分子生物学培训总结.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA,自动测序,核酸分子杂交,RNA,抽提纯化,和逆转录,-PCR,载体与片段连接、,感受态细胞转化,细胞培养及,细胞转染,分子生物学实验培训总结,质粒抽提和,酶切鉴定,重组,DNA,鉴定,目的蛋白的表达及功能的研究,获得目的基因,DNA,重组,遗传的中心法则,1958,年,Crick,提出以,DNA,为中心的遗传信息的传递规律，即,DNA,贮存的遗传信息通过复制传给子代,DNA,，,通过转录传给,RNA,，,再通过翻译传给蛋白质。遗传信息传递方向的这个规律被称为。,DNA,RNA,蛋白质,复制,复制,转录,翻译,反转录,1970,年,Temin,和,Baltimore,发现,RNA,病毒的,RNA,可通过反转录（逆转录）将遗传信息传给,cDNA,，,也可通过,RNA,复制或,RNA,转录传给子代,RNA,，,这是对中心法则的补充。,1997,年疯牛病和朊病毒的出现，预示蛋白质也可逆向将遗传信息向,DNA,传递。,？,DNA,的,结构及功能,DNA,分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。,DNA,分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排在内侧。,两条链的碱基通过氢键连接形成碱基对，其中,A,与,T,配对，,G,与,C,配对。,两个相邻脱氧核苷酸通过,3-5,磷酸二酯键连接。,起着贮存和传递遗传信息的作用。,RNA,的种类,Category,转运核糖核酸,(transfer RNA,tRNA,),核蛋白体核糖核酸,(ribosome RNA,rRNA,),信使核糖核酸,(messenger RNA,mRNA),转运氨基酸,与蛋白质结合形成核蛋白体,起装配机的作用,翻译蛋白质的模板,RNA,的功能,Function,mRNA,的生物合成,mRNA Biosynthesis,真核生物的结构基因由内含子和外显子组成，内含子的序列较长，且不编码蛋白质。,真核生物,DNA,在转录过程中经剪接可将内含子部分去除，获得成熟的,mRNA,。,由于分子生物学研究的最终产物常常是蛋白质，因此我们需要获得可翻译的,mRNA,。,mRNA,易降解，不易长期保存。,将,mRNA,逆转录成,cDNA,，,利用,cDNA,来研究基因的功能。,Trizol,提取,RNA,原理,Trizol,法提取细胞总,RNA,是目前常用的提取方法。,细胞内大部分的,RNA,与蛋白质结合在一起，以核蛋白形式存在。,Trizol,内含异硫氰酸胍和苯酚等物质。,异硫氢酸胍,(,GuSCN,),是一种强的蛋白质变性剂，不仅能使细胞裂解，同时还能有效地抑制细胞内源性,RNA,酶的活性。,通过有机溶剂的分步抽提，最终可获得纯度较高的细胞总,RNA,。,RNA,提取注意事项,Trizol,试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。如皮肤接触,Trizol,，请立即用大量水冲洗。,RNase,污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注意随时勤换手套，样品尽可能盖严；尽量不要对着,RNA,样品呼气或说话。用,0.01%,的,DEPC,水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液需用,DEPC,水配制。,细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分,RNA,会残留在未裂解的细胞中。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源,RNase,降解了,RNA,。,逆转录,(Reverse Transcription),逆转录指遗传信息从,RNA,流向,DNA,，,是,RNA,指导下的,DNA,合成过程，即以,RNA,为,模板，四种,dNTP,为原料，合成与,RNA,互补的,DNA,单链，,称为互补,DNA(complementary DNA,cDNA,),RNA,DNA,逆转录,酶,逆转录原理,cDNA,合成有两个关键因素，一是病毒,RNA,的质量，二是逆转录酶。,逆转录酶是一种多功能酶，它能在一定的条件下，以单链,RNA,为模板合成第一条,cDNA,链。,通过,RNaseH,活性水解,RNA-DNA,杂合分子中的,RNA,链。,逆转录酶,(reverse transcriptase),催化逆转录过程的酶称逆转录酶，,RNA,病毒中都含有此酶。