天然产物分离纯化方法专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1、冷却、过滤,浓缩后过滤、冷却、过滤,特点：适应于溶解度对温度敏感物质，操作轻易，成本低，普通用于杂质去除,2、改变溶剂极性（,通常浓缩到一定程度后进行）,水,提,醇沉法,（多糖、蛋白质等水溶性物质沉淀）,醇,提,水沉法,（除树脂、叶绿素等水不溶性杂质）,醇,提,醚沉法或醇,提,丙酮沉法,（使苷类成份沉淀，而脂溶性树脂等杂质则存留在母液中）。,特点：效果显著，但分离不够完全；需考虑溶剂回收问题；若是用乙醇溶液提取，则浓缩到一定程度，,树脂、叶绿素等水不溶性杂质会析出,一、初步分离方法,天然产物分离纯化方法专家讲座,第1页,3、改变水溶液,pH,值,酸提碱沉法，碱提酸沉法,等电点法,特点：用于酸性、碱性物质及蛋白质，操作成本很低，需考虑,pH,值对产品影响，对于极性大物质沉淀不完全,例：,芦丁提取,槐米加约6倍水，煮沸，在搅拌条件下缓缓加入石灰乳至,pH8-9，,在此条件下微沸20-30,min，,趁热抽虑，在60-70条件下，用浓盐酸将滤液调至,pH5，,静置二十四小时，抽虑，水洗沉淀至中性，得初品。,天然产物分离纯化方法专家讲座,第2页,4、添加沉淀剂,酸性或碱性化合物还可经过加入某种沉淀试剂使之生成水不溶性盐类沉淀等析出。以下表：,要求：对所需成份，沉淀应是可逆，而且不能有重金属残留。,特点：沉淀比较完全，但需经过特殊方法使其恢复，有重金属残留,普通盐析：氯化钠、硫酸铵、氯化钾、硫酸钠、硫酸镁,特点：可逆，但沉淀效果不是很好,天然产物分离纯化方法专家讲座,第3页,例1：,见书,P62：,益母草碱纯化,例2：,三颗针根粉用稀酸浸泡，稀酸液加氯化钠近饱和即析出小檗碱盐酸盐,5、,结晶及重结晶法,初步纯化阶段只适合用于目标组分含量很高情况,天然产物分离纯化方法专家讲座,第4页,6、浸膏（浓缩液）分别用极性从小到大溶剂萃取,（1）原理：,相同相溶,（2）影响原因：,分配系数,（3）特点：,需屡次萃取，且不完全,有利于后续分离及活性跟踪,天然产物分离纯化方法专家讲座,第5页,（,4,）各种萃取方法：,简单萃取：利用分液漏斗进行两相溶剂萃取。,逆流分配法（,CCD,）：,又称逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法，与两相溶剂逆流萃取法原理一致，对于分离含有非常相同性质混合物效果很好。,微分萃取,P46,液滴逆流分配法（,DCCC,）：,本法必须选取能生成液滴溶剂系统，且对高分子化合物分离效果较差，处理样品量小，并要有一定设备，操作较繁琐。,其它,P47,（5）注意事项,萃取剂用量,乳化,天然产物分离纯化方法专家讲座,第6页,7、,pH,梯度萃取,原理：,带电荷分子（离子）极性大，易溶于水，在极性有机溶剂中溶解度降低，难溶于弱极性及非极性有机溶剂。中性分子则相反。,天然产物分离纯化方法专家讲座,第7页,8、利用离子交换剂对水提取物进行粗分（可不经过浓缩）,（1）基本原理,1）离子交换剂组成,高分子聚合物基质,：高聚物，惰性，水不溶性，作为骨架，如,苯乙烯和二乙烯苯共聚物,电荷基团,：与骨架经过共价键连接，不能移动,平衡离子（反离子）,：结合于电荷基团上相反离子，可与溶液中荷电同离子可逆交换,2）结构特点,多孔弹性颗粒,天然产物分离纯化方法专家讲座,第8页,3）离子交换色谱定义,离子交换色谱,(,ion exchange chromatography,，,IEC)：,利用离子交换剂作为,固定相,，依据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力差异进行溶质分离方法。