,序列,。既可用,放射性探针法,，又可使用,免疫探针法,。,在不破坏细胞或细胞器的情况下，用核酸探针检测特定核苷酸序列在染色体上的精确位置的技术，称为,原位杂交,(,in situ hybridization)。,第二节 生物化学分析技术,荧光原位杂交,(,fluorescence in situ hybridization,FISH,):,FISH,技术的原理图解,DNA chip,技术,第二节 生物化学分析技术,芯片,七、,PCR,技术,根据双链,DNA,的变性与复性和分子杂交原理设计出的技术，目的是将极微量,DNA,大量扩增。,原 理,：将,DNA,片段经过若干次解链和复性循环，大量扩增，甚至可扩增到十几亿倍，以便于对已知,DNA,片段进行分析，如,基因分析,、,序列分析,、,进化关系分析,和,临床诊断,等。,第二节 生物化学分析技术,(,多聚酶链反应,p,olymerase,c,hain,r,eaction,),PCR,反应原理,第二节 生物化学分析技术,经过,PCR,获得的大量,DNA,片断都是以原有的微量,DNA,片断为模板扩增而来，故此技术亦称为,分子克隆技术,(,molecular cloning,),。,八、,层析技术,用于细胞组分的分离及其纯化,第二节 生物化学分析技术,凝胶过滤柱层析,第二节 生物化学分析技术,离子交换柱层析,亲合层析,第二节 生物化学分析技术,第三节 细胞生理学技术,一、膜电位检测技术,二、膜片钳位记录技术,三、细胞电泳,一、膜电位检测技术,细胞的质膜内外两侧由于阳离子浓度不同而形成浓度梯度差（常为外高内低）,从而在质膜两侧造成一定的电位差，该电位差即称为,膜电位,(,membrane potential)。,膜电位的大小因,细胞种类,不同而异，范围在,-20-100,mV,之间，负值表示,膜内与膜外相比为负,。,第三节 细胞生理学技术,因而,膜电位的变化反映了细胞的生理变化,，测定膜电位的数值可作为,细胞生理状态,的一个指标。在神经传导和肌肉收缩运动中膜电位的变化起着极其重要的作用。,第三节 细胞生理学技术,细胞体积微小，要使用极其微细的电极进行测量膜电位，这种电极称为,微电极,。,微电极,微电极的构造图解,金属丝,(,镀有氯化银的银丝,),玻璃毛细管,电解质溶液,(,KCl,),微电极是由用玻璃毛细管拉制成的细管和插入一条金属丝组合而成。,用于插入细胞中的微电极的直径不超过,1,m,。,微电极通过导线和示波器或大电位计相连。,第三节 细胞生理学技术,(microelectrode),V,电位计,(,或示波器,),微电极,细胞膜,核,细胞质,细 胞,测量时使用一对微电极，一个插入细胞内，另一个置于细胞外的介质中，这样即可显示或记录膜电位的变化。,神经细胞的静息电位和动作电位,第三节 细胞生理学技术,微电极技术也可用于测量细胞内局部的某种离子浓度，进行着种测量时两个位电极都要插入细胞内。,V,测量某种离子在细胞内的局部浓度时,第三节 细胞生理学技术,离子是通过膜上的,离子通道,（亲水小孔）进出细胞的。为了检测单个特定离子通道的性质和部位，德国马普研究院的,E.,Neher,和,B.,Sakmann,经过长期合作研究，终于在,1976,年研制成功了可检测极低浓度的无机离子通过膜通道的,膜片钳位记录技术,。,二、膜片钳位记录技术,该技术的主要技术关键：可记录通过细胞微小质膜片段的,微弱电流,(1.01.2,10,-11,A)。,第三节 细胞生理学技术,(patch-clamp recording),检测时，用内经约为,1,m,的玻璃管电极将细胞质膜紧紧吸住，或拉下来，以测定进入管内的离子的种类和数量，从而表明离子通道的性质和功能。,单个离子通道的直径约为,0.50.6,nm，,膜电位的变化可引起离子通道的开启或关闭，膜片钳位技术能检测出这种变化。,玻璃管,电极,第三节 细胞生理学技术,膜片钳位记录技术中几种常用的实验方法,第三节 细胞生理学技术,胆囊炎,Cl,-,通道；,癫痫,Na,+,和,K,+,通道；,心血管病,Ca,2+,通道；,神经失常,Ca,2+,通道。,E.,Neher,和,B.,Sakmann,荣获,1991,年诺贝尔奖,第三节 细胞生理学技术,有些疾病与离子通道失常有关,，例如,膜片制导技术对许多,因离子通道失常而引起的疾病的诊断和治疗,有着重要的应用价值。