生物化学-第14章-基因重组和基因工程(临本).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因重组和基因工程,Genetic Recombination and Genetic Engineering,第14章,掌握,：基因重组和基因工程的概念，细菌基因转移的接合作用、转化作用和转导作用，DNA克隆、限制性核酸内切酶、基因载体、cDNA文库、基因组DNA文库的概念，目的基因的来源，基因载体的类型，重组DNA技术的操作程序。,熟悉,：同源重组、特异位点的基因重组、转座重组的概念和基本过程，重组DNA技术的操作步骤。,了解,：重组DNA技术与医学的关系。,目 的 要 求,基因重组(gene recombination),是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。,基因工程(genetic engineering）,是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖和表达的过程。,基本概念,第一节自然界DNA重组和基因转移是经常发生的,DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature,DNA重组,位点特异的重组,(site-specific recombination),转座,重组,(transposition,recombination,),接合作用,(conjugation),转导作用,(transduction),同源重组(homologous recombination),转化作用,(transformation),片段重组体（见模型图右边产物）：,切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体中间含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本,DNA,。,拼接重组体（见模型图左边产物）：,切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本,DNA,。,内切酶,(recBCD),DNA侵扰,(recA),分支迁移,(recA),内切酶,(recBCD),DNA,连接酶,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,3,3,5,3,5,3,3,5,5,3,5,3,5,3,Holiday中间体,5,3,5,3,5,3,5,3,Holiday中间体,5,3,5,3,5,3,5,3,5,5,3,5,5,3,3,3,3,5,5,5,5,3,3,3,3,5,5,5,5,3,3,3,5,5,5,5,3,3,3,3,5,5,5,5,3,3,3,3,内切酶,(ruvC),内切酶,(ruvC),DNA,连接酶,DNA,连接酶,片段重组体,拼接重组体,Holliday intermediate的电镜照片,二、细菌的基因转移与重组,（一）,接合作用,当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为,接合作用(conjugation),。,有四种方式：,接合,、,转化,、,转导,和,细胞融合,。,可接合质粒如,F,因子,(F factor),细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。,质粒,（二）,转化作用,通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为,转化作用(transformation),。,例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。,（三）,转导作用,当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在,供体细胞与受体细胞之间的DNA转移,及基因重组即为转导作用(transduction),。,噬菌体的生活史,溶菌生长途径(,l,ysis pathway),溶源菌生长途径(lysogenic pathway),三、位点特异重组，即特异位点间发生的整合,位点特异重组,(site-specific recombination),是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。,噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的,长末端重复序列(long terminal repeat,LTR),。,（一）噬菌体DNA的整合,噬菌体的重组位点,att,P与大肠杆菌的重组位点,att,B之间有15bp核心序列相同，在整合酶（,Int）、,整合酶宿主因子（IHF）作用下发生整合；切除还需要Xis蛋白的参与。,（二）细菌的特异位点重组,沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。,沙门菌,H,片段倒位决定鞭毛相转变,hix,为反向重复序列，它们之间的,H,片段可在,Hin,控制下进行特异位点重组,(,倒位,),。,H,片段上有两个启动子,P,，其一驱动,hin,基因表达，另一正向时驱动,H2,和,rH1,基因表达，反向,(,倒位,),时,H2,和,rH1,不表达。,rH1,为,H1,的阻遏蛋白基因。