,具有三种酶活性：,RNA,指导的,DNA,聚合酶,RNA,水解酶活性,DNA,指导的,DNA,聚合酶,逆转录体系,RNA,模板,3,UU,A,GG,CC,U,GG,A,U,AA,G,C,G,CC,U,GG,A,5,引物,5,A,T,CC,GG,A,C,逆转录酶,dATP,dGTP,dCTP,dTTP,Mn2+,酶活性依赖金属离子,底物,逆转录过程中,cDNA,的合成,依赖,RNA,的,DNA,聚合酶,核糖核酸酶,H,活力,依赖,DNA,的,DNA,聚合酶,逆转录引物的选择,(Primer),Oligo(dT)(12-18,个核苷酸组成），只有,mRNA,被逆转录,随机六聚寡核苷酸，所有,RNA,均被逆转录,基因特异性引物，仅产生需要的,DNA,逆转录的生物学意义,扩充了中心法则,有助于对病毒致癌机制的了解,与真核细胞分裂和胚胎发育有关,逆转录酶是分子生物学重要工具酶,以,DNA,为模板，利用,DNA,聚合酶的特性体外扩增特定的基因片断，这种方法被称为,DNA,聚合酶链式反应。,PCR,基因放大,连琐,反,应,聚合酶链反应,(polymerase chain reaction,PCR),PCR,基本原理,利用高温可使,DNA,变性和低温可使,DNA,复性的特性，根据体内细胞分裂中,DNA,半保留复制机理，以特异性寡核苷酸为引物，,DNA,分子为模板，在,DNA,聚合酶和四种脱氧核苷酸存在的条件下体外合成新,DNA,分子的过程。,这种热变性,-,复性,-,延伸的过程就是一个,PCR,循环，,PCR,就是在合适条件下的这种循环的不断重复。,PCR,技术的特点,高度的敏感性,高度的特异性,操作简便、快速,适用样品的广泛性,PCR,基本成分,template,primers,Taq,polymerase,10,PCR buffer,dNTPs,Mg,+,PCR Primers,www.ncbi.nlm.nih.gov,PCR Primers,序列发现的时间和发现者,序列的生物体来源,序列的组织来源,引物设计,(Primer design),引物长度（,length,）,:20,30bp,引物中四种碱基的分布应该是随机的,两引物间不能有互补序列，尤其是,3,端,引物的碱基顺序不应与非扩增区域由同源性,引物的,3,末端碱基一定要与模板,DNA,配对,可以在,5,末端加上限制性内切酶位点或起始密码,解链温度,(Tm),：两引物间相差不大于,5,引物内部不能有大于,3bp,的反向重复序列或自身互补序列存在,PCR,基本程序,预变性（,Pre-,denaturation,),变性,(,Denaturation,),退火,(Annealing),延伸,(Elongation),25-30 cycles,5,3,5,3,Double stranded,DNA template,Region to be amplified,5,3,5,3,Double stranded,DNA template,Design primers with,this sequence information,Identical to,this sequence,Reverse complement of this sequence,5,3,5,3,PCR CYCLE 1,Double stranded,DNA template,Primers,Taq,Taq,5,5,3,3,PCR CYCLE 1,Denaturation,95,0,C,strands separate,Primers,Taq,Taq,Taq,polymerase is,thermostable,3,5,5,3,PCR CYCLE 1,Annealing,55,0,C,Primers bind,Taq,Taq,Forward primer anneals to lower strand,Reverse primer anneals to upper strand,3,5,5,3,PCR CYCLE 1,Annealing,55,0,C,Taq,binds to,duplex,Taq,Taq,3,5,5,3,PCR CYCLE 1,Extension,72,o,C,Taq,copies,DNA strand,dNTPS,Taq,Taq,Taq,synthesises DNA in the 5 to 3 direction,3,5,5,3,PCR CYCLE 1,Extension,72,o,C,Taq,copies,DNA strand,Taq,Taq,Taq,synthesises DNA in the 5 to 3 direction,3,5,5,3,PCR CYCLE 1,Extension,72,o,C,Taq,copies,DNA