HPLC分离条件的优化步骤以及定量计算公式的选择.ppt

HPLC,分离条件的优化步骤以及定量计算公式的选择,分离条件的优化,定量计算公式的选择,HPLC,分离优化基本概念,主要内容,确定分离模式与色谱柱,1.,HPLC分离优化基本概念,一、分离度与基本色谱分离方程式,1,、分离度,柱的总分离效能指标,柱效参数：,标准偏差(,),:,即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半,半峰宽,(W1/2):,色谱峰高一半处的宽度,W1/2 =2.354,峰底宽,(W),：,W=4,1.,HPLC分离优化基本概念,R=1.5,，色谱图中两个相邻色谱峰达到基线分离开；,R=1.0,，表明两个相邻组分只有,94%,分离开。,(,最低指标）,分离度表达式：,R=n,1/2,/4,(,-1)/,k,2,/(1+k,2,),R,受热力学因素,容量因子,k,和选择性系数,（,=k,2,/,k,1,）,和动力学因素（理论塔板数,n,）两个方面控制。,若,相邻两峰的峰底宽近似相等,，,令,W,2=W1=,W,，引入相对保留值和塔板数，,分离度公式演变为,下式：,柱效项,柱选择项,柱容量项,1.,HPLC分离优化基本概念,2,、色谱分离基本方程式,2.1,、分离模式的选择,2.,确定分离模式与色谱柱,2.2,色谱柱的选择,2.,确定分离模式与色谱柱,首选,C18/C8,：以15,cm,为佳，可解决80的样品分析，柱效应大于50000。,特殊样品用特定的柱子,不同柱子其保留性差异很大，相同条件，不同柱子比例会不一样。,不同色谱柱需合适的,pH,范围，一般在2.5-7.5之间，有的色谱柱比较耐碱，,kromasil,可以到10，而杂化,xterra,在112,XDB,在,pH3-11.,3.1,容量因子和死时间的测量,在,HPLC,分析中，容量因子,k,是一个非常重要的参数，对如何选择流动相的溶剂组成、改善多组分分离的选择性都发挥着重要的作用。,k=t,R,t,M,t,R,=t,R,-t,M,在,HPLC,分析中，死时间表示了一个在高效液相色谱固定相上未被滞留组分的保留时间。,3.,分离条件的优化,1.,由色谱柱的结构参数进行计算,t,M,=L,r,2,T,/F,式中，,L,为柱长，,cm,；,r,为柱内径半径，,cm,；,F,为流动相体积流速，,cm,3,/s,；,T,为总孔率，对全多孔固定相为,0.84,，对化学键和固定相、离子交换剂为,0.75,，对薄壳型固定相为,0.42,。,死时间,t,M,的测量比较困难，有以下几种方法：,3.,分离条件的优化,2.,由色谱柱的操作参数进行计算,t,M,=,L,2,/,pd,p,2,式中，,为阻抗因子；,为流动相的动力黏度；,L,为柱长；,p,为柱压力降；,d,p,为固定相粒径,3.,依据经验公式计算,当,d,c,/d,p,10,时，可按下述公式计算,t,M,：,t,M,=L/,u,对全多孔固定相,u=1.5F/d,c,2,对非多孔固定相,u=3F/d,c,2,3.,分离条件的优化,4.,液固色谱死时间,用,RID,（折光指数检测器）检测：若以正己烷与极性改性剂作流动相，可以正戊烷作探针测死时间。,用,UVD,（紫外吸收检测器）检测：可以苯、四氯乙烯或,KNO,3,水溶液作探针测死时间,3.,分离条件的优化,5.,液液色谱死时间,用,RID,检测：可以重水（,D,2,O,）、重氢甲醇（,CD,3,OH,）作探针测死时间。,用,UVD,检测：反相可用,NaCl,、,NaNO,3,、,HNO,3,、,HClO,3,、苯甲酸、苦味酸、尿嘧啶水溶液作探针测死时间，测量误差较大。正相可用四氯乙烯、四氟乙烯作探针测死时间。,3.,分离条件的优化,3.2,色谱柱操作参数的选择,色谱柱操作参数：柱长,L,、柱内径,、柱内填充固定相的粒度,d,p,、柱压力降,p,和对应于每米柱长的理论塔板数,n,表示的柱效。,分析型色谱柱，选择操作参数的一般原则如下：,色谱柱长,L 10,25cm,；柱内径,（直径）,4,6mm,；固定相的粒度,d,p,5,10,m,；,柱压力降,p 5,14MPa,；理论塔板数,n,（,2,5,）,10,3,（,2,10,）,10,4,块,/m,3.,分离条件的优化,3.3,样品组分保留值和容量因子的选择,选择好操作参数后，通常希望完成一个简单样品的分析时间控制在,10,30min,之内，若为含多组分的复杂样品，分析时间控制在,60min,以内。,保留时间和容量因子由色谱过程的热力学因素控制，可通过改变流动相的组成和使用梯度洗脱来进行调节。,若使用恒定组成流动相洗脱，与组分保留时间对应的容量因子,k,应保持,110,之间，以求获得满意的分析结果。