课题3-分解纤维素的微生物的分离-(13).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第六级,第七级,第八级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,纤维素生物燃料：,最有希望替代石油能源,第二代生物燃料主要,以纤维素质材料,为原料，如富含纤维素、生长迅速的草本植物。,可转化为草油的,原料有很多,，从木材废料（锯木屑、木质建筑残片）到农业废弃物,（玉米秸秆、小麦茎秆），再到,“,能源作物,”,。,这些原料作物,耕作成本低,（与每桶石油有等价能效的草油为10到40美元）、量大，具备与60美元/桶的原油竞价的能力。,更关键的是，这些作物的种植生产,不会干扰和危及粮食生产,。,纤维素：,棉花,是自然界中纤维素含量最高的天然产物；,纤维素是地球上含量最丰富的,多糖类,物质，植物每年产生的纤维素超过,70,亿吨；分布植物的根、茎、叶中；,分解纤维素的微生物的分离,能分解纤维素的微生物，有各种细菌、真菌和少数放线菌。,纤维素,纤维素酶,组成,分布,作用,C,1,酶、,C,X,酶,葡萄糖苷酶,纤维二糖,葡萄糖,纤维素,由,葡萄糖,相连而成的,高分子,化合物,由,C,1,酶、,C,X,酶,和,葡萄糖苷酶,组成的复合酶,植物的,根、茎、叶,等器官，木材、作物秸秆等,某些微生物,与果胶,构成植物的细胞壁,，,用于纺织业、造纸业,，食品中的,膳食纤维具有通便清扫的作用,纤维素酶能水解纤维素,，,一,.,纤维素和纤维素酶,下列生物能分解纤维素的是（）,人,兔,牛,蘑菇,纤维杆菌,A.B.,C.D.,C,取二支,20mL,的试管,小实验：纤维素酶分解纤维素的实验,各加入一张滤纸条,分别加入,pH4.8,，物质量为,0.1mol/L,的醋酸醋酸钠缓冲液,11ml,和,10ml,甲 乙,在乙试管中加入,1mL,纤维素酶,两支试管固定在锥形瓶中，放在,140r/min,的摇床上振荡,1h,结果：乙试管的滤纸条消失,讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的 作用是什么？,本实验的自变量是,纤维素酶的有无,自变量的操纵方法是：在,一支试管中添加适量（,1mL,）的纤维素酶溶液,，在,另一支试管不添加纤维素酶,，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的,pH,。,实验分析：P,27,的小实验中的自变量是什么？,二,.,纤维素分解菌的筛选,1.,纤维素分解菌的筛选方法,2.,纤维素分解菌的筛选方法的原理,刚果红染色法,：,这种方法能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选,。,即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。,1、实验流程图：,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布在鉴别纤,维素分解菌的培养基上,筛选产生透,明圈的菌落,三,.,实验操作,分布环境,富含纤维素的环境中,2,、注意事项,生物与环境的互相依存关系,，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从,这种土壤中获得目的菌的几率要高,于普通环境。,原因,【资料一】土壤取样,实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。,讨论,:,如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？,将滤纸埋在土壤中,能使纤维素分解菌相对集中,，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一,般应将滤纸埋于深约,10cm,左右的腐殖土壤中,。,【资料二】选择培养,1,、选择培养的目的：,增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物,2,、制备选择培养基：,培养基成分分析,培养基组成,提供主要的营养物质,纤维素粉,5g,碳源（能源）,NaNO,3,1g,氮源、无机盐,KCl 0.5g,Na,2,HPO,4,7H,2,O 1.2g,KH,2,PO,4,0.9g MgSO,4,7H,2,O 0.5g,无机盐,酵母膏,0.5g,生长因子、氮源、碳源（极少）,水解酵素,0.5g,氮素、生长因子,溶解后，蒸馏水定容至,1000mL,水,课本问题：,右边的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？,这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？,你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用,液体培养基，原因是配方中无凝固剂,有选择作用，本配方中的碳源是纤维素（粉），所以能分解纤维素的 微生物可以大量繁殖,自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。,按照课题,1,的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释,10,1,10,7,倍。