,（三）免疫球蛋白基因的重排,免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链,(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其,中两个编码轻链(,和,)，一个编码重链。,轻链的基因片段：,重链的基因片段：,L V J C,L V,D,J C,重链,(,IgH,),基因的,V-D-J,重排和轻链,(,IgL,),基因的,V-J,重排均发生在特异位点上。在,V,片段的下游，,J,片段的上游以及,D,片段的两侧均存在保守的重组信号序列,(recombination signal sequence,RSS),。,此重排的重组酶基因,rag(recombination activating gene,),共有两个，分别产生蛋白质,RAG1,和,RAG2,。,CACAGTG(12/23)ACAAAAACC,GTGTCCAC TGTTTTTGG,重组信号序列,基因片段,V片段,J片段,RSS,RSS,间插DNA,OH,OH,V,J,单链切开,RAG1,RAG2,分子内转酯反应,单链切开,转移核苷酸,修复、连接,免疫球蛋白基因重排过程,四、转座重组,大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因从一个位置移动到另一位置。这些可移动的,DNA,序列包括插入序列和转座子。,由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为,转座,(,transposition,),。,插入序列,(insertion sequences,IS),组成：,IR,Transposase Gene,IR,（一）插入序列,二个反向重复,(inverted repeats,IR),序列,特有的正向重复序列,一个转座酶（,transposase,),编码基因,插入序列发生转座的形式：,保守性转座,(conservative transposition),复制性转座,(duplicative transposition),是插入序列从原位迁至新位。,是插入序列复制后，其中的一个复制本迁移至新位，另一个仍保留在原位。,插入序列的复制性转座,转座子,(,transposons,),从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。,IR,IR,Transposase Gene,有用基因,（二）转座子转座,转座子组成：,反向重复序列,转座酶编码基因,抗生素抗性等有用的基因,细菌的可流动性元件,A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示),B转座子Tn3：含有转座酶、-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因,C转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L,由转座子介导的转座,DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone,第二节,重组DNA技术,又称DNA克隆或分子克隆,重组DNA技术的发展史,1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。,1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。,1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。,1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，应用重组DNA技术制造医学上重要药物。,1980年 建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。,1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。,转基因猪进行人体器官移植,由于猪的器官，如,心脏与人的大小和活动能力类似，且猪的数量充足，容易繁殖,，可以充分满足临床需要，被医学界认为是人类器官移植的最佳提供者。,在人体器官移植手术中，灵长类猿猴的内脏普遍为人们所看好。但医学研究发现，猿猴身上的一些病毒对人类十分有害。,图：美国哈佛医学院的研究人员正将一头猪的肝脏取出来，为一位肝昏迷患者作替代肝脏。,通过基因工程手段，将猪的一个能引发人体排斥反应的基因-GT基因被关闭，使猪的器官成功移植到人体内的可能性大大增加。GT基因控制产生一种酶，这种酶使猪细胞表面产生一种蛋白质。当猪的器官移植进人体时，人类免疫系统能识别这种蛋白质，从而产生强烈的排异反应。,水母,利用乳腺生产药用蛋白的转基因羊,把白蛋白基因转入着乳腺中，这样，转入的白蛋白基因在羊乳腺中表达。通过其分泌不断产生白蛋白。通过分离、纯化，可以得到药用白蛋白，解决临床上病人对白蛋白的需求。,返回,把大鼠生长因子转入小鼠,得到巨大型的转基因小鼠。,转基因抗冻西红柿,transgenic anti-chilling tomatoes,转,鱼基因,番茄是将美洲拟蝶鱼的抗寒基因转入番茄的染色体上，该品种具有耐寒（植株的致死温度下降2）、高产（产量增加18以上）、优质（果实维生素C含量增加155）、抗病等优点。