,天然产物分离纯化方法专家讲座,第9页,（2）离子交换剂分类及选择,1）按骨架分类,合成树脂骨架,多孔弹性颗粒,苯乙烯衍生物、苯乙烯和二乙烯苯共聚，树脂颗粒孔径小，机械强度大，可承受高流速，易引发蛋白质变性，惯用于分离小分子,多糖类骨架,离子交换树脂,经多糖羟基化学修饰而来，如纤维素、葡聚糖、琼脂糖，机械强度小，用于蛋白质等亲水性物质分离,2）,按,反离子分类,阳离子交换剂：强酸型、中等酸型、若酸型,阴离子交换剂：强碱型、中等碱型、若碱型,3）,离子交换发生趋势及使用标准,：,趋势：离子强弱、离子亲和性、离子浓度,使用标准：,强与弱,天然产物分离纯化方法专家讲座,第10页,1),预处理,:,清水浸泡,80%90%,乙醇浸泡二十四小时,4050,热水浸泡2小时、洗涤数次,4,倍树脂量2,mol/L,盐酸浸泡2小时，水洗直中性,4,倍树脂量2,mol/L,氢氧化钠浸泡2小时，水洗直中性，抽干备用，,转变为所需类型,。,（3）离子交换操作,2）,再生、转型,强酸、强碱树脂可用酸、碱、氯化钠等再生、转型。,弱酸、弱碱树脂只能用酸或碱处理。,树脂“毒化”后可用4050强酸、强碱浸泡处理。,天然产物分离纯化方法专家讲座,第11页,3）,保留,阴凉处。短期可存放于1,mol/L,盐酸或氢氧化钠溶液中。长久存放可加入适量防腐剂封存。树脂长霉可用1%甲醛浸泡1小时后进行再生处理。,4）装柱,粗细分布均匀、无气泡、无断层。,5）上样,初分离可到达饱和状态，细分离上样量为树脂总吸附量1%-5%,6）清洗,除杂,7）,洗脱,增加洗脱液离子强度或改变,pH,值。,阶段洗脱法，梯度洗脱法。,天然产物分离纯化方法专家讲座,第12页,（4）工艺参数,树脂选择,上样液,pH,值、流速,洗脱液种类、,pH,值、流速、量,（5）离子交换吸附特点,料液处理量大，在适宜操作条件下，分离过程含有浓缩作用；,应用范围广泛，优化操作条件可大幅度提升分离选择性，所需柱长较短，并可在较高流速下操作；,吸附作用机理明确，非特异性吸附小，产品回收率高,离子交换剂种类多，选择余地大，价格较低。,处理物必须带电荷,天然产物分离纯化方法专家讲座,第13页,9、利用大孔吸附树脂树脂对水提取物进行粗分（可不经过浓缩）,大孔吸附树脂是六十年代末发展起来一类有机高聚物吸附剂，,由聚合单体和交联剂、致孔剂、分散剂等添加剂经聚合反应制备而成。聚合物形成后，致孔剂被除去，在树脂中留下了大大小小、形状各异、相互贯通孔穴，且孔径较大，在1001000,nm,之间，故称为大孔吸附树脂。大孔树脂,表面积较大、交换速度较快、机械强度高、抗污染能力强、热稳定好，在水溶液和非水溶液中都能使用。,已广泛应用于废水处理、医药工业、临床判定和食品等领域，在我国，采取大孔吸附树脂分离纯化中药提取液已越来越受到人们重视。,天然产物分离纯化方法专家讲座,第14页,（1）,吸附产生,表面,天然产物分离纯化方法专家讲座,第15页,（2）大孔吸附树脂分类及使用范围,非极性,大孔吸附树脂,：,不带任何功效基，疏水性较强，适合于从极性溶剂中吸附非极性物质,中等,极性,大孔吸附树脂,：,含酯基吸附树脂，其表面兼有疏水和亲水两部分。既可由极性溶剂中吸附非极性物质，又可由非极性溶剂中吸附极性物质。,极性,大孔吸附树脂：,含酰胺基、氰基、酚羟基等含氮、氧、硫极性功效基吸附树脂，他们经过静电相互作用吸附极性物质。