,现在已根据该技术的理论和技术研制出了许多有效的药物,。,三、细胞电泳,细胞表面带有许多荷电基团，有的为正电荷，有的为负电荷，正负相抵,总静电荷为负值,，因而细胞在悬液中总是向电场的正极移动，细胞在外加电场的作用下发生泳动的现象称为,细胞电泳,(,cell,eletrophoresis,)。,第三节 细胞生理学技术,各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。,在恒定的电场条件下，同种细胞的电泳速度相当稳定，因而可通过测定电泳速度来推算出细胞的,电位,。细胞电泳装置即是根据这种原理设计出来的。,电位在诊断疾病上有一定价值,。此外由于细胞在电场中的泳动速度不同，细胞电泳,尚可用来分离不同种类的细胞,，例如可把淋巴样细胞与造血细胞分开。,第三节 细胞生理学技术,山东大学刘玉章先生设计的,SD,型细胞电泳仪,第三节 细胞生理学技术,主要介绍几种对细胞进行整体或局部进行手术处理的技术，这些技术在细胞工程领域中有很重要的应用价值。,一、细胞培养技术,二、显微操作术,三、细胞融合,技术,第四节 其它实验性操作技术,一、细胞培养,活细胞离体后要在一定的生理条件下才能存活和进行生理活动，否则就要死亡。因此，要进行体外细胞培养，就要尽可能满足细胞在正常体内生理状态下的各种条件，其中,选择最佳培养基是最关键的因素,。,细胞培养技术,(,cell culture),或称组织培养技术即是选用各种最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。,第四节 其它实验性操作技术,1.,动物细胞培养,组织培养工作开始于,20,世纪初，,Harrison(1907),最早对两栖类胚胎的神经管组织进行了悬滴培养。,真正开创大规模细胞培养工作是在,20,世纪,40,年代，,W.Earle,和,R.,Dulbecco,设计出了,细胞培养液,配方，并开始了单细胞的悬液培养，细胞培养工作才得到广泛发展。,培养的动物细胞,倒置显微镜,第四节 其它实验性操作技术,群体培养,：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层；,克隆培养,：将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，此种集落即称为,克隆,(,clone)。,一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。,此外，为了制取细胞产品而设计了规模培养法，如,转鼓培养法,、,发酵罐培养,。,细胞培养方式大致可分为两种：,第四节 其它实验性操作技术,针对不同种类的细胞，学者们设计出了许多细胞培养基配方，目前使用比较广泛的,化学合成培养基,(,chemically defined medium),有,TC-199、MEM、L-15,和,RPMI-1640,等。,但是在工作中要针对不同的培养对象来选择最适培养基，,培养基选择恰当与否是细胞培养是否成功的关键,。,第四节 其它实验性操作技术,细胞所需要的营养成分要尽量予以满足；,要保持适当的渗透压；,严格控制,pH；,添加细胞所需的生长因子。,为了满足细胞生长所需的一些营养条件，常在培养液中加入适量的,血清,。然而血清的来源有限，而且血清的成份复杂，影响实验结果的分析，因而近来研究出,无血清培养技术,。,第四节 其它实验性操作技术,在细胞培养工作中，有几种因素需要特别关注：,正常组织的初级培养物，细胞传代培养均有一定的限度，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。,所谓,转化,(,transformation),即是,指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞,。如,HeLa,细胞系,（,1951,年从,He,nrietta,La,cks,的宫颈癌细胞培养而成）。,迄今我国业已建立了上百个细胞系，为细胞生物学和医学做出了重大贡献。,通过细胞培养，世界上已建立了大量细胞株或细胞系。