第十三章 聚合酶链式反应(PCR).ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第十三章 聚合酶链式反应,(PCR),1,第一节 聚合酶链式反应,(PCR),PCR,是一种选择性扩增目的,DNA,(,或,RNA),的方法,.,2,一、,PCR,的基本原理和反应过程,1.PCR,的基本原理,原理,:,DNA,的变性、复性、半保留复制。,2.,PCR,的基本过程,基本过程,:,变性、退火、延伸三个基本反应步骤,3,变性,:DNA,高温变性，加热至,90,95,并维持一定时间，使双链,DNA,氢键断裂，解离成为单链，成为模板。,4,退火,:,变性,DNA,分子在温度降至适当时，重新形成双螺旋结构，该过程称为退火。在,PCR,过程中,当温度降至,45-55,时，单链,DNA,模板与人工合成的引物,DNA,结合,.,5,延伸,:,当,PCR,温度升至,70-75,度时，在加入的,DNA,聚合酶的催化作用下，体系中的,4,种游离的,dNTP,遵循碱基互补原则，按引物,53,方向合成模板,DNA,新的互补链。,6,高温变性,低温复性,适温延伸,95,55,72,7,8,整个,PCR,过程一般需要,30,次循环，从理论上讲能将目的,DNA,扩增,2,30,倍，约为,10,9,倍,.PCR,的平均扩增效率约为,75%,85,，完成一次循环需,2-3,分钟，经过,n,次循环后扩增的倍数约为,(1+75%),n,。,2-3,小时就能将目的,DNA,扩增几百万倍。,9,二、,PCR,的特点,特异性强 扩增的目的,DNA,，可以是,DNA,混合物中的某个特定分子，也可以是,DNA,大分子的某段特定序列,10,灵敏度高 应用,PCR,技术可以对一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中得到的,DNA,片段进行扩增、分析和鉴定。在病毒学检测中，,PCR,的灵敏度可达,3,个,RFU(,空斑形成单位,),；在细菌学检测中，,PCR,的最小检出率为,3,个细菌。,11,简便快捷,PCR,技术使用的是耐高温的,Taq,DNA,聚合酶，且已有各种,PCR,扩增仪供应。只需将反应液一次性地加好，然后设置一定程序，即可在,DNA,扩增仪中进行,变性,-,退火,-,延伸,反应，一般在,2-4,小时就能完成,12,对样品要求低 病毒 细菌 培养细胞，其,DNA,或,RNA,粗制品均可作为扩增模板。扩增样品可以是新鲜的，也可以是陈旧的；可直接用临床标本进行扩增，如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等。,13,三、,PCR,的体系组成和反应条件,（一）体系组成,:,模板（目的,DNA(RNA),）,耐热,DNA,聚合酶,寡核苷酸引物,原料,:,dNTP,缓冲液和,MgCl,2,反应体积一般选用,50-100l,14,1.,引物,:,决定,PCR,的特异性,PCR,产物的特异性取决于引物与模板,DNA,结合的特异性。故引物设计在,PCR,技术中十分重要。,PCR,扩增的是一个双链目的,DNA,，所以需要两条引物，分别与目的,DNA,的两股链的,3,端互补,。,引物合成方法,:,化学的方法合成，,原则如下：,15,引物长度合适,:,不少于,15,个核苷酸，一般为,15,30,个核苷酸,引物碱基组成与分布随机,:ATCG,随机分布,避免,5,个以上嘌呤或嘧啶串联排列,C+G,含量以,40%-60%,为宜,16,两条引物的碱基组成一致,:,碱基组成影响退火温度，两条引物的碱基组成一致，可以确保适用相同的退火温度,引物内部避免出现二级结构,:,引物自身互补序列不能超过,3bp,，以防止形成茎环结构,17,引物之间不应互补,:,特别是,3,端的互补，否则会形成引物二聚体,引物,3,端 碱基要求严格配对,:,特别是最末及倒数第二个碱基,以避免因末端碱基不配对而导致,PCR,失败,18,引物的,5,端可以修饰,:,引物,5,端不互补不影响,PCR,，可以修饰，包括加接限制酶识别序列或密码子序列，引入突变位点或末端标记,引物应严格特异,:,为防止非特异性扩增，引物与样品中的其他序列应无明显同源性，一般同源性不超过,70%,。