,延熟保鲜的转基因番茄转基因,（transgenic anti-ageing tomatoes）,通过反义技术，封闭乙烯合成酶（ACC）基因的表达，没有基因产物.,转抗虫基因Bt烟草植株的抗虫效果,Golden rice,（黄金米）,vitamin A=retinol-produced by animals in liver,milk and eggs,plants do not produce vitA-but some produce-carotene,a precursor for vitA including“yellow vegetables”,yellow endosperm corn and sorghum,in many developing countries,vitA deficiency is a major problem:,基因工程与药物研制,我国生产的部分基因工程疫苗和药物,许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。,微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。,胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，,100Kg,胰腺只能提取,4-5g,的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。,将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每,2000L,培养液就能产生,100g,胰岛素！使其价格降低了30%-50%!,环境保护,基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。,通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。,利用基因工程培育的“指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物,。,相关概念,DNA,克隆,工具酶,目的基因,基因载体,基本原理,及操作步骤,本节主要内容：,一、重组DNA技术相关概念,克隆,(clone):,来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化,(cloning),，,即无性繁殖。,（一）DNA克隆,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称,基因克隆或重组DNA(recombinant DNA),。,DNA,克隆,目的：,分离获得某一感兴趣的基因或,DNA,获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程,(genetic engineering),实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组,DNA,工艺学。,（二）工具酶,限制性核酸内切酶,DNA,聚合酶,逆转录酶,T,4,DNA,连接酶,多聚核苷酸激酶,碱性磷酸酶,末端转移酶,基因工程的手术刀！,重组DNA技术中常用的工具酶,工 具 酶,功 能,限制性核酸内切酶,识别特异序列，切割DNA,DNA连接酶,催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接,DNA聚合酶,合成双链,cDNA,分子或片段连接,缺口平移制作高比活探针,DNA,序列分析,填补,3,末端,Klenow片段,又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5,3,聚合、,3,5,外切活性，而无,5,3,外切活性。常用于,cDNA第二链合成，双链DNA 3,末端标记等,反转录酶,合成,cDNA,替代,DNA,聚合酶,I,进行填补，标记或,DNA,序列分析,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针,末端转移酶,在3羟基末端进行同质多聚物加尾,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基,限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease),限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)是,识别,DNA的特异序列,并在识别位点,切割,双链DNA的一类,内切酶,。存在细菌体内。,Bam,H,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,定义：,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,、（,基因工程技术中,常用型,）,分类：1800,+,种,作用：,例如：,EcoR I、BamH I,等就属于这类酶。,第一个字母,取自产生该酶的细菌属名，用,大写,；,第二、第三个字母,是该细菌的种名，用,小写,；,第四个字母代表株；,用罗马数字表示发现的先后次序。,命名：,H,in,d,属,系,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,流感嗜血杆菌,d,株的第三种酶,类酶识别序列特点 回文结构(palindrome),切口：,平端切口、粘端切口,GG,A,T,CC,CC,T,A,GG,Bam,H,GTC,CAG,G,CCTAG,GATCC,G,+,GGATCC,CCTAGG,Hin,d,GTCGAC,CAGCTG,GAC,CTG,+,平端切口,粘端切口,来源不同,的限制酶，但能,识别和切割同一位点,，这些酶称同功异源酶。