荧光光谱的原理与运用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,荧光光谱法,概述,基本原理,荧光分析方法,荧光法的应用,荧光,当某种,常温物质,经某种,波,长的入射光（通常是,紫外线或,X,射线,）照射，吸收光能后进入,激发态,，并立即退激发并发出比,入射光,的波长,长的出射光,（通常波长在可见光波段）；且一旦停止入射光，发光现象也随之,立即消失,。,如右图为,含有奎宁的通宁水在紫外线的照射下发出荧光,。,荧光的分类,自发荧光,诱发荧光,物质经过,紫外线,照射后发出荧光的现象可分为两种情况,:,如,叶绿素,、,血红素,等经紫外线照射后，能发出红色的荧光,物体经,荧光染料,染色,后再通过紫外线照射发出荧光,荧光分析法,荧光分析是指利用某些物质在被短波长光（一般为,紫外光,）激发后产生荧光的,特性及其强度,进行物质的,定性和定量,的分析的方法。,荧光光谱法的特点,灵敏度高,最低检出限：质量分数,10,-6,10,-9,数量级，适用于痕量物质检测,灵敏度比紫外,-,可见分光光度法约高,24,个数量级,选择性好,只要利用单色器控制激发光和荧光的波长，通过前后两次波长的选择，可得到比吸收光度计更强的选择性。,应用还不够广泛，尚待拓宽,多数物质本身不会产生荧光，一些物质在加入某种试剂后能够产生荧光；对环境因素（温度，酸度、溶解氧）极为敏感,荧光分析法的基本原理,（,1,）分子的激发,基态,激发态,(,S,1,、,S,2,、激发态振动能级）,单重态,：分子中所有电子自旋,都配对,的电子状态,三重态,：有,两个,电子的自旋,不配对,而平行的状态,1.,分子的激发与失活,1.,分子的激发与失活,（,2,）分子的失活,处于,激发态,的分子很不稳定，可能经过,辐射跃迁,和,非辐射跃迁,的衰变过程而返回,基态,。,辐射跃迁,非辐射跃迁,荧光,磷光,振动松弛,内转化,系间窜越,l,2,l,1,l,3,l,2,T,1,S,0,S,1,S,2,荧光,磷光,系间窜越,内转化,内转化,系间窜越,振动松弛,2.,分子内的激发和衰变过程,振动弛豫：,由于分子间的碰撞，激发态分子由,同一电子能级中,的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。,激发态分子常常首先发生振动驰豫。,内转换：,相同多重态的两个电子能级间，,电子由高能级回到低能级的分子内过程。,无辐射跃迁,系间窜越：,激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的,多重态发生变化,的过程。含有重原子的分子中（如,I,、,Br,等），系间窜跃最常见。,外转换：,激发态分子,与溶剂或其他溶质相互作用,和能量转换而使荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。,荧光强度的减弱或消失，称为,荧光熄灭或猝灭。,辐射跃迁,荧光：,受光激发的分子经振动驰豫、内转换、振动驰豫到达,第一电子激发单重态的最低振动能级,，以辐射的形式失活回到基态，发出荧光。,由于无辐射使分子吸收的能量有部分损失，因此荧光的能量比吸收的能量小，即,荧光波长一般比激发光波长长。,磷光：,若第一激发单重态的分子通过系间窜跃到达第一激发三重态，再通过振动驰豫转至该激发的最低振动能级，然后以辐射的形式回到基态，发出的光线称为磷光。,由于激发三重态能量较激发单重态低，,所以,磷光的波长比荧光的波长稍长。,磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测到。因此磷光很少应用于分析。,3,.,荧光产生的过程：,（,1,）处于,基态最低振动能级,的荧光物质分子受到紫外线的照,射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到,第一电子激发态,的各个振动能级；,（,2,）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过,无辐射跃迁,降落到,第一电子激发态的最低振动能级,；,（,3,）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降,落到,基态的各个不同振动能级,，同时发射出相应的光量子，这就是,荧光,；,（,4,）到达基态的各个不同振动能级的分子再通过无辐射跃迁最后回到,基态的最低振动能级,4.,荧光与结构的关系,电子跃迁类型,*,的荧光效率高，系间窜跃至三重态的的速率常数较小，有利于荧光的产生。