,19,引物量合适在,PCR,体系中，每条引物的浓度应为,0.1-1mol,或,10-100pmol,。引物浓度过高会引起错配和增加引物之间形成二聚体的机会，发生非特异性扩增。,引物质量好,:,需要纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳法或反向高压液向层析法。,20,酶及其浓度,Taq,DNA,聚合酶,是从水生栖热菌,(,Thermus,aquaticus,，,Taq),分离出来的，故,Taq,DNA,聚合酶有良好的热稳定性，在,92.5,、,95,和,97.5,下的半衰期分别为,130,、,40,和,5,6,分钟。其催化,DNA,合成的活性可适应相当宽的温度范围，但在,75,80,活性最高，降低温度则扩增效率随之降低。,21,特点,：,以,DNA,为模板，,dNTP,为底物，与目的,DNA,结合的引物的,3,端为起点，遵循碱基互补原则，按,5,3,的方向合成,DNA,新链。,有,53,外切酶的活性，但无,35,外切酶的活性，所以没有校对功能，其错误率为,0.25%,，即扩增产物中每,400,个碱基可能出现一个错误掺入的碱基。,22,具有反转录酶活性，可直接用于从,RNA,扩增,cDNA,，使,RT-PCR,技术简化，但该活性依赖,Mg,2+,或,Mn,2+,。,具有类似末端转移酶的活性，可在新合成链的,3,端加上一个不依赖模板的核苷酸，而且优先加接,dATP,，利用这一性质可以构建载体,克隆带,dATP,尾的,PCR,产物。,23,浓度：,催化一典型的,PCR,所需酶量约为,2.5U(,指总反应体积为,100l,时,),，浓度过高可发生非特异性扩增，浓度过低则降低扩增效率。,24,dNTP,dNTP,是,PCR,的底物，其浓度、比例和质量与反应密切相关：浓度应根据靶序列的长度和组成确定，一般在,20-200mol/L,之间，并且,4,种,dNTP,的摩尔浓度要相等。,过高 反应速度 碱基错配率,过低 反应的准确性 扩增效率,25,待扩增样品,PCR,的样品可以是,DNA,或,RNA,如为,RNA,时，应先逆转录生成,cDNA,，然后再进行正常的,PCR,循环,病原体标本：如病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、立克次氏体等,临床标本：如细胞、血液、尿液、分泌物、羊水等,法医学标本：犯罪现场的血迹、精斑、毛发等,考古标本：,26,Mg,2+,浓度,Mg,2+,可以影响解链温度、退火温度、影响酶活性、产物的特异性、引物二聚体的形成等,一般在,0.2,2.5mmol/L,之间，常用,1.5mmol/L,。,27,组成,量,10,扩增缓冲液,10l,4,种,dNTP,混合物,各,200mol/L,引物,各,10-100pmol,模板,DNA,0.1-2g,Taq,DNA,聚合酶,2.5u,Mg,2+,1.5mmol/L,加双或三蒸水至,100l,PCR,体系组成,28,（二）反应条件,1.,反应温度与时间,变性温度与时间,：,95,、,30,秒钟或,97,、,15,秒钟（第一次变性,5,7,分钟）,退火温度与时间,：,45,55,，,30,60,秒钟,延伸温度与时间,：,70,75,，,30,60,秒钟（最后一次延伸延长,5,分钟）,29,Taq,DNA,聚合酶的活性受温度影响：在,70,80,时，每个酶分子每秒钟可催化延伸约,150,个核苷酸，在,70,时为,60,个核苷酸，在,55,时为,24,个核苷酸，高于,90,时几乎完全失活。,30,PCR,的延伸时间可以根据目的,DNA,的长度确定：,1kb,以内一般延伸,1,分钟，,3,4kb,需延伸,3,4,分钟，,10kb,需延伸,15,分钟。延伸时间过长会降低扩增特异性。如果模板浓度太低，延伸时间要稍长些,。,31,2.,缓冲液：提供,PCR,反应合适的酸碱度和某些离子（主要是,Mg,2+,）。常用,10,50mmol/L,Tris-HCl,(20,时，,pH=8.3,8.8,，,72,时,pH=7.2),缓冲液。,32,3.,循环次数,PCR,循环次数的设定主要取决于初始目的,DNA,的浓度。一般的循环次数选在,30,40,次之间。循环次数太少，产物的量不够多；循环次数越多，由于各种原因越容易发生错误掺入，从而降低扩增特异性。