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bst,同功异源酶：,有些限制性内切酶虽然识别,序列不完全相同,，但切割DNA后，,产生相同的粘性末端,，称为同尾酶。,Bam,H,Bg,l,GGATCC,CCTAGG,AGATCT,TCTAGA,G,C,CTAG,GATC,C,G,+,+,A,T,CTAG,GATC,T,A,同尾酶,名称 识别序列及切割位点,名称识别序列及切割点,切割后产生突出末端:,BamH,5G,GATCC.3,Bgl,5A,GATCT.3,EcoR,5G,AATTC.3,Hind,5A,AGCTT.3,Hpa,5C,CGG.3,Mbo,5,GATC.3,Nde,5GA,TATG.3,切割后产生3突出末端:,Apa,5GGGCC,C.3,Hae,5PuGCGC,Py.3,Kpn,5GGTAC,C.3,Pst,5CTGCA,G.3,Sph,5GCATG,C.3,切割后产生平末端:,Alu,5AG,CT.3,EcoR,5GAT,ATC.3,Hae,5GG,CC.3,Pvu,5CAG,CTG.3,Sma,5CCC,GGG.3,限制性内切核酸酶,（三）目的基因(target gene),cDNA,(complementary DNA),指经反转录合成的、与,RNA(,通常指,mRNA,或病毒,RNA),互补的单链,DNA,。以单链,cDNA,为模板、经聚合反应可合成双链,cDNA,。,基因组,DNA(genomic DNA),指代表一个细胞或生物体整套遗传信息,(,染色体及线粒体,),的所有,DNA,序列。,（四）基因载体,定义,为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达蛋白质所采用的一些,DNA,分子。,载体按功能分为,克隆载体,(cloning vector),表达载体,(expression vector),克隆载体,(cloning vector),为使插入的外源,DNA,序列被,扩增,而特意设计的载体称为克隆载体。,表达载体,(expression vector),为使插入的外源,DNA,序列可,转录翻译,成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,常用载体,质粒,DNA,噬菌体,DNA,病毒,DNA,载体的选择标准：,能,自主复制,；,具有两个以上的,遗传标记,，便于重组体的筛选和鉴定；,有,克隆位点,（外源,DNA,插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；,分子量小,，,以容纳较大的外源,DNA,。,1.质粒(plasmid):,特点:,能在宿主细胞内,自主复制,；,带有某些,遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,是存在于细菌染色体外的具有自主复制能力的小型环状双链,DNA,分子。,最早使用的质粒,DNA,是人工构建的,pBR322,，该质粒分子大小为,4.3kb,，带有,抗四环素和抗氨苄青霉素基因,，含,EcoR,，,BamH,，,Hind,等单一的限制酶切位点。,2.噬菌体,(bacteriophage，phage),噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌中并能溶解细菌细胞，故称为噬菌体。,噬菌体由头和尾构成，感染时尾管将基因组,DNA,注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。,具有,溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。,噬菌体,DNA,改造系统,gt,系列（插入型载体，适用,cDNA,克隆）,EMBL,系列（置换型载体，适用基因组克隆）,M13,噬菌体,DNA,改造系统（含,lacZ,基因）,M13mp,系列,pUC,系列,由噬菌体的,cos,区与,pBR322,质粒组合的杂种载体。粘粒可克隆29-,45kb,的大片段，常用作建立真核基因组文库的载体。,粘粒,(,cosmid,),3.病毒,（virus）,病毒载体更多用于真核表达系统，如腺病毒，腺病毒相关病毒、痘病毒，逆转录病毒，猴空泡病毒等。,酵母人工染色体,(yeast artificial chromosome,YAC),细菌人工染色体,(bacterial artificial chromosome,BAC),4.其他,二、重组DNA技术基本原理,1.,目的基因的,获取,2.,克隆载体的,选择和构建,3.,外源基因与载体的,连接,4.,重组DNA,导入,受体细胞,5.,重组体的,筛选,6.,克隆基因的,表达,以,质,粒,为,载,体,的,DNA,克,隆,过,程,（一）目的基因的获取,化学合成法,要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。