strand,Taq,Taq,Taq,synthesises DNA in the 5 to 3 direction,3,5,5,3,5,3,5,3,PCR CYCLE 1,End cycle 1,PCR animation,PCR,反应,取无菌,0,2ml PCR,管一支，加入：,10,PCR,缓冲液,5l,氯化镁,4l,4,种,NTP,混合液,(10,m,mol/L)0,5l,3,端引物,(10,mol/L)1l,5,端引物,(10,mol/L)1l,Taq,DNA,多聚酶,(5u/l)0,25l,三蒸水,33,25l,模板,cDNA,5l,盖紧盖子，离心数秒后置,PCR,仪上进行扩增。,PCR,循环为：,95,预变性,2 min,，,95,变性,30 s,、,55,复性,30 s,、,72,延伸,1 min,，,30,个循环，最后,72,C,延伸,7 min,。,细胞裂解,RNA,释放,cDNA,PCR,扩增,逆转录酶,耐热,DNA,聚合酶,RT-PCR,扩增,引物,dNTPs,二价金属离子,DNA,聚合酶,引物,dNTPs,二价金属离子,逆转录酶,RT-PCR,过程,逆转录酶,/,耐热,DNA,聚合酶,RT-PCR,的应用,(application),获得基因完整编码区序列,检测基因转录产物,半定量比较不同样品间,mRNA,水平,制备用于杂交的,cDNA,探针,PCR,技术在临床应用中的问题和对策,在我国，前一个时期,PCR,应用相当混乱。,从技术因素分析，常规,PCR,作为临床检验技术存在的最主要的问题是，扩增产物污染带来的假阳性。,常规,PCR,只能定性不能定量，也影响了评价,PCR,检测结果的临床诊断意义。,定量是,PCR,作为临床检验技术发展的另一个重要目标。,琼脂糖凝胶电泳,基本原理,琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖作为固体支持物的一种电泳方法。,因为各种核酸分子的电荷及质量之比是相近的，在没有支持物的电场中，它们以相同的速度前进。,琼脂糖凝胶电泳具有分子筛效应，所以在适当浓度的琼脂糖凝胶中电泳，线性,DNA,分子在电场中的迁移率与其分子量的对数成反比，从而达到分离的目的。,琼脂糖凝胶电泳（,Agarose,Gel Electrophoresis,）,分离的原理,使,TAE,浸过凝胶表面,在阴极的加样孔加样（红正黑负）,分子筛作用,分子量越小，迁移速度越快,琼脂糖凝胶的浓度与,DNA,分离范围,Separation Range Vs.%,Agarose,琼脂糖凝胶浓度与分离效率,大片段在,0.7%,琼脂糖凝胶中分离效果好,小,片段在,1.5%,琼脂糖凝胶中分离效果好,上样,上样缓冲液,甘油可,增加样品密度，使其比重增加，以确保,DNA,均匀沉入加样孔内,在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置,使样品呈色，使加样操作更方便,EDTA,SDS,可灭活限制性内切酶,溴化乙锭,(EB),染色,EB,堆砌在,DNA,双螺旋的碱基对之间,DNA,分子越小,结合的,EB,越少,染色越淡,溴化乙锭是一种荧光染料,可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光，常用,0.5mg/ml,+,+,注意事项,一定要等凝胶冷却至,60,时再入加溴化乙锭,切记,DNA,样品由负极往正极泳动,(,靠近加样 孔的一端为负,),加完样品后最好先观察一段时间,插电极或拔电极时必须将仪器电源关掉,不要使样品跑出凝胶,琼脂糖凝胶电泳应用,PCR,产物鉴定,酶切片段鉴定,DNA,片段回收,DNA,的定量,分子克隆,(molecular cloning),基因工程的核心,克隆：,克隆是指通过无性繁殖过程所产生的与亲 代完全相同的子代群体,分子克隆,细胞克隆,动物克隆,基因工程中所指的克隆，是在体外对,DNA,分子按照既定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入合适细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该,DNA,分子得大量拷贝。这类克隆是在分子水平上操作的，故称为分子克隆。又被称为基因克隆或,DNA,克隆。,分子克隆中常用的工具酶,限制性核酸内切酶,DNA,连接酶,DNA,聚合酶,末端转移酶,逆转录酶,碱性磷酸酶,核酸外切酶,基因克隆的基本程序,外源基因或目的基因的获得,载体的构建或选择,连接,转化,阳性重组体的筛选与鉴定,目的基因,目的基因是指我们所要研究和应用的基因，也就是我们将要克隆或表达的基因。