,3.,分离条件的优化,对组成复杂、由具有宽范围,k,值组分构成的混合物，需用梯度洗脱技术，才能使样品中每个组分都在最佳状态下洗脱出来。（采用梯度洗脱通常能将组分的,k,值减小至原来的,1/10,1/100,，从而缩短了分析时间。）,3.,分离条件的优化,3.4,相邻组分的选择性系数和分离度的选择,为达到某一确定分离度，选择性系数的优化十分重要，对预期柱效,10,3,10,5,块,/m,理论塔板的色谱柱，若相邻组分,k,在,1,10,，且,1.051.10,，则易达到,多组分优化分离的最低指标（,R=1.0,）,选定一种高效液相色谱方法时，很难将各组分间的分离度都调至最佳，只能使少数几对难分离物质对的分离度至少保持,R=1.0,。,R,1.0,，仅呈半峰处分离，则应通过改变流动相组成或改变流动相流速，调节分离度，尽可能使,R=1.0,，才能满足准确定量分析的要求。,3.,分离条件的优化,3.5,流动相的选择,3.5.1,流动相,pH,的选择：,反相色谱法分离弱酸（,3pKa7,）或弱碱（,7pKa8,）样品,调节流动相的,pH,值：,抑制样品组分的解离,增加组分在固定相上的保留,改善峰形，减轻或消除峰拖尾现象,3.5.2,流动相调整的三原则,（,1,）由强到弱（,2,）三倍规则 （,3,）粗调转微调,3.5.3,流动相流速的选择,对内径为,4.6mm,的色谱柱，流速一般选择,1ml,min,，对于内径为,4.0mm,柱，流速选择,0.8ml,min,为佳。,3.,分离条件的优化,3.,分离条件的优化,3.5.4,流动相的洗脱方式选择,(,一,),恒组成溶剂洗脱,:,优点是方法简便、柱易再生，但对于成分复杂的混合物，往往不能满足性质相差较大的组分的分离此时需用梯度洗脱。,(,二,),梯度洗脱：在同一分析周期内按,定程度不断改变流动相的浓度配比，从而使每个组分都在适宜的条件下获得分离的一种洗脱方法。,适用对象：组分较多、性质差别较大的复杂混合物,优点：缩短分析周期；提高分离效能；改善峰形，减少拖尾 ；使峰变锐，能检测出微量组分，因而提高检测灵敏度,4.,定量计算公式的选择,4.,定量计算公式的选择,把所有岀峰的组分含量之和按,100%,计的定量方法，称归一化法。,适用范围：样品中所有组分均能流出色谱柱，并在检测器上产生信号。主要应用于,GC,定量测定，在,HPLC,中很少使用。,i,=,i,A,i,/,i,A,i,100%,式中，,Ai,组分,i,的峰面积；,i,i,组分的质量校正因子,一、归一化法,4.,定量计算公式的选择,在,HPLC,中比较常用，是一种简便、快速的绝对定量方法（归一化法是相对定量方法）,测定样品中组分含量时，根据峰面积和峰高在标准工作曲线上直接查出进入色谱柱中样品组分的浓度，也可通过下式计算,p,i,/%=f,i,/A,i,(h,i,),式中，,A,i,(h,i,)i,组分的峰面积（峰高）,f,i,i,组分标准工作曲线的斜率,二、标准曲线法（外标法,/,直接比较法）,4.,定量计算公式的选择,当预测组分含量变化不大，并已知这一组分的大概含量时，也可不必绘制标准工作曲线，采用单点校正法，即直接比较法。,i,=,s,A,i,(h,i,)/A,s,(h,s,),式中，,s,标准样品溶液质量分数，,%,；,i,样品溶液中待测组分质量分数，,%,；,A,s,(h,s,),标准样品的峰面积（峰高）；,A,i,(h,i,),样品中,i,组分的峰面积（峰高）。,4.,定量计算公式的选择,此法可省去测定相对校正因子的工作，特别适用于大批量样品的测定。若要获得很高精度的结果时，可加入数种内标物，以提高定量分析的精度。,i,=,i,s,A,i,(h,i,)/A,s,(h,s,),（,i,=f,i,/f,s,）,式中，,i,待测组分（,i,）对内标物（,s,）的质量相对校正因子，可由实验测定或由文献值进行计算得到。,三、内标法,四、标准加入法,4.,定量计算公式的选择,标准加入法实质上是一种特殊的内标法，是在选不到合适的内标物时，以预测组分的纯物质为内标物，加入到待测样品中。,i,=,i,/,A,i,(h,i,)/A,i,(h,i,)-1,标准加入法中加入的预测组分（,i,）还可以作为另一组分（,j,）的含量。,j,=,A,j,(h,j,)/A,i,(h,i,),(,i,+,i,),式中，,组分,j,对组分,i,的相对校正因子；,A,j,(h,j,),组分,j,的峰面积（峰高）。,参考文献：,1,于世林,.,高效液相色谱方法及应用,M.,化学工业出版社,2005,4,2,张庆合,.,高效液相色谱实用手册,M.,化学工业出版社,2005,4,3,傅若农,.,色谱分析概论,M.,化学工业出版社,2000,1,4,张祥民,.,现代色谱分析,M.,复旦大学出版社，,2004,，,7,5,汪正范,.,色谱定性与定量,M.,化学工业出版社,2007,9,谢谢！,