蛋白质分子量测定方法研究进展.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,蛋白质分子量测定方法研究进展,优选蛋白质分子量测定方法研究进展,SDS-PAGE,凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳技术是实验室进行蛋白质研究中最常用的技术，兼有电泳和分子筛的双重作用。,SDS,是一种阴离子去污剂，可使蛋白质变性，与其蛋白质结合成带负电荷的蛋白质,-SDS,复合体，消除电泳过程中蛋白质所带电荷对电泳结果的影响，从而保证蛋白质电泳仅受分子质量大小的影响。在一定的电场作用下，该复合体沿着以聚丙烯酰胺凝胶形成的分子筛向电场的正极移动，从而将蛋白质根据他们的分子量大小而分开。,蛋白质-SDS复合体：形状一定、电荷密度一定,电喷雾是一种离子化方法，可以用作质谱仪的离子源,缺点：在与高效液相色谱、毛细管电泳等分离设备的联用时，目前只能采取离线的方式，致使分析结果的重复性较差，与MALDI-MS 本身高精密度的特性不匹配。,对样品纯度要求高，且会形成多电荷的质谱峰群，难以分辨，使得结果分析较为困难。,（K1、K2为常数，MW为分子量）,粘度法是指通过测定样品溶液的粘度，从而计算样品的的分子量的方法。,原理：基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）是将待测物悬浮或溶解在一个基体中，基体与待测物形成混晶，当基体吸收激光的能量后，均匀传递给待测物，使待测物瞬间气化并离子化。,（3）有利于对复杂混合物的分析，且能忍受较高浓度的盐、缓冲剂和其他难挥发成分，降低了对样品预处理的要求；,近年来，生物质谱技术取得了突飞猛进的发展，其中以分别由 科学家和 科学家田中耕一发明的电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）及基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）的贡献最为突出。,电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）,在一种理想溶液中，渗透压与溶质浓度成正比。,近年来，生物质谱技术取得了突飞猛进的发展，其中以分别由 科学家和 科学家田中耕一发明的电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）及基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）的贡献最为突出。,（4）MALDI-TOF 质谱对生物大分子分子量的测定范围是所有测试技术中最广。,当蛋白质分子量在10-200kDa时，样品的迁移率和分子量的对数呈对数关系，符合如下方程式：lgMW=-bRf+K,优点：操作简单，容易掌握，成本低，分辨率高，重复效果好。,将它与经典的脉冲化工作方式的飞行时间质谱仪（TOF）直接联用，即我们常听到的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）。,SDS-PAGE,凝胶电泳,上样：防止样品溢出、正负极、电压,SDS-PAGE,凝胶电泳,当蛋白质分子量在,10-200kDa,时，样品的迁移率和分子量的对数呈对数关系，符合如下方程式：,lgMW=-bR,f,+K,其中，,MW,为蛋白质分子质量，,R,f,为相对迁移率，,b,为斜率，,K,为截距，当条件一定时，,b,和,K,为常数。,因此通过已知分子量的蛋白和未知分子量蛋白的比较，就能得出未知蛋白的分子量。,影响分子量测定的因素很多，包括蛋白质与,SDS,的结合量的不同，凝胶浓度和交联剂浓度等，如图所示。研究者测定了当交联剂浓度不变，改变凝胶浓度，下图分别对应于凝胶浓度为,5%,，,10%,，,15%,。,SDS-PAGE,凝胶电泳,优点,：操作简单，容易掌握，成本低，分辨率高，重复效果好。,缺点,：对于电荷异常或者构象异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白及一些结构蛋白测定的分子质量不太可靠，而且电泳结束后还需要染色，染色，脱色比较耗时。,SDS-PAGE,凝胶电泳,凝胶渗透层析法,定义：又叫体积排阻层析、分子筛层析，当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行的分离技术。,固定相：惰性凝胶颗粒，颗粒内部立体网状结构，形成许多孔穴,原理：,通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。,优点：操作简单，设备简单，样品用量少，周期简单，条件温和，一般不引起生物活性的改变。,（2）对样品分子质量测试灵敏度、分辨力和准确度都相当高；,SDS-PAGE凝胶电泳,Ve=K1K2logMW,粘度法是指通过测定样品溶液的粘度，从而计算样品的的分子量的方法。,粘度法是指通过测定样品溶液的粘度，从而计算样品的的分子量的方法。,其中，MW为蛋白质分子质量，Rf为相对迁移率，b为斜率，K为截距，当条件一定时，b和K为常数。,对样品纯度要求高，且会形成多电荷的质谱峰群，难以分辨，使得结果分析较为困难。,SDS-PAGE凝胶电泳,当蛋白质分子量在10-200kDa时，样品的迁移率和分子量的对数呈对数关系，符合如下方程式：lgMW=-bRf+K,多电荷使得样品谱图复杂,SDS-PAGE凝胶电泳,电喷雾是一种离子化方法，可以用作质谱仪的离子源,（1）对样品的消耗少，不会造成样品的大量浪费；,凝胶渗透层析法,常用凝胶：交联葡聚糖凝胶（,Sephadex,）、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶（,Sepharose,）,凝胶渗透层析法,洗脱体积,V,e,与分子量的关系可用下式表示：,V,e,=,K,1,K,2,logMW,（,K,1,、,K,2,为常数，,MW,为分子量）,从公式可以看出，目标样品的流出体积与分子量对数成线性关系。在实际操作过程中，选取标准品与样品同时通过凝胶柱，通过已知标准品的流出体积和分子量可以计算出曲线中的,K,1,、,K,2,值，再根据已知的曲线方程和样品流出体积计算样品的分子量。