,共轭效应,含有,*跃迁能级的,芳香族化合物,的荧光最常见且最强。具有,较大共轭体系,或,脂环羰基结构,的脂肪族化合物也可能产生荧光。,荧光产生的过程：,（,1,）处于,基态最低振动能级,的荧光物质分子受到紫外线的照,射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到,第一电子激发态,的各个振动能级；,（,2,）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过,无辐射跃迁,降落到,第一电子激发态的最低振动能级,；,（,3,）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降,落到,基态的各个不同振动能级,，同时发射出相应的光量子，这就是,荧光,：,（,4,）到达基态的各个不同振动能级的分子再通过无辐射跃迁最后回到,基态的最低振动能级,2.,分子产生荧光必须具备的条件,（,1,）分子必须,具有,与所照射的辐射频率,(,紫外,-,可见光）,相适应的结构,（共轭,键），才能吸收激发光,（,2,）吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须,具有一定的荧光量子产率,。,（,1,）荧光与结构的关系,电子跃迁类型,*,的荧光效率高，系间窜跃至三重态的的速率常数较小，有利于荧光的产生。,共轭效应,含有,*跃迁能级的,芳香族化合物,的荧光最常见且最强。具有,较大共轭体系,或,脂环羰基结构,的脂肪族化合物也可能产生荧光。,取代基效应,：苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生；而给电子基会使荧光增强。,化合物,相对荧光强度,荧光波长,/nm,C,6,H,6,（苯）,10,270310,C,6,H,5,COOH,C,6,H,5,NO,2,3,0,310390,C,6,H,5,CH,3,C,6,H,5,OH,C,6,H,5,OCH,3,C,6,H,5,NH,2,C,6,H,5,CN,17,18,20,20,20,270320,285365,285345,310405,280360,C,6,H,5,Cl,C,6,H,5,Br,C,6,H,5,I,7,5,0,275345,290380,平面刚性结构效应,可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。,（,2,）荧光量子产率,物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（,）,表示：,与失活过程的速率常数,k,有关：,凡是使荧光速率常数,k,f,增大而使其他失活过程（系间窜越、外转换、内转换）的速率常数减小的因素（环境因素和结构因素）都可使荧光增强。,3.,荧光强度与浓度的关系,荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度,（,F,）,与,荧光物质的吸光程度,发射荧光的能力,有关：,F=K,（,I,0,I,）,I,0,入射光辐射强度；,I,透射光辐射强度；,K,取决于荧光量子产率（,）。,Lambert-Beer,定律：,=,溶液浓度较低时：,当入射光的,1,和,I,0,一定时,：,F=K c,即：,在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度成正比。,这是荧光法定量的基础。,但这种线性关系只有在极稀的溶液中，当,kbc0.05,时才成立。,对于较浓溶液，由于,猝灭现象,和,自吸收,等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。,4.,影响荧光强度的因素,（,1,）内部因素,自猝灭,发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射转移。,自猝灭随溶液浓度的增加而增加。,自吸收,荧光化合物的发射的波长与其吸收的波长重叠，,溶液内部激发态分子所发射的荧光在通过外部溶液时被同类分子吸收，而使荧光被减弱。,荧光强度,F,与光源的辐射强度,I,0,有关，因此,增大光源辐射功率,I,0,可提高荧光测定的灵敏度。,（,2,）环境因素,pH,值,含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与,pH,有关。