实验一 纸层析法分离鉴定氨基酸.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,18,*,实验一 纸层析法分离鉴定氨基酸,通过实验，掌握纸层析的基本操作技能。,加深对分配层析原理的理解。,【,一、实验目的,】,1,18,【,二、实验,原理,】,层析技术,是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为,固定相,，另一相流过此相称作,流动相,，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。,可分离物质,糖类、有机酸、氨基酸、核苷等,2,18,固定相,在层析中,起分离作用而不随层析过程移动,的物质。如纸层析中固定相是滤纸纤维中结合的水。固定相被看成是样品移动的阻力。,流动相,在层析过程因其本身流动而,推动样品移动,的物质。,3,18,名称,操作方式,固定相,流动相,分离依据,分配层析,纸层析,薄层层析,液体,液体,溶解度,离子交换层析,离子交换柱层析,固体,液体,带电性,静电引力,吸附层析,吸附薄层层析,气体吸附层析,固体,液体,气体,吸附力,亲和层析,酶与底物,抗原与抗体,固体,液体,配体专一性,凝胶层析,凝胶过滤,固体,液体,分子大小,层析的分类,4,18,分配层析,：是利用不同物质在两种不相溶的溶剂中的分配系数不同而达到分离的一种技术。,分配系数,=,溶质在固定相的溶解度,溶质在流动相的溶解度,5,18,纸层析是以滤纸作为惰性支持物的,分配层析,：纸纤维上的,OH,基具有亲水性，所以能,吸附,一层,水,作为,固定相,，,而通常把,有机溶剂,作为,流动相,。流动相流经支持物时与固定相间连续抽提，使物质在两相间不断地分配而得到分离。,6,18,溶质在滤纸上的移动速率用,f,（比移）值来表示：,展层层斑点中心与原点间的距离,R,f,=-,溶剂前沿与原点之间的距离,7,18,8,18,影响,R,f,值,的因素,（多种）,物质结构与极性,物质的极性大小决定了物质在水,和有机溶剂之间的分配情况。,pH,值,展层剂的,pH,影响被分离物质的极性基团的解离形式。,层析滤纸的质量,层析用滤纸要质地均匀，紧密，,有一定的机械强度，并含杂质少。国产新华滤纸可,用于一般的纸层析。,9,18,【,三、器材与试剂,】,器材：,1,、层析缸,2,、毛细管,3,、喷雾器,4,、培养皿,5,、层析滤纸,(,新华一号,),试剂：,1,、扩展剂,（正丁醇,：,水,：,冰醋酸,=4,：,3,：,1,）,2,、显色剂,0.1,茚三酮正丁醇溶液。,3,、氨基酸溶液,0.5,的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液,及它们的混合液,10,18,1,、层析滤纸准备：,取层析滤纸,(,长,20 cm,、宽,15 cm),一张。在纸的一端距边缘,2,3 cm,处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔,2cm,作一记号。,2,、点样：,用毛细管将各氨基酸样品分别点在这,5,个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径，最大不超过,3 mm,。,【,四、实验步骤,】,11,18,3,、扩展,：,用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线,1 cm,）。待溶剂上升约,15 cm,时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。,4,、显色：,用喷雾器均匀喷上,0,。,1,茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤,5,分钟,(100),或用热风吹干即可显出各层析斑点。,5,、计算,R,f,值,12,18,【,五、实验结果与分析,】,【,六、注意事项,】,【,七、思考题,】,1,、实验中作为固定相和流动相的物质分别是什么？,2,、,R,f,值的含义、影响因素？,下次实验：,实验二,蛋白质和氨基酸的颜色反应,值 日 生 值 日,13,18,小实验,当滤纸接触到溶剂时，溶液将上升。,滤纸上的小圆点是,4,种不同的氨基酸的混合物。,看看接下来会发生什么事情,14,18,可以看出,1,号氨基酸上升的最高，在滤纸上跑得最快。,而,4,号氨基酸与滤纸的结合最紧，因此跑的速度比其他的氨基酸慢。,1,2,3,4,15,18,这就是纸色谱法。,对照上图，可知道,1-4,号的各代表什么氨基酸。,纸色谱法是分离鉴定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。,1,2,3,4,甘氨酸,半胱氨酸,组氨酸,缬氨酸,16,18,纸色谱小实验动画演示,17,18,18,18,