分子生物学研究方法(下)核酸分子杂交技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子生物学研究方法 核酸分子杂交,第一节 概述,一、核酸分子杂交的概念,：,用已知的DNA或RNA片段来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补原则发生同源性结合，再经过显影或显色的方法，将结合核苷酸序列的位置或大小显示出来。,具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程,。,二、核酸分子杂交的基本原理,（一）DNA的变性,1.DNA的变性的概念,DNA分子由稳定的双螺旋结构松解,在某些理化因素作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双股螺旋或发夹结构打开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸变性。,DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。,2.引起,DNA的变性的因素：,（1）热变性：90-100，最常用,（2）酸碱变性：常采用碱变性,（3）化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等,化学键变化：维持双螺旋稳定的氢键和疏水键发生断裂，断裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的,化学结构变化：DNA变性改变了其空间结构，不涉及到其一级结构的改变,3.变性DNA的性质,溶液粘度降低,溶液旋光性发生改变,增色效应或高色效应,变性能导致DNA 的一些,理化性质,及,生物学性质,发生改变,变性DNA的性质（之一,）,（1）溶液粘度降低,DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以“柔软”而松散的无规则单股线性结构，DNA粘度因此而明显下降。,变性DNA的性质（之二,）,（2）溶液旋光性发生改变,变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构型发生改变，使DNA溶液的旋光性发生变化。,增色效应（二）,增色效应可以作为DNA变性的指标,不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性后，其260nm的吸光度值可增加40%以上，其它不同来源的DNA溶液的增值范围大多在2030%之间。,4.变性温度,（1）熔解温度（melting temperature，Tm）,热变性使DNA分子双链解开50%所需温度；或A,260,值达到最大值1/2时的温度，称为熔解温度。,增色效应与温度有十分密切的关系，这主要是变性温度取决于DNA自身的性质。,变性温度,（,2）特点,：,爆发式：热变性是在变性温度范围内突发的跃变过程，很像结晶达到熔点时的熔化现象，故名熔解温度。,狭窄性：变性温度范围很小。,变性温度（三）,（2）影响变性温度的因素：,不同来源DNA间的Tm存在差别，在溶剂相同的前提下，这种差别主要是由DNA本身下列两方面的性质所造成的：,1）DNA的均一性；,2）DNA的（G+C）含量。,1）DNA的均一性,有二种含义,A.DNA分子中碱基组成的均一性：,如人工合成的只含有一种碱基对的多核苷酸片段，与天然 DNA比较，其Tm值范围就较窄。因前者变性时氢链断裂几乎可“齐同”进行；,B.待测DNA样品组成的均一性：,如样品中只含有一种病毒DNA，其Tm,值范围较窄，若混有其它来源的DNA，则Tm值范围较宽。,2）DNA的（G+C）含量,在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于DNA分子中的（G+C）的含量。,（G+C）含量越高，G-C 碱基对越多，Tm值越高。因G-C碱基对具有3对氢键，而A-T碱基对只有2对氢键，DNA中（G+C）含量高显然更能增强结构的稳定性，破坏 G-C间氢键需比A-T 氢键付出更多的能量，故（G+C）含量高的DNA，其变性Tm也高。,Tm与（G+C）含量的关系,Tm 与DNA中（G+C）含量存在着密切相关性。,Tm与（G+C）含量（X）百分数的这种关系可用以下经验公式表示（DNA溶于0.2mol/L NaCl中）:,X%（G+C）=2.44（Tm-69.3）,核苷酸,20,Tm=4（G+C）+2（A+T）,5.DNA变性曲线（一）,以温度对DNA溶液的紫外吸光度作图，得到的典型DNA变性曲线呈S型。,S型曲线下方平坦段，表示DNA的氢键未被破坏，待加热到某一温度处时，次级键突发断开，DNA迅速解链，同时伴随吸光度急剧上升，此后因“无链可解”而出现温度效应丧失的上方平坦段。,DNA,变性曲线（二）,6.DNA的复性,（1）复性概念,：,指变性 DNA 在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。,热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”（annealing）。,DNA的复性不仅受温度影响，还受DNA自身特性等其它因素的影响。,DNA,复性曲线,（2）影响复性的因素,A.