,第四节 其它实验性操作技术,细胞系和细胞株,原代培养细胞（,primary culture cell,）,传代培养细胞（,sub-culture cell,）,细胞株（,cell strain,）,正常二倍体，接触抑制,细胞系（,cell line,）,染色体改变，接触抑制丧失,细胞培养在细胞生物学中是一项极为重要的实验技术，也是生物工程中不可缺少的重要手段。细胞生物学中有大量的生理生化方面的研究成果，都是通过细胞培养再结合其他技术取得的。,第四节 其它实验性操作技术,植物细胞培养最明显的特点是：,可进行组织培养，由外植体生长出植株,；,不易无限传代和建立细胞株,。,2.,植物细胞培养,第四节 其它实验性操作技术,(1),外植体培养，诱发产生愈伤组织：,如果条件适宜，尚可培养出再生植株。,(2),悬浮细胞培养：,在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术。,植物细胞培养大体有如下几种技术,:,(3),原生质体培养：,细胞杂交，转基因等,(4),单倍体培养：,通过,花药,或,花粉,培养获得单倍体植株。,第四节 其它实验性操作技术,二、显微操作术,为了直接对微小细胞进行手术操作和解剖，又设计发明了显微操作技术。,所谓,显微操作术,(,micromanipulation),就是在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖手术和微量注射的技术,。,第四节 其它实验性操作技术,现在显微操作装置的设计越来越精密，已经有可能对细胞核进行解剖和注入微量物质（如核酸分子片段）。,NT-88NE-N,型显微操纵仪,(,日本,Nikon),第四节 其它实验性操作技术,山东省海洋生物工程,重点实验室,注射吸管,固定吸管,细胞显微解剖手术图解,第四节 其它实验性操作技术,显微操作,蝌蚪,未受精卵,小肠,上皮细胞,细胞核,UV,破坏,细胞核,(,或吸出,),注核入卵,正常囊胚,成体蛙,两栖类核移植实验图解,第四节 其它实验性操作技术,三、细胞融合,真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程,称为,细胞融合,(,cell fusion),或,细胞杂交,(,cell hybridization)。,基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为,同核体,(,homokaryon,)；,来自不同基因型的杂交细胞则称为,异核体,(,heterokaryon,)。,第四节 其它实验性操作技术,目前诱导细胞融合的方法有三种：,1.,病毒介导的细胞融合（如仙台病毒）,2.,化学介导的细胞融合（如,PEG）,3.,电激介导的细胞融合,第四节 其它实验性操作技术,细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，如,动植物育种,和,制取单克隆抗体,等。,AB,A,B,杂交细胞,低 产,抗倒伏,高 产,易倒伏,高产,抗倒伏,长 命,无分泌物,短 命,分泌抗体,长 命,分泌抗体,细胞 融合,(,杂交,),第四节 其它实验性操作技术,单克隆抗体制备的杂交瘤技术,第四节 其它实验性操作技术,免疫学上的一场革命,单克隆抗体技术是细胞杂交技术的成功应用），正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能在体外长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人,Kohler,和,Milstein,1975,将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获,1984,年诺贝尔奖。,细胞生物学的研究已经成为对生命活动认识的瓶颈,复 习 思 考 题,1.,阐明光学显微镜的成像原理。为什么说光学显微镜的放大倍数不能无限提高？,2.,透射电镜与普通光学显微镜的成像原理有何异同？,3.,放射自显影技术的原理根据是什么？为何常用,3,H、,14,C、,32,P,标记物做放射自显影？用,60,Co,是否可以？,4.,核型制作技术的主要步骤有哪些？,5.,何谓免疫荧光技术？可自发荧光的细胞物质是否可在普通显微镜下看到荧光？,6.,超离心技术的主要用途有哪些？,7.,细胞融合有那几种方法？病毒诱导与,PEG,的作用机制有何不同？,本章内容到此结束,谢谢大家！,