课题3-血红蛋白的提取和分离-(2).ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,课题,3,血红蛋白的提取和分离,一,.,基础知识,蛋白质提取和分离的原理,（一）分离生物大分子的基本思路,选用一定的物理或化学的方法分离 具有不同物理或化学性质的生物大分子,（二）蛋白质分离和提取的原理,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少，溶解度，吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质,（三）蛋白质分离和提取的方法,1.,凝胶色谱法（分配色谱法）,概念：,根据被分离的蛋白质的,相对分子质量,的大小，利用 具有网状结构的凝胶的分子筛作用来进行分离,凝胶,组成：,多糖类化合物构成，如葡萄糖、琼脂糖,结构：,一些微小的多孔球体，内含许多贯穿的通 道，具有多孔的凝胶就叫分子筛,原理,大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；,小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。,过程,混合物,上 柱,洗,脱,大分子流动快,小分子流动慢,收 集,大分子,收 集,小分子,依据的特性是：,蛋白质分子量的大小。,1.,凝胶色谱法（分配色谱法）,1.,凝胶色谱法（分配色谱法）,凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示,原理,大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；,小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。,过程,混合物,上 柱,洗,脱,大分子流动快,小分子流动慢,收 集,大分子,收 集,小分子,依据的特性是：,蛋白质分子量的大小。,洗脱：,从色谱柱上端不断注入缓冲液，,促使蛋白质分子的差速流动。,1.,凝胶色谱法（分配色谱法）,缓冲液,洗脱剂,组成：,配制：,作用：,由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。,如,H,2,CO,3,/NaHCO,3,，,HC/,NaC,，,NaH,2,PO,4,/Na,2,HPO,4,等,调节酸和盐的用量，可配制不同,pH,的缓冲液。,在一定范围内，抵制外界酸和碱对溶液,pH,的干扰而保持,pH,稳定。,本课题所选用的缓冲液是磷酸缓冲液，其,目的是模拟细胞内的环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察颜色（红色）和科学研究（活性）,1.,凝胶色谱法（分配色谱法）,用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质,(),A,路程较长，移动速度较慢,B,路程较长，移动速度较快,C,路程较短，移动速度较慢,D,路程较短，移动速度较快,相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个,2.,电泳法,概念：,指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离,的基团，在一定的,PH,下，这些基团会带上正电或负电。,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相,反的电极移动。,电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及,分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁,移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,类型：,琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳,十二烷基磺酸钠（,SDS,）,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶,由单体丙烯酰胺和交联剂,N,N-,甲叉双丙烯酰胺在引发,剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。,作用,测定蛋白质分子量。,原理,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带,静电荷的多少,以及,分子的大小,等因素。,十二烷基磺酸钠（,SDS,）,聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS,作用,为了消除,静电荷对迁移率的影响,可以在凝胶中加入,SDS,。,SDS,作用机理,SDS,能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在,SDS,的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。,SDS,能与各种蛋白质形成蛋白质,SDS,复合物，,SDS,所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。,二,.,实验操作,血红蛋白的提取和分离,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定,二,.,实验操作,血红蛋白的提取和分离,1.,样品处理,思考,1,：鸟类的血液和哺乳动物血液中最好用哪种血,液提取血红蛋白？为什么？,鸟类（如鸡）的红细胞有细胞核、含,DNA,，便于,DNA,的提取,哺乳动物的红细胞无细胞核，结构简单，血红,蛋白丰富，便于血红蛋白的提取,二,.,实验操作,血红蛋白的提取和分离,1.,样品处理,思考,2,：回忆血液的组成？,血液,血浆,水 分,其他物质：,血浆蛋白、,无机盐、磷脂、葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞,（最多）,血红蛋白,（,90,）,二,.,实验操作,血红蛋白的提取和分离,1.,样品处理,思考,3,：血红蛋白有什么结构,和功能,血红蛋白,两个,肽链,两个,一,肽链,四个亚铁红素基团,结构,亚铁血红素使血液呈红色，每个肽链环绕一个亚铁基团，此基团可携带一分子的,O,2,和一分子的,CO,2,功能,二,.,实验操作,血红蛋白的提取和分离,1.,样品处理,红细胞洗涤,目的：,去除杂蛋白，利于血红蛋白的分离、纯化,方法：,离心,过程：,血液柠檬酸钠低速短时离心吸出上层血浆红细胞,5,倍体积生理盐水 缓慢搅拌,10min,低速短时离心,吸出上清液反复洗涤直至上清液无黄色,注意：,洗涤次数不能太少，至少三次,低速短时离心（若要高速长时离心，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）,初次离心后的结果,3,次洗涤后的结果,二,.,实验操作,血红蛋白的提取和分离,1.,样品处理,血红蛋白的释放,方法：,吸水胀破,过程：,洗好的红细胞加蒸馏水到原有血液体积加,40%,体积的甲苯搅拌器充分搅拌,10min,红细胞破裂，释放血红蛋白,二,.,实验操作,血红蛋白的提取和分离,1.,样品处理,分离血红蛋白溶液,方法：,离心分离,过程：,红细胞破碎混合液中速长时离心（,2000c/min10min,）,分层（如图）滤纸过滤除去脂质分液漏斗分离出,血红蛋白，,得到红色透明液体。