,基因组,DNA,文库,(,genomic DNA library),cDNA,文库,(cDNA library),聚合酶链反应,(PCR),化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库,存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,从基因组,DNA,文库获取目的基因,限制酶切位点,限制酶消化,除去中间片段,cos L,R cos,cos L,左臂,R cos,右臂,真核生物染,色体DNA,限制酶部分消化,外源DNA与载体DNA混合,连接反应,体外包装,用重组噬菌体,感染大肠杆菌,20 Kb DNA 片段,cos L,R cos,20 Kb 外源 DNA 片段,基因文库,用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库,将mRNA逆转录合成cDNA，再与载体连接成重组DNA，将其引入宿主细胞并进行扩增，所得分子克隆的混合体称为cDNA文库。,从,cDNA,文库获取目的基因,mRNA,cDNA,双链cDNA,重组DNA分子,cDNA文库,反转录酶,载体,受体菌,复制,从cDNA文库获取目的基因,逆转录酶,A A A A,T T T T,AAAA,SI核酸酶,DNA聚合酶,碱水解,T T T T,（二）克隆载体的选择和构建,目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。,（三）外源基因与载体的连接,粘性末端连接,方式：,(1)同一限制酶切位点连接,(2)不同限制酶切位点连接,配伍末端连接,非配伍末端连接,Bam,H,切割反应,GGATCC,CCTAGG,T4,DNA,连接酶,15,C,GATCC,G,G,CCTAG,+,载体,DNA,用,Bam,H,切割,目的基因,用,Bam,H,切割,重组体,载体自连,目的基因自连,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,Eco,R,切割位点,Bg,l,切割位点,+,Eco,R+,Bg,l,双酶切,Eco,R+,Bg,l,双酶切,T4,DNA,连接酶,15,C,重组体,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,2.平端连接,限制性内切酶切割产生的平端,粘端补齐或切平形成的平端,适用于：,目的基因,载体,限制性内切酶,限制性内切酶,T4 DNA连接酶,15C,重组体,载体自连,目的基因,自连,在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,3.同聚物加尾连接,5,3,3,5,载体DNA,5,3,3,5,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,5,3,3,5,5,3,T(T),n,T,T(T),n,T,3,5,5,3,3,5,3,A(A),n,A,A(A),n,A,3,5,-核酸外切酶,-核酸外切酶,末端转移酶,+,dATP,末端转移酶,+,dTTP,T(T),n,T,A(A),n,A,A(A),n,A,T(T),n,T,T4,DNA连接酶,15C,重组体,5,由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,4.人工接头(linker)连接,人工接头及其应用,CCGAATTCG,GGCTTAAGC,5,-,3-,Eco,R,Eco,R,Eco,R,Eco,R,受体菌条件：,安全宿主菌,限制酶和重组酶缺陷,处于感受态,(competent),导入方式：,转化,(transformation),转染,(,transfection,),感染,(infection),（四）重组DNA导入受体菌,1、显微注射法(,Microinjection technique,),在显微镜下，用一根极细的玻璃针（直径1-2微米）直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。用这种方法生产的动物约有,10%,是整合外源基因的转基因动物。,2、电穿孔法,在高压电场的短暂作用下，细胞膜上可出现可逆的孔洞，外源DNA可通过此孔洞进入胞内。,方法适应不同细胞如细菌、酵母、植物及动物细胞。需电穿孔仪。,3、DNA-磷酸钙共沉淀法,将DNA与CaCl溶液混合，再缓慢滴加入含有磷酸的HEPES溶液中，形成DNA-磷酸钙共沉淀颗粒。,小心地将颗粒加入到培养的靶细胞表面，保温数小时后，使DNA被靶细胞摄取。,更换培养液使外源DNA在细胞中表达，筛选转化细胞或分析外源基因的表达量。,4、DEAE-右旋糖苷法,该法先用来促进病毒DNA导入，后来发展为一种哺乳动物细胞的基因转移方法。,方法：用外源DNA和DEAE-右旋糖酶的混合物处理细胞。,通常只用于克隆化基因的瞬间表达，不用于细胞的稳定转化。它对BSC-1，CV-1和COS细胞转染较好，因此应用上有限制。,5、逆转录病毒载体,逆转录病毒是一种RNA病毒，基因大小为3-10kb。不同于其它病毒，它具有二倍体基因，即含有两个相同的RNA分子，有典型的真核mRNA结构（包括帽子和尾巴）。,1.直接选择法,(1)抗药性标记选择,(2)标志补救(marker rescue),(3)分子杂交法:原位杂交、Southern印迹等。,2.免疫学方法,如免疫化学方法及酶免检测分析等,（五）重组体的筛选,(插入失活法),抗药性标记选择,带有双抗生素的质粒自身环化在两种抗生素培养基上都生长，DNA重组体只能在其中一种抗生素培养基上生,长。