,获得目的基因是分子克隆过程中的第一步。,体外扩增基因法,(PCR and RT-PCR),人工合成基因法,限制性内切酶直接分离法获得,基因文库筛选法,从,cDNA,文库中筛选,RT-PCR,RNA,提取,RT-PCR,Extract RNA from virus/cells,RNA,载体,(Vector),载体是指能够携带外源基因转入受体细胞内进行扩增或诱导外源基因在受体细胞内表达的工具。,载体应具备的条件,带有复制子,多克隆酶切位点,筛选标志,完整的转录单位（表达型载体）,载体的分类,按功能分类：克隆载体和表达载体,按受体细胞分类：原核细胞载体和真核细胞载体,按载体来源分类：质粒载体、嗜菌体、病毒、酵母人工染色体、粘粒,pGEM,-T Easy Vector,绿色荧光蛋白载体,酶切载体和目的基因,(Enzyme restriction,digest of,DNA plasmid vector and target gene,）,目的基因与载体的连接（,ligation,）,利用,DNA,连接酶把载体,DNA,和要克隆的目的,DNA,片段连接在一起，成为一个完整的重组分子，被称为连接反应。,DNA,连接酶,(DNA,Ligase,),催化两个独立的,DNA,片段,5-,磷酸基团和,3-,羟基基团之间形成磷酸二酯键。,连接方法,粘性末端连接法：,单酶连,、,双酶连,平齐末端连接法,同聚物接尾法,人工接头法,PCR,产物与载体的连接：限制性酶切位点添加法、,T/A,克隆法,单一酶切的粘性末端连接缺点,载体自连：载体,DNA,两端的粘性末端可以自身退火成环，产生载体,-,载体相连接的假阳性克隆。,双向插入：由于使用同一种内切酶，载体与插入片段的,4,个末端全为相同的粘性互补顺序，所以目的基因插入可以有两个方向。,Bam,H,切割反应,GGATCC,CCTAGG,T4,DNA,连接酶,15,C,GATCC,G,G,CCTAG,+,目的基因用,Bam,H,切割,载体,DNA,用,Bam,H,切割,重组体,载体自连,目的基因自连,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点的连接（双酶连）,Eco,R,切割位点,Bg,l,切割位点,+,Eco,R,+,Bg,L,双酶切,Eco,R+,BgL,双酶切,T4,DNA,连接酶,15,C,重组体,平端连接,适用于：限制性内切酶切割产生的平端,粘端补齐或切平形成的平端,目的基因,载体,限制性内切酶,限制性内切酶,T4 DNA,连接酶,15,C,重组体,载体自连,目的基因,自连,同聚物加尾连接,在末端转移酶,(terminal,transferase,),的作用下，在,DNA,片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,5,3,3,5,载体,DNA,5,3,3,5,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,5,3,3,5,5,3,T(T),n,T,T(T),n,T,3,5,5,3,3,5,5,3,A(A),n,A,A(A),n,A,3,5,-,核酸外切酶,-,核酸外切酶,末端转移酶,+,dATP,末端转移酶,+,dTTP,T(T),n,T,A(A),n,A,A(A),n,A,T(T),n,T,T4,DNA,连接酶,15,C,重组体,人工接头,(linker),连接,在平端加上酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,CCGAATTCG,GGCTTAAGC,5,-,3,-,Eco,R,Eco,R,Eco,R,Eco,R,T/A,克隆法,利用含有单个胸腺嘧啶（,T,）,3-,突出末端的线性化载体与带有单个腺苷酸（,A,）,3-,突出末端的,PCR,产物来进行克隆，这种方法被称为,T/A,克隆法。,此方法利用了,Taq,DNA,聚合酶具有延伸酶的活性，即不依赖模板的方式将一个核苷酸添加到已完成延伸的,PCR,产物的,3-,末端。在四种核苷酸都存在的情况下，这个添加上去的核苷酸通常是,A,残基。,重组分子导入受体细胞,外源,DNA,分子与载体组成重组分子后，需要导入受体细胞才能进行繁殖和表达，受体细胞系指被导入重组分子的细胞，又称宿主细胞。根据导入受体细胞的方式不同，可分为：,转化（,transformation,）：,将重组,DNA,分子导入原核细胞的过程,转染（,transfection,）：,将重组,DNA,分子导入真核细胞的过程,感染（,infection,）：,噬菌体进入宿主细菌，病毒进入宿主细胞中繁殖的过程,转化过程,制备感受态细胞（,competent cell,）：,用物理或化学方法处理细胞，使其处于最适摄取和容忍外来,DNA,的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。