,33,原则是：在满足产量的前提下，应尽量减少循环次数。如果产量不够，可将产物适当稀释，再继续扩增。,34,四、,PCR,扩增产物的分析,凝胶电泳分析,凝胶电泳可帮助判断扩增产物的大小、检测扩增情况，从而对扩增产物进行鉴定,35,36,酶切分析,根据,PCR,产物中存在的限制性内切酶的识别位点，用相应的限制性内切酶切割，电泳分析酶切片段，对产物进行鉴定，靶基因分型，还能进行变异性研究。,37,分子杂交,分子杂交是即可检测,PCR,产物的特异性，也可检测,PCR,产物的碱基突变。包括,Southern,印迹法，斑点杂交，微孔板杂交法等,38,DNA,测序,测序是检测,PCR,产物特异性的最可靠方法。能对靶基因分型，还能进行变异性研究。,39,第二节,PCR,技术的发展,逆转录,PCR,逆转录,PCR(RT-PCR),是以,mRNA,为模板，由逆转录酶催化合,cDNA,，将,cDNA,通过,PCR,扩增，扩增产物再走凝胶电泳，通过分析电泳图谱可以鉴定,cDNA,的长度，,cDNA,的长度即为,mRNA,的长度，进而推断是否存在基因缺失或插入，以及,mRNA,加工过程是否异常。,40,如果对电泳图谱进行光密度扫描，还可以计算出相应的,mRNA,量。,RT-PCR,使微量,mRNA,的信息迅速扩增，大大提高了,mRNA,检测的灵敏度。,41,定量,PCR,应用定量,PCR,技术可以定量检测样品中目的,DNA,的拷贝数。通过测定,PCR,扩增产物的量推测出原始样品中目的,DNA,的拷贝数。,42,必须设立内参照。具体的方法是，将目的,DNA,和一个单拷贝对照,DNA,放在同一试管中进行,PCR,扩增；然后将扩增产物走电泳，使扩增的目的,DNA,和对照,DNA,分离，呈现两条区带；通过比较两区带的度，或测定两区带的放射性强度，即可推算出目的,DNA,的拷贝数。,43,定量,PCR,技术：竞争定量,PCR,实时荧光定量,PCR,定量,PCR,技术与逆转录结合，可以,检测,mRNA,的绝对含量,。,44,45,多重,PCR,被检基因太长,(2kb,以上,),存在多个位置的缺失和突变,方法：用,多对,引物同时扩增一份,DNA,样品的不同序列区域，每对引物所扩增产物长度不同，根据电泳结果判断是否存在某些基因片段得缺失或长度改变。这样一次反应就可以检测多个变异位点。,46,重组,PCR,研究基因结构与功能的关系，常需要突变基因结构，如碱基替代、缺失或插入等，以观察基因功能的改变。,通常的方法是用合成带突变的引物，复制完整的突变基因。,PCR,能使体外定点突变简便快捷，,PCR,参与的体外基因突变过程称为重组,PCR,，。,47,不对称,PCR,典型的,PCR,扩增产物是特异的双链,DNA,分子。如在反应体系中加入不同浓度（两条引物的浓度比一般为,50,100:1,）的两条引物即可获得特定的单链,DNA,，称为不对称,PCR,。,DNA,测序及基因诊断中常常需要大量单链,DNA,48,原位,PCR,将组织或细胞经过固定处理，使细胞膜具有一定的通性，然后在细胞内建立,PCR,体系，扩增细胞内的,DNA,或,RNA,靶序列，这一过程称为原位,PCR,可用于肿瘤发生学、胚胎学研究和病毒学检测。,49,反向,PCR,反向,PCR,技术是借助待扩增,DNA,内部的已知序列扩增其两侧的未知序列。,鉴定已知序列邻近的未知序列或,DNA,测序。,50,反向,PCR,示意图,51,第三节,PCR,技术的应用,一、,PCR,技术在分子生物学中的应用,PCR,克隆技术,PCR,技术用于基因克隆。如在引物,5,端加接限制性酶切位点，扩增产物,DNA,经酶切后带有粘性末端，可直接用于,DNA,克隆。,PCR,定点突变和基因融合 多重,PCR,DNA,测序,52,二、,PCR,技术在医学中的应用,感染性疾病病原体的检测,遗传性疾病的基因诊断,在恶性肿瘤诊断和治疗中的作用,53,三、,PCR,技术在法医学中的应用,法医学有时只能利用罪犯在现场留下的少量标本,(,血迹、精斑、毛发、分泌物或小块组织,),进行鉴定，这就增加了鉴定难度。可以通过,PCR,扩增检材，获得足够量的,DNA,，再结合其他技术，如,DNA,指纹技术、,RFLP,分析，可进行个体识别、亲子鉴定、性别鉴定等。,54,