温度和时间,B.DNA浓度,C.DNA序列的复杂度,A.,温度和时间,变性DNA溶液在比Tm低25的温度下维持一段长时间，其吸光率会逐渐降低。将此DNA再加热，其变性曲线特征可以基本恢复到第一次变性曲线的图形。这表明复性与温度和时间有关,一般认为比Tm低25左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。,温度和时间（二）,复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温（如4以下），复性几乎是不可能的。,核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性（单链）状态。这说明降温时间太短以及温差大均不利于复性。,B.DNA,浓度,DNA,复性的第一步是两个单链分子间的相互作用“成核”。,“成核”速度与,DNA,浓度的平方成正比，,溶液中,DNA,分子越多，相互碰撞结合“成核”的机会越大。,C.DNA顺序的复杂性,简单顺序的DNA分子，如多聚（A）和多聚（T）这二种单链序列复性时，互补碱基的配对较易实现。,顺序复杂的DNA，如小牛DNA的非重复部分（一般以单拷贝存在于基因组中），这种复杂的特定序列要实现互补，显然要比上述简单序列困难得多。,7.Cot值,在核酸复性研究中，定义了一个Cot的术语，（Co为单链DNA的起始浓度，t是以秒为单位的时间）。,Cot表示：复性速度与DNA顺序复杂性的关系。,DNA复性曲线（Cot 曲线）,在探讨DNA顺序对复性速度的影响时，将温度、溶剂离子强度、核酸片段大小等其它影响因素均予以固定，以不同程度的核酸分子重缔合部分（在时间t时的复性率）取对数后对Cot作图，可以得到Cot曲线。,Cot曲线,Cot,l/2,：在标准条件下（一般为0.18mol/L阳离子浓度，400核苷酸的片段长度）测得的复性率达 50%时的Cot值。,Cot,l/2,与核苷酸对的复杂性成正比。,原核生物核酸分子，Cot,l/2,可代表基因组的大小及基因组中核苷酸对的复杂程度；,真核生物基因组中，因含有许多不同程度的重复序列（repetitive sequence），因此Cot曲线要比S曲线复杂。,8.核酸分子的复杂性,用非重复碱基对（bp）数表示核酸分子的复杂性。,如：多聚（A）的复杂性为1，重复的（ATGC）n组成的多聚体的复杂性为4，分子长度是10,5,核苷酸的非重复DNA序列的复杂性为10,5。,原核生物基因组均为非重复顺序，故以非重复核苷酸对表示的复杂性直接与基因组大小成正比。,真核生物基因组中的非重复片段也是如此。,核酸分子杂交,分子杂交（简称杂交，hybridization）是核酸研究中一项最基本的实验技术。,杂交的基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的 DNA（或RNA）片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子。（heteroduplex）,杂交双链可以在DNA与DNA链之间形成，也可在RNA与DNA链之间形成。,（二）杂 交,1、杂交的概念：,来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补可形成异源双螺旋，称为核酸分子杂交。,2.影响杂交的因素,1）核酸分子的浓度、长度和复杂性,核酸探针浓度大，复性快；分子量大，复性慢；复杂性高，配对难度大，复性慢。,2）温度：通常杂交温度在低于Tm20-25度温度下进行。,3）离子强度：高离子强度溶液中，其正离子可中和DNA链磷酸基团的负电荷，削除其间的静电斥力，有利于杂交分子的形成。,4）杂交液中的甲酰胺浓度：甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此，可降低核酸杂交的Tm。50%的甲酰胺可使Tm降低30度。,5）杂交条件的严谨性：,严谨性是指杂交反应体系中，避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格程度,。它主要与杂交反应的温度、离子强度和洗膜的温度有关。,（三）预杂交,为减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非特异性位点封闭。这一在杂交前的处理过程，称为预杂交。,常用于预杂交的封闭物有：,（1）变性的非特异性DNA：大多数采用鲑鱼精子DNA、小牛胸腺DNA（覆盖DNA）,（2）高分子化合物：如用聚蔗糖、小牛血清白蛋白和聚乙浠吡咯酮组成的Denhardt,封闭。,第二节 核酸探针,一、核酸探针的概念：,核酸探针是指带有放射性同位素、生物素或其他活性物质标记的某种特定的DNA或RNA片段，用于核酸杂交技术以检测待测样品中的靶序列。,二、核酸探针的类型：,1.寡核苷酸探针,是由实验者设计、经核苷酸合成仪人工合成的。较为常用的寡核苷酸探针长度是18-30bp。,优点：,（1）制备方便，可随设计需要自动合成；,（2）可识别靶序列内一个碱基的变化，非常适用于检测已知序列基因中的特定突变或检测在克隆化基因中通过定点诱变技术产生的特定突变。,（3）用新的酶促方法标记可得到高比活度的标记探针，适应于大多数杂交实验。,缺点：（1）杂交稳定性较差，因为探针短；,（2）反应条件严格：对温度、盐浓度等条件要求严格；,（3）操作难度大,（4）特异性差，灵敏度低（分子短，所带标记物少）。,2.双链探针,包括基因组,探针和cDNA探针。