,将重组,DNA,分子和感受态细胞相混合，使,DNA,分子进入大肠杆菌细胞中。,转化细胞在含有抗生素的琼脂平板上生长,氯化钙法原理,细菌处于,0,氯化钙低渗溶液中，细胞膨胀成球形。,转化混合物中的,DNA,形成抗,DNA,酶的羟基鸟磷酸复合物粘附于细胞表面，经,42,短时间热休克处理，促进细胞吸收,DNA,复合物。,在培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。,被转化的细菌中，重组基因得到表达，在选择性培养基平板上可筛选出所需的转化子。,氯化钙法,(Chemical transformation with Calcium Chloride),CaCl,2,方法的转化效率一般可达,10,6,-10,7,转化子,/g DNA,。,关键是,(1),使用对数生长期的细菌,(2),低温操作,(3),手法温柔,优点,:,简单、稳定、可重复性高。,缺点,:,转化效率稍低，而且不能转化大质粒,(,15Kb),电转法,(Transformation by,Electroporation,),重组,DNA,的筛选与鉴定,抗药性筛选法,蓝白筛选法,DNA,限制性内切酶图谱分析,DNA,序列测定法,核酸杂交法,PCR,法,抗生素筛选转化结果,Growth on agar plates,(Amp+X-Gal),and selection for antibiotic resistant colonies,重组,DNA,技术操作过程可形象归纳为,小 结,分,分离目的基因,切,限制酶切目的基因与载体,接,拼接重组体,转,转入受体菌,筛,筛选重组体,重组,DNA,技术操作的主要步骤,载体,质粒,噬菌体,病毒,目的基因（外源基因）,基因组,DNA,cDNA,人工合成,PCR,产物,限制酶消化,开环载体,DNA,目的基因,连接酶,重组体,转化,体外包装，转染,带重组体的宿主,筛选,表型筛选,酶切电泳鉴定,菌落原位杂交,克隆常见问题,转化后无克隆产生,白色菌落很少或者根本没有,实验组只有白色菌落,白色菌落中阳性克隆率低,重组,DNA,的应用,克隆基因的表达,探针标记,基因组序列分析,基因的定点突变,基因打靶技术,转基因技术,质粒提取及酶切鉴定,实验目的及背景,质粒是,独立于细菌染色体外的,DNA,分子,，大小可为,1kb,到,200kb,。,大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。,其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。,plasmid,chromosome,质粒类型,质粒按复制方式分为两种类型：,松弛型质粒和,严紧型质粒,1.,松弛型质粒,(relaxed plasmid),松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。,2.,严紧型质粒,(stringent plasmid),严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。,按功能分为,3,类：,F,质粒（即性质粒）,R,质粒（即抗药性质粒）,Col,质粒（即大肠杆菌素因子）,质粒,DNA,的一般性质,环状超螺旋,DNA,分子,质粒可以转移,质粒的复制依赖宿主细胞的复制机器,质粒有相容性及不相容性,质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。,Target Genes Carried by Plasmid,1 plasmid,1 cell,Recombinant,Plasmid,Transformation,Target Gene,Recombination,Restriction,Enzyme,Restriction,Enzyme,Chromosomal DNA,Target Genes,DNA Recombination,Transformation,Host Cells,Juang RH(2004)BCbasics,质粒的应用,大多数基因工程使用松弛型质粒。,严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。,质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。