,10,1,10,2,10,3,10,4,10,5,10,6,【资料三】梯度稀释,1,、制备鉴别培养基,:,【资料四】将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,2,、涂布平板：将稀释度为,10,4,10,6,的菌悬液各取,0.1ml,涂布在培养基上，,30,37,倒置培养,鉴别纤维素分解菌的培养基配方,CMC-Na,酵母膏,KH,2,PO,4,琼脂,土豆汁,5,10g,1g,0.25g,15g,100mL,将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到,1 000mL,培养基组成分,提供的主要营养物质,CMC-Na 510g,碳源,酵母膏,1g,碳源、氮源、生长因子,KH,2,PO,4,0.25g,无机盐,土豆汁,100mL,碳源,琼脂,15g,凝固剂,上述物质溶解后，加蒸馏水定容至,1000mL,水,鉴别纤维素分解菌的培养基,(,水溶性羧甲基纤维素钠,),参照课本,刚果红染色法,，挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落,【资料五】挑选产生透明圈的菌落,方法一：先,，,再加入刚果红进行颜色反应。,方法二：在,时就加入刚果红。,培养微生物,倒平板,方法一加入中,NaCl,溶液的作用？,漂洗作用,，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。,思考2,思考1,这两种方法各有哪些优点与不足？,染色法,优点,缺点,方法一,方法二,颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用,1、操作繁琐,2、刚果红会使菌落之间发生混杂,操作简便，不存在菌落混杂问题,1.,产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈,2.,有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,在,产生明显的透明圈,的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在,30,0,C,37,0,C,培养，可获得,纯化培养,。,【资料六】纯化培养,（二）选择培养的操作方法,（一）本课题涉及的生物技术主要有：,培养基的配制、无菌操作技术、稀释涂布平板法、选择培养基的作用、土壤取样等。,将土样加入装有,30 mL,_,的锥形瓶中，将锥形瓶固定在,_,上，在一定温度下振荡培养,1,2 d,，直至培养液变,_,，也可重复选择培养。,选择培养基,摇床,混浊,四,.,操作提示,为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？,在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而,那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制,，因此可以起到“浓缩”的作用。,（,一）如何了解培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落,（二）分离的结果是否一致,设置空白对照，若对照的培养基在培养过程中无菌落生长则说明培养基制作合格。,如果观察到产生明显透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。,如果不同，分析产生不同结果的原因。,五,.,结果分析与评价,为了确定分离得到的是,纤维素分解菌,，还需要进行,_,实验。,纤维素酶的发酵方法有,_,发酵和,_,发酵。,纤维素酶测定方法,是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的,_,含量进行定量测定。,发酵产纤维素酶,液体,固体,葡萄糖,六,.,课题延伸,比较项目,分解尿素的细菌,纤维素分解菌,选,择,培养,基,原理,培养基类型,目的,将细菌涂布在只有,尿素做氮源的选择,培养基上,将细菌涂布在只有,纤维素粉做碳源的,选择培养基上,固体培养基,液体培养基,筛选菌株,选择培养,课后比较,：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？,比较,项目,分解尿素的细菌,纤维素分解菌,鉴,定,培养基,原理,现象,方法,在细菌分解尿素的化学反应,中，细菌合成的脲酶将尿素,分解成了氨，氨会使培养基,的碱性增强，,pH,升高。在培,养基中加入酚红指示剂，如,果,pH,升高指示剂会变红,刚果红可以与纤维素形成,红色复合物，当纤维素被,纤维素酶催化分解后红色,复合物无法形成，培养基,上就会出现以纤维素分解,菌为中心的透明圈,观察菌落周围是否有着色的,环带出现来鉴定尿素分解菌,观察菌落周围是否出现,透明圈来筛选纤维素分解菌,脲酶检测法,刚果红染色法,课题2和课题3的鉴别方法有何区别？,分解,纤维素的微生物的分离,纤维素酶,种类、作用、催化活力,刚果红染色,筛选原理,实验设计,土壤取样,选择培养,涂布培养,梯度稀释,前置染色法,后置染色法,富含纤维素土壤,增大分解菌含量,染色鉴别,分离出分解菌,课堂总结,酵母膏实际上是膏状的酵母抽提物，酵母抽提物是国家行业标准的规定名称。,酵母抽提物以酵母为原料，采用自溶法或加酶水解法工艺，经分离、脱色（或精制浓缩、喷雾干燥）而成的，,含氨基酸、肽、多肽及酵母细胞水溶性成分的产品,。包含粉状、与膏状的产品。,酵母膏可以有食品调味与生物发酵培养基两大类用途。在生物发酵行业应用还有一种习惯叫法是酵母浸膏。,【酵母膏】,微生物培养基的氨基酸氮源，由酪蛋白水解得到，常见商品名称为水解酪素或酶解酪素。,酪蛋白水解后富含,21,种氨基酸，氨基酸种类齐全,。因此常用于制备培养基。,【酪素】,