将基因组DNA或cDNA分离、标记后所形成的探针。,优点：,（1）杂交稳定性好，因为探针较长；,（2）特异性高；,缺点：,（1）容易发生自我复性，制约了探针与靶序列的进一步杂交。,3.单链探针,包括单链DNA,探针和RNA探针。将单链DNA或RNA标记后所形成的探针。,优点：,（1）不发生自我复性，灵敏性高（DNA探针）；,（2）制备简单，杂交体稳定性高，杂交率高；杂交后可用RNA酶消化未杂交的探针或用DNA酶1处理DNA，不需要再纯化，工艺简单（RNA探针）。,缺点：,（1）RNA容易被核酸酶降解。,三、探针的标记,1.常用的标记物,（1）核素标记物（同位素标记）：,32,P、,35,S、,3,H等；,（2）非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素等。,2.常用的探针标记方法,（1）缺口平移法(nick translation)；该方法是利用大肠杆菌DNA酶,所具有的内切核酸酶活性和DNA聚合酶,的5,3聚合和5,3,外,切核酸酶活性共同完成。,（2）随机引物法(random primer)：引物是指含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物（六核苷酸残基的引物）。,原理：是将待标记的DNA探针片段变性后，DNA聚合酶可在随机引物，沿着单链模板起始DNA的合成。由于寡核苷酸很短，而且序列不均一，可在模板的很多位置上杂交，故产生许多起始位点不同的拷贝。,（3）末端标记法：即在寡核苷酸链的5或3端通过酶促反应加上标记物，称为末端标记法。,（4）T4 DNA聚合酶标记法：,第三节 分子杂交的基本方法,核酸分子杂交的基本方法有：,一、固相杂交：,1.固相杂交的概念：结合于某种固相上的待测样品，与溶解在杂交液中的探针进行杂交，称为固相,杂交。,2.类型：,可分为膜上印迹杂交和细胞原位杂交。,1）膜上印迹杂交有可分为,（1）Southern 印迹法,（2）Northern 印迹法,（3）斑点印迹杂交,（4）Western 印迹法,（1）Southern 印迹杂交,1975年，英国Southern创建,DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。,Southern,杂交,(Southern bloting),的主要步骤,待测DNA样品的制备、酶切；,待测DNA样品的电泳分离-琼脂糖凝胶电泳,凝胶中DNA的变性：碱变性,Southern转膜：,硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜,毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法,进行Southern杂交。,杂交结果的检测,bp,1534,994,695,515,377,237,A B C M,（2）Northern,印迹杂交,(Northern bloting),检测RNA（主要是mRNA）的方法,与Southern杂交的不同,靶核酸：是RNA即它是将变性的RNA样品转移到支持物上，用标记的DNA或RNA探针对膜上的RNA进行杂交。,RNA电泳,转膜：不需变性,（3）斑点印迹杂交(dot bloting),将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上,优点：简单、快速、可同时检测多个样品。,（4）Western,杂交印迹法,(Western bloting),用于检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法。,主要步骤：,蛋白质样品的制备,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳,蛋白质的电转移：NC膜,靶蛋白的免疫学检测,靶蛋白于第一抗体（一抗）反应,与标记的第二抗体（酶标二抗）反应,显色反应：酶促反应,2）原位杂交,(in situ hybridization),（1）原位杂交的概念：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。,（2）,原位杂交的,特点：,（A）能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究；,（B）不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高；,（C）能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态。,（3）核酸原位杂交的基本步骤,细胞或组织的固定：载玻片,组织细胞杂交前的预处理,用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质,探针的选择和标记,杂交,杂交结果检测,二、液相杂交,核酸分子与核酸探针存在于杂交液中。,RNA酶保护分析法,核酸酶S1保护分析法,第四节 杂交体的检测,一、放射性同位素探针的检测,利用放射线在X线片的成影作用来检测杂交信号。,二、非放射性同位素探针的检测,1、偶联反应：将抗原抗体反应系统与显色体系偶联。,地高锌-DNA探针（抗原）+抗地高锌抗体+碱性磷酸酶+BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚酚磷酸盐）+NBT（四氮唑蓝）,2、显色反应,