,凝胶渗透层析法,优点：,操作简单，设备简单，样品用量少，周期简单，条件温和，一般不引起生物活性的改变。,缺点：,应用具有一定的局限性，在,pH6,8,的范围内，线性关系比较好，但在极端,pH,时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过,5%,时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。,质谱法,1906年，Thomson发明了质谱技术，最初只是用于无机化学中的同位素分析，直至20世纪40年代末才发展成为有机质谱。近年来，生物质谱技术取得了突飞猛进的发展，其中以分别由 科学家和 科学家田中耕一发明的电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）及基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）的贡献最为突出。,可准确测定分子量,1.,电喷雾离子化质谱技术（,ESI-MS,）,原理：,电喷雾离子化质谱技术（,ESI-MS,）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷密度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相的质谱技术。,ESI-MS,测定蛋白质大分子是根据一簇多电荷的质谱峰群，通过解卷积的方式计算得到蛋白质的分子量，由于,ESI-MS,可以产生多电荷峰，因此使得测试的分子质量范围大大扩大。,1.,电喷雾离子化质谱技术（,ESI-MS,）,电喷雾是一种离子化方法，可以用作质谱仪的离子源,1.,电喷雾离子化质谱技术（,ESI-MS,）,多电荷使得样品谱图复杂,荷质比：,1.,电喷雾离子化质谱技术（,ESI-MS,）,优点：,（,1,）对样品的消耗少，不会造成样品的大量浪费；,（,2,）对样品分子质量测试灵敏度、分辨力和准确度都相当高；,（,3,）能够方便地与多种分离技术联用，如毛细管电泳、高效液相色谱等，是解决非挥发性、热不稳定性、极性强的复杂组分化合物的定性定量的高灵敏度检测方法。,缺点：,对样品纯度要求高，且会形成多电荷的质谱峰群，难以分辨，使得结果分析较为困难。,2.,基质辅助激光解吸电离质谱技术（,MALDI-MS,）,原理：,基质辅助激光解吸电离质谱技术（,MALDI-MS,）是将待测物悬浮或溶解在一个基体中，基体与待测物形成混晶，当基体吸收激光的能量后，均匀传递给待测物，使待测物瞬间气化并离子化。,将它与经典的脉冲化工作方式的飞行时间质谱仪（,TOF,）直接联用，即我们常听到的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（,MALDI-TOF-MS,）。,TOF,的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（,M/Z,）与离子的飞行时间成正比，检测离子,。,2.,基质辅助激光解吸电离质谱技术（,MALDI-MS,）,优点：,（,1,）同,ESI-MS,一样对样品的消耗很少；,（,2,）,MALDI-MS,的最高分辨率不断提高，甚至超过,ESI-MS,；,（,3,）有利于对复杂混合物的分析，且能忍受较高浓度的盐、缓冲剂和其他难挥发成分，降低了对样品预处理的要求；,（,4,）,MALDI-TOF,质谱对生物大分子分子量的测定范围是所有测试技术中最广。,缺点：,在与高效液相色谱、毛细管电泳等分离设备的联用时，目前只能采取离线的方式，致使分析结果的重复性较差，与,MALDI-MS,本身高精密度的特性不匹配。,当蛋白质分子量在10-200kDa时，样品的迁移率和分子量的对数呈对数关系，符合如下方程式：lgMW=-bRf+K,电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）,当蛋白质分子量在10-200kDa时，样品的迁移率和分子量的对数呈对数关系，符合如下方程式：lgMW=-bRf+K,研究者测定了当交联剂浓度不变，改变凝胶浓度，下图分别对应于凝胶浓度为5%，10%，15%。,基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）,电喷雾是一种离子化方法，可以用作质谱仪的离子源,优点：操作简单，容易掌握，成本低，分辨率高，重复效果好。,TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比，检测离子。,多电荷使得样品谱图复杂,电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）,Ve=K1K2logMW,其中，MW为蛋白质分子质量，Rf为相对迁移率，b为斜率，K为截距，当条件一定时，b和K为常数。,（2）MALDI-MS 的最高分辨率不断提高，甚至超过ESI-MS；,电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）,（2）对样品分子质量测试灵敏度、分辨力和准确度都相当高；,其他方法,除了以上几种目前实验室常用的测定方法，还有一些现在在实验室一般不太使用的方法，包括粘度法，渗透压法，辐射失活法，超速离心沉降法，光散射法等。,1.,粘度法,粘度法是指通过测定样品溶液的粘度，从而计算样品的的分子量的方法。一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量,(,粘均分子量,),。如果高聚物分子的分子量愈大，则它与溶剂间的接触表面也愈大，摩擦就大，表现出的特性粘度也大。,特性粘度与相对分子量M之间遵循Mark-Houwink经验方程：,=KM,。K和值与温度、聚合物、溶剂性质有关，也和分子量大小有关。,2.,渗透压法,在一种理想溶液中，渗透压与溶质浓度成正比。,但是实际上蛋白质溶液与理想溶液有较大的偏差。,渗透压法测定蛋白质分子量灵敏度较低，测定误差较大，与,SDS-PAGE,法和凝胶色谱法等相比不常用于蛋白质分子量的测定。,