,质粒载体,(plasmid vectors),是一独立的复制子,有筛选标记,具有酶切位点或多克隆位点,分子量小，拷贝数高,测序、亚克隆、表达、可重复性高,分离质粒,DNA,方法,从大肠杆菌中分离质粒,DNA,方法众多，目前常用的有：,碱变性法；,煮沸法；,SDS,法；,羟基磷灰石层析法等,各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒,DNA,可用于酶切,连接与转化。,质粒,DNA,提取的,步骤,所有分离质粒,DNA,的方法都包括,3,个基本步骤：,培养细菌使质粒扩增；,收集和裂解细菌；,DNA,分离质粒,DNA,；,培养单克隆细胞,Amplification and Screening of Target Gene,1,1 cell line,1 colony,X100,X1,000,Plasmid,Duplication,Bacteria,Duplication,Plating,Pick the colony,containing target gene,=100,000,Juang RH(2004)BCbasics,碱变性法基本原理,在,pH 12.0-12.6,碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体,DNA,变性，而共价闭环质粒,DNA,仍为自然状态。,将,PH,调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体,DNA,之间交联形成不溶性网状结构，大部分,DNA,和蛋白质在去污剂,SDS,的作用下形成沉淀，而质粒,DNA,仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体,DNA,、,RNA,及蛋白质，质粒,DNA,尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒,DNA,。,质粒小量制备的问题与对策,质粒,DNA,不能被限制酶所切割，这是由于：,从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化,DNA,。,DNA,在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应。重新沉淀,DNA,，让酒精充分挥发。,DNA,中残留有金属离子，可增加,70%,乙醇洗涤的次数。,出现无质粒,DNA,的现象，这可能是由于细菌中无质粒或核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去,重组质粒的鉴定,琼脂糖凝胶电泳,限制性内切酶酶切,紫外分光光度计测定,DNA,自动测序,核酸杂交法,PCR,法,质粒的琼脂糖凝胶电泳,(,Agarose,Gel Electrophoresis),在一定电场强度下，,DNA,分子的迁移取决于,DNA,分子本身的大小和构型。,相对分子质量不同的,DNA,片段泳动速度不一样。质粒,DNA,的形态不一，电泳时在凝胶中的迁移率不同。,因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的,DNA,，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的,DNA,分子。,超螺旋的质粒,DNA,一般迁移最快、开环（缺口）质粒,DNA,迁移最慢，线化,DNA,位于两者之间。,质粒的琼脂糖凝胶电泳,限制性核酸内切酶,1970,年发现的，是一类能识别和切割双链,DNA,分子内特定碱基顺序的核酸水解酶。被称为分子生物学的“手术刀”。,有三种类型的限制性内切酶，最常用的是,型,识别顺序一般为,4-6,个碱基的回文结构。如下：,Palindrome,Restriction Enzyme,Sticky Ends,GAATTC,GAATTC,G,AATTC,G,AATTC,Sticky Ends,(Cohesive Ends),EcoRI,G,et,A,n,A,pple,T,o,T,he,C,lass,G,AATTC,G,AATTC,Juang RH(2004)BCbasics,限制性内切酶切割双链,DNA,产生,3,种不同的切口,平头末端,(blunt end),5,端突出的粘性末端,3,端突出的粘性末端,平头末端,(blunt end),在识别顺序的对称轴上，对双链,DNA,同时切割，产生平头末端,(blunt end),5-GG CC-3,Hae,5-GG CC-3,3-CC GG-5 3-CC GG-5,5,端突出的粘性末端,在识别顺序的两个对称点切开,DNA,双链，产生带单链尾巴的粘性末端,从,5,端切割产生,5,端突出的粘性末端,5-G AATTC-3,Eco,R5-G AATTC-3,3-CTTAA G-5 3-CTTAA G-5,3,端突出的粘性末端,在识别顺序的两个对称点切开,DNA,双链，产生带单链尾巴的粘性末端,从,3,端切割产生,3,端突出的粘性末端,5-CTGCA G-3,Pst,5-CTGCA G-3,3-G ACGTC-5 3-G ACGTC-5,用限制性内切酶切割质粒,质粒,4ul,去离子水,4ul,10 xbuffer 1ul,Eco,R,0.5ul,离心混合后，,37 1,小时,Buffer,Plasmid,EcoR,Water,酶切反应注意事项,决不能用水稀释,以免变性失活。