,组氨酸缺陷,型大肠杆菌,无组氨酸,的培养基,酵母咪唑甘油磷,酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,互补,原理筛选重组体,pUC18,如果无外源基因插入：,则质粒,lac,Z,基因正常表达和宿主菌的,lac,Z,基因互补，产生有活性的 半乳糖苷酶，经IPTG诱导后，分解X-gal底物，产生,blue clony。,如果有外源基因插入：,则质粒编码的,lac,Z基因失活、菌体不可能互补产生,半乳糖苷酶，产生,white clony,。,原位杂交,Southern印迹,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,免疫学方法,重组DNA技术操作过程可形象归纳为：,小结,分,分离目的基因,切,限制酶切目的基因与载体,接,拼接重组体,转,转入受体细胞,筛,筛选重组体,重组DNA技术操作的主要步骤,载体,质,粒,噬菌体,病毒,目的基因（外源基因）,基因组,DNA,cDNA,人工合成,PCR,产物,限制酶消化,开环载体DNA,目的基因,连接酶,重组体,转化,体外包装，转染,带重组体的宿主,筛选,表型筛选,酶切电泳鉴定,菌落原位杂交,表达体系的建立：,表达载体的构建,受体细胞的建立,表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,标准：,选择标志 强启动子,翻译调控序列 多接头克隆位点,E.coli,表达体系的不足：,不宜表达真核基因组,DNA,；,不能加工表达的真核蛋白质；,表达的蛋白质常形成不溶性包涵体；,很难表达大量可溶性蛋白。,1.原核表达体系(E.coli表达体系最常用),大鼠胰岛素原cDNA,的表达和分泌,优点：,可表达克隆的,cDNA,及真核基因组,DNA,可适当修饰表达的蛋白质,表达产物分区域积累,缺点：,操作技术难、费时、经济,转染,将表达载体导入真核细胞的,方法：,磷酸钙转染,DEAE葡聚糖介导转染,电穿孔,脂质体转染,显微注射,2.真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞）,表达载体pFASTBACI 的物理图谱,表达载体YEpI PT的物理图谱,第三节,重组DNA技术与医学,的关系非常密切并前景远大,DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective,一、疾病基因的发现与克隆,根据克隆基因的定位和其性质研究所提供的线索，而认识疾病的分子机制。,疾病基因发现的两个典型例子,:,脆性X综合征,Kallmann综合征,二、生物制药,利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为,21,世纪的支柱产业。,美国,Eli Lilly,（礼来）公司于,1982,年首先利用重组,DNA,技术合成人胰岛素并投放市场。迄今为止，已有,50,多种基因工程药物上市产生了巨大社会效益和经济效益。,重组DNA医药产品,产 品,功 能,组织胞浆素原激活剂,抗凝,血液因子VIII,促进凝血,颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子,剌激白细胞生成,促红细胞生成素,剌激白细胞生成,生长因子(bFGF,EGF),刺激细胞生长与分化,生长素,治疗侏儒症,胰岛素,治疗糖尿病,干扰素(,1b,2a,2b,),抗病毒感染及某些肿瘤,白细胞介素,激活、剌激各类白细胞,超氧化物歧化酶,抗组织损伤,单克隆抗体,利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗,乙肝疫苗(CHO,酵母),预防乙肝,口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗,预防霍乱,基因诊断,(genetic diagnosis),是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。,又称DNA诊断。,三、基因诊断与治疗,（一）基因诊断的概念,能正确扩增靶基因；,能准确区分单个碱基的差别；,本底或噪声低，不干扰,DNA,的鉴定,;,便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。,标准：,（二）基因治疗的概念,定义,基因治疗,(gene therapy),是向功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其缺陷，从而达到治疗的目的。,方式,体细胞基因治疗,(,somatic cell gene therapy,),性细胞基因治疗,(,germ line gene therapy,),1.产前诊断,2.携带者测试,3.症候前诊断,4.遗传病易感性,四、遗传疾病的预防,思考题,何为同源重组,其特点是什么,?,holliday,中间体是什么,?,什么是接合作用,(conjugation),、转化作用（,transformation,）、转导（,transduction,）,何为转座,?,常见的两种转座子是什么,?,组成上有什么特点？,什么是基因工程,(genetic engineering),基因工程包括哪些基因步骤？,基因工程的手术刀,-,限制性核酸内切酶在识别序列和切割上有什么特点？,目的基因获得的方法有哪些？,作为基因工程的载体应具有哪些特点,?,8.列举常用的基因工程工具酶的特性和用途。,9.叙述常用的基因工程载体的种类、特点和用途。,10.怎样能在大肠杆菌中获得真核基因的表达产物？,