,无色透明的甲苯层,白色,脂溶性物质沉淀层,血红蛋白溶液 （红色透明液体）,红细胞破碎物沉淀（暗红色沉淀物）,分离过程,红细胞,混合液,高速离心,10min,离心管,滤纸,过滤,脂类,物质,烧杯,1.,样品处理,分离血红蛋白溶液,二,.,实验操作,血红蛋白的提取和分离,二,.,实验操作,血红蛋白的提取和分离,2.,粗分离,透析,目的：,除无机盐离子和小分子有机物,过程：,1ml,血红蛋白溶液装入透析袋放入,300ml20mol/LPH=7,的磷酸缓冲液中透析,12h,原理：,半透膜具有半透性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜,透析过程动画演示,利用透析袋透析,二,.,实验操作,血红蛋白的提取和分离,3.,纯化,凝胶色谱操作,（,1,）制作凝胶色谱柱,取长,40,厘米，内径,1.6,厘米的玻璃管，,两端需用砂纸磨平。,底塞的制作：,打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用,100,目尼龙纱包好，插到玻璃管的,一,端,。,注意事项,：,底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难,以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。,顶塞的制作：,打孔安装玻璃管,。,组装：,将上述三者按相应位置组装成一个整体,。,安装其他附属结构。,二,.,实验操作,血红蛋白的提取和分离,3.,纯化,凝胶色谱操作,（,2,）凝胶色谱柱的装填,材料：,交联葡萄糖凝胶,G75,；,20mol/L,磷酸缓冲液,意义：,G,表示交联程度，膨胀程度及分离范围,75,表示凝胶得水值得,10,倍,二,.,实验操作,血红蛋白的提取和分离,3.,纯化,凝胶色谱操作,（,2,）凝胶色谱柱的装填,步骤,操作要求,操作要求,色谱柱垂直固定在支架上,计算称量凝胶,根据色谱柱体积计算凝胶用量,配制悬浮液,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,凝胶颗粒洗脱液沸水浴,装填悬浮液,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,缓冲液洗涤平衡,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡,12h,装配好的凝胶柱,二,.,实验操作,血红蛋白的提取和分离,3.,纯化,凝胶色谱操作,（,2,）凝胶色谱柱的装填,凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙；,配制悬浮液时，沸水浴法时间短，还能去除微生物,和气泡；,不得有气泡存在，气泡会扰乱洗脱液中的蛋白质的,洗脱次序，降低分离效果；,洗涤平衡时，液面不要低于凝胶表面，否则可能有,气泡混入；,不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。,注意：,二,.,实验操作,血红蛋白的提取和分离,3.,纯化,凝胶色谱操作,（,3,）样品的装入和洗脱,（,1,）,调节缓冲液面：,打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降,到与凝胶面平齐，关闭出口,。,（,2,）滴加透析样品：,吸管吸,1ml,样品加到色谱柱的顶端，滴加,样品时，吸管管口,贴着管壁环绕移动加样，同时注意不,要破坏凝胶面。,（,3,）样品渗入凝胶床：,加样后打开下端出口，使样品渗入凝,胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。,（,4,）洗脱：,小心加入,pH=7.0,的,20mmol/l,的磷酸缓冲液到适当,高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。,（,5,）收集：,待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集,流出液，每,5ml,收集一试管，连续收集（在分离过程中，,如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）,课题3 血红蛋白的提取与分离（II）,3.,样品的加入和洗脱,（,3,）样品加入与洗脱,注意：,正确的加样操作是：,1,、不要触及并破坏凝胶面。,2,、贴壁加样。,3,、使吸管管口沿管壁环绕移动。,收集得到的纯化后的蛋白,二,.,实验操作,血红蛋白的提取和分离,4.,纯度鉴定,方法：,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳（可分离、可鉴定）,分离 鉴定,标样,样品,使用,SDS-,聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于,A,电荷的多少,B,分子的大小,C,肽链的多少,D,分子形状的差异,在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是,A,、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果,B,、气泡阻碍蛋白质的运动,C,、气泡与蛋白质发生化学反应,D,、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密,A,样品的加入和洗脱的操作不正确的是,A,加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面,B,加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内,C,等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口,D,用吸管小心的将,1ml,透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面,A,下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（）,A,可采集猪血作为实验材料,B,用蒸馏水重复洗涤红细胞,C,血红蛋白释放后应低速短时间离心,D,洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液,A,选用红细胞作分离蛋白质的实验材料，下列是其优点的是,(ABC ),多,A,血红蛋白是有色蛋白,B,红细胞无细胞核,C,红细胞蛋白质含量高,D,红细胞,DNA,含量高,下列操作正确的是（,D,）,A.,分离红细胞时采用低速长时间离心,B.,红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可,C.,分离血红蛋白溶液是低速短时间离心,D.,透析时要用,20mmol/l,的磷酸缓冲液，透析,12h,下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是,(),多,A,采集血样后要高速短时问离心获得血细胞,B,洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。,C,在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白,D,释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂质分离开来,BCD,