,预先加入除酶以外的所有其他试剂。,取酶立即放于冰上。分装小份避免反复冻融。,使用无菌的新吸头。,少加水,使体积最小,但保证酶液体积不超过总体积的,10,否则酶液中的甘油会抑制酶活性。,限制性核酸内切酶的应用,改造及组建质粒,组建基因组,DNA,物理图谱,基因组,DNA,同源性研究,DNA,重组克隆及亚克隆,DNA,杂交与顺序分析,测序技术进展,同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳,多色荧光标记,毛细管电泳,单色荧光标记,平板电泳,同位素标记,平板电泳,A,C,G,T,A,C,G,T,测序图谱,T,A,TT,G,C,A,T T,G,T,C,T,G,C,A,TT,G,T,C,T,Dideoxynucleotides,H,P,O,OH,OH,HO,O,O,CH,2,NH,2,N,N,N,N,Sugar,Base,Phosphate,3,5,2,1,4,H,23-dideoxynucleotide,monophosphate,2-dideoxynucleotide,monophosphate,Phosphodiester,bond,P,R,P,R,P,R,P,R,P,R,P,R,OH,5,3,1,3,5,A,1,2,3,4,5,6,A,PO,4,2-,H,3,5,2,H,di,deoxy,nuceotide,Terminated,dd,NTP,Sangers Method:How Terminated,Normal Linking,Can not react,Juang RH(2004)BCbasics,The,ddATP,Reaction,5TTATCG,3AATAGCATGGTACTGATCTTACGCTAT5,5TTATCG,TACCATGACTAGATGCG,A,5TTATCG,TACC,A,5TTATCG,TACCATGACT,A,5TTATCG,T,A,5TTATCG,TACCATG,A,5TTATCG,TACCATGACTAGATGCGAT,A,5TTATCG,TACCATGACTAG,A,Pol,.,5TTATCG,T,A,Let me,Through!,Pol,.,5TTATCG,TACCATG,A,Oh come,on!,Pol,.,5TTATCG,TACCATGACTAG,A,Not,Again!,Pol,.,5TTATCG,TACCATGACTAGATGCGAT,A,Agggg,.,DNA,自动测序,DNA,自动测序是在,Sanger,法的基础上经过加工改进的。,将,2,3-,双脱氧三磷酸核苷酸,(,ddNTP,),用不同的荧光标记，如用红色荧光标记,ddTTP,，蓝色荧光标记,ddCTP,，黄色荧光标记,ddGTP,，绿色荧光标记,ddATP,。,在测序,PCR,反应中，将荧光标记的,ddNTP,掺入到反应中，当某一,ddNTP,分子掺入到合成的,DNA,分子中时，该链延伸终止并且标记上相应的荧光染料分子。,反应终止后，就会得到不同荧光标记的长短不同的,DNA,分子。,经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电泳分离后，用荧光检测仪检测，收集的信号经过计算机分析后便可以得到,DNA,的核苷酸序列。,测序反应,(20l),模板,(template),：,200-500ng,引物,(primer),：,5pmol,Premix(ddNTP,dNTP,Taq,Polymerase):8l,H,2,O,9520 s,5015 s,60 1min,25 cycles,原始数据分析,除文本文件外，,DNA,自动测序还提供测序图,数据读取软件可以对原始数据进行处理，得到最终的测序结果,测序结果分析,影响测序结果的因素,DNA,自动测序在医学上的应用,基因组研究,疾病诊断,基因分型,分子生物学中使用的杂交方法,核酸分子杂交原理,核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术之一,其基本原理就是应用核酸链中碱基互补的原理（,A-T,，,C-G,），用已知的核酸（探针），通过杂交来检测样本中与探针同源的核酸序列。