适,宜于从非极性溶剂中吸附极性溶质,天然产物分离纯化方法专家讲座,第16页,（4）吸附树脂筛选:,吸附量测定、解析率测定,（5）树脂吸附法特点,直接从水中吸附物质，降低了蒸发浓缩能耗,吸附容量大,可重复使用,基本用于苷类、生物碱、黄酮等中药有效成份初步纯化,（3）,操作步骤,（,1）树脂预处理,（2）装柱,（3）,上样,（吸附液浓度、,pH,值、温度、上样吸附速度）,（4）,洗脱,（洗脱剂、,pH,值、解吸速度、解吸温度）,（5）再生（95%乙醇洗脱至无色，再用2%盐酸浸泡，用水洗至中性，再用2%,NaOH,浸泡，再用水洗至中性）,天然产物分离纯化方法专家讲座,第17页,（6）中药复方采取大孔树脂吸附工艺特点：,（1）可提升中药制剂中有效成份相对含量：仅从固形物收率一项看，水煮法收率普通为原生药量30左右，水提醇沉法收率普通为原生药量15左右，而用大孔树脂技术仅为原生药25左右。能够克服传统中成药“粗、大、黑”缺点。同时可节约成品包装成本。,（2）产品不吸潮：水煎液中大量糖类、无机盐、粘液质等强吸潮性成份，因不被大孔树脂吸附而除去，所以在作固体制剂时吸潮性小，易于操作和保留。,（3）缩短生产周期：免去静置沉淀、浓缩等耗时多工序，节约生产成本。,（4）去除重金属污染，提升成品国际竞争力。,天然产物分离纯化方法专家讲座,第18页,10、聚酰胺吸附色谱法,（可不经过浓缩）,聚酰胺化学性质,：高分子聚合物质，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等有机溶剂，对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差，,可溶浓盐酸、冰醋酸及甲酸,。,吸附原理,：,天然产物分离纯化方法专家讲座,第19页,影响吸附力原因,：,形成氢键数目,：形成氢键基团数目越多，则吸附能力越强,溶剂洗脱能力次序,：,水,甲醇,丙酮,氢氧化钠溶液,甲酰胺,二甲基甲酰胺,RP-8 RP-2,。,天然产物分离纯化方法专家讲座,第32页,6、高效液相色谱分离,HPLC,（1）高效液相色谱法特点,流动相:液体，普通为甲醇溶液，乙氰溶液,固定相：采取非极性疏水键合相如十八烷基键合相（,ODS）,等,高压：150-350*10,5,Pa,高效：大于30000塔板/米,高灵敏：10,-9,g（,紫外检测）、10,-11,g（,荧光检测）,分离范围：可溶于水及有机溶液物质,洗脱,等度洗脱,梯度洗脱：适于分析极性差异大复杂组分,搜集,（2）高效液相色谱法分离过程,上样：,天然产物分离纯化方法专家讲座,第33页,液相色谱,色谱柱：直径46,mm,柱长1030,cm,天然产物分离纯化方法专家讲座,第34页,溶剂选择普通标准：,资料，相同相溶，,不反应；溶解度（冷-较小，热-较大）；对杂质溶解度很大或很小；沸点较低，易挥发；无毒或毒性小。单一溶剂或混合溶剂。普通惯用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯等。,混合溶剂选取标准：易挥发溶剂溶解度应大,7、结晶及重结晶法,结晶操作：,配,制过饱和溶液，趁热过滤去除杂，放置冷处；制成衍生物或盐,结晶纯度判定：,形状均一、色泽均匀。,含有一定熔点，熔距窄，在,12,范围内。但要注意双熔点化合物。,色谱法：单一化合物在薄层色谱或纸色谱层析中经三种不一样溶剂系统展开，均为一个斑点者。,天然产物分离纯化方法专家讲座,第35页,