,根据杂交对象的不同可以分为,DNA,（模板）,/DNA,或,RNA,（探针）的杂交即,Southern blotting,；,RNA,（模板）,/DNA,或,RNA,（探针）杂交即,Northern blotting,。,B,B,B,B,B,B,B,用已知带标记的探针与固定于载体上的未知模板杂交（或反之）,核酸分子杂交的必要条件,固相载体（液相杂交除外），常用的有硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻片、聚苯乙烯等。,带示踪物标记的探针，常用的有放射性同位素、地高辛（,Digoxigenin-11-dUTP),、生物素（,Biotin,）等。,经变性处理的待检模板。,合适的杂交条件。,示踪物检测系统。,探针标记,缺口移位法（缺口平移、缺口翻译）,末端标记法,PCR,掺入法,探针和模板的单链化,加热变性,碱变性,标记示踪物的检测,放射性同位素的检测：感光胶片,地高辛检测：,(Anti-,Dig)Antibody,-AP,，底物为,BCIP+NBT,生物素检测：,Biotin-,Streptavidin,-AP,BCIP,：,5-,溴,-4-,氯,-3-,吲哚,-,磷酸盐,NBT,；氯化四唑硝基蓝（氯化四唑氮蓝）,标本,源于病人：血清,/,血浆等,源于细胞：基因组,源于培养物：细菌、病毒等,重组质粒,核酸扩增产物,其它,Southern/Northern Blotting(Hybridization),Remove,unbound,probe,intact RNA or digested DNA,Hybridization,探针模板杂交,地高辛标记法原理,将地高辛连接于,dUTP,第五位的嘌呤环上，形成,Dig-,dUTP,。,DNA,通过地高辛配基标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸（,dUTP,）随机插入结合而被标记。,杂交的靶,DNA,通过酶联免疫法与一个抗体复合物结合，接着在,BCIP/NBT,存在下，由酶催化反应，在杂交部位显色。,DIG,标记探针的,Southern blotting,过程示意图,杂交探针的标记：地高辛系统标记,digoxigenin,DIG,dUTP,-,连接臂,-,甾醇半抗原,抗体,-,显色酶交联复合物,斑点杂交试验,0.01 l 0.1 l 1 l,100 50 40 30 20 10 5 2.5 1.25 0.625,ng,bDNA,技术,捕捉添加子和标记添加子与靶核酸杂交，并使靶结合于微孔,前放大子与标记添加子杂交,加底物,Dioxitane,测量化学发光,标记探针与放大子杂交,放大子与前放大子杂交,加裂解缓冲液,靶核酸,Sample DNA,Each spot contains known DNA,Biochip,Schena,(2000),Microarray,Biochip Technology,p.A31,Complementary DNA hybridize,Signal appears,Biochip Based on Hybridization,Juang RH(2004)BCbasics,Southern blot,应用,克隆基因的酶切图谱分析,基因组基因的定性及定量分析,基因突变分析,限制性片段长度多态性分析,细胞转染,转染技术是指将外源分子如,DNA,，,RNA,等导入真核细胞的技术，它是研究基因表达调控，突变分析等的常规工具，随着功能研究的兴起，其应用越来越广泛。,传统方法,转染技术,Transfection,细胞转染分类,瞬时性转染：外源,DNA/RNA,不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。,稳定转染：,DNA,整合到宿主细胞的染色体中或形成附加体。外源,DNA,整合到染色体中概率很小，大约,1/10,4,转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。,细胞转染,(,Transfection,),及报告基因表达的检测原理,目的基因转染细胞后，对目的蛋白的表达及功能的研究可通过检测特定报告基因的表达实现。常用的基因报告系统有荧光蛋白报告系统、半乳糖苷酶报告系统、荧光素酶报告系统。,绿色荧光蛋白,(GFP),在蓝光或紫外光激发下可发射绿色荧光的特性使得我们在转染细胞后，无需对细胞作特殊的处理，只需观察细胞内绿色荧光的产生情况，就可了解转染效率。,转染细胞的鉴定,荧光显微镜观察,GFP,（,green flu