,pH,的变化影响了荧光基团的电荷状态，从而使其荧光发生变化。,溶解氧,往往使,荧光强度降低,化合物,相对荧光强度,C,6,H,5,OH,18,C,6,H,5,O,0,C,6,H,5,NH,2,20,C,6,H,5,NH,3,+,0,温度,温度降低,会减少碰撞和非辐射失活的概率，,因此会,增加荧光强度,。,荧光分析仪,光源,氙灯,激发单色器,样品池,光电倍增管,数据处理,仪器控制,光源,样品池,激发,单色器,检测器,数据处理,仪器控制,发射,单色器,发射单色器,荧光分光光度计与紫外,-,可见分光光度计有何异同点？,荧光分光光度计,扫描激发光谱，选择激发波长,扫描发射光谱,消除干扰,波长范围：,200800nm,最广泛应用的连续光源,光源：,氙灯、,高压汞蒸气灯,单色器：,激发单色器,选择激发光波长,荧光单色器,选择,(,测量,),发射光（荧光）波长，,与激发光入射方向垂直。,样品池：,采用低荧光材料，通常为石英池,检测器：,光电倍增管,荧光法的应用,1.,荧光激发光谱和发射光谱,（,1,）荧光发射光谱：,固定激发光的波长，测量不同荧光波长处荧光的强度，得到荧光光谱，即,荧光强度,荧光波长图,。,（,2,）荧光激发光谱（吸收光谱）：,在荧光最强的波长处测量随激发光波长的改变而变化的荧光强度，得到荧光激发光谱。即,荧光强度,-,激发光波长图。,a.Stokes,位移,激发光谱与发射光谱之间的波长差值,。,荧光,的波长,总是大于,激发光的,波,长，,这是由于振动弛豫和内转换过程损失了一定的能量。,b.,发射光谱的形状与激发波长无关,电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但,均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光,。,c,.,镜像规则,通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）,成镜像对称,关系。,激发光谱与发射光谱的关系,2.,定量分析方法,定量方法：,标准曲线法：,配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。,比较法：,在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，再进行比较。,定量依据：,低浓度时，溶液荧光强度与荧光物质浓度成正比,F=KC,3.,无机物的荧光分析,无机物能够直接产生荧光并用于测定的很少。,可通过与荧光试剂作用生成荧光配合物、或通过催化或猝灭荧光反应进行荧光分析。非过渡金属离子的荧光配合物较多。可用于荧光分析的元素已近,70,种。,荧光试剂是具有两个或以上与,M,Z+,形成螯合物的电子给予体官能团的芳香结构。,OH,N,SO,3,Na,N=N,OH HO,ON,8-,羟基喹啉,石榴,茜素,R,无机化合物的分析：,铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用,荧光分析法,；,氟、硫、铁、银、钴、镍采用,荧光熄灭法,测定；,铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用,催化荧光法,测定；,铬、铌、铀、碲采用,低温荧光法,测定；,铈、铕、锑、钒、铀采用,固体荧光法,测定。,4.,有机物的荧光分析,荧光法在有机化合物中应用较广。芳香化合物多能发生荧光。脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生荧光。,名 称,结 构 式,应 用,9-,蒽基重氮甲烷,某些羧酸,丹磺酰氯,伯胺、仲胺、酚或氨基酸,CH,2,N,2,N(CH,3,),2,SO,2,Cl,锌,(),存在下诺氟沙星与牛血清白蛋白的结合作用,以,ex,=280 nm,，分别加入,NFLX,和,Zn(II,),后，,BSA,的,最大荧光峰位置不变,，但是,荧光强度均降低,，这说明,NFLX,和,BSA,以及,Zn(II,),和,BSA,之间,存在相互作用，发生了能量转移,，可见,NFLX,和,Zn(II,),对,BSA,的均有,荧光猝灭,作用。,鱼腥草中钛含量分析,钛与苯基荧光酮生成 络合物及相应空白的吸收光谱,钛与,苯基荧光酮,生成橙色络合物，最大吸收波长为,5 4 0 n m,，试剂空白的最大吸收 波长为,4 6 0 n m,，故,选定测量波长为,5 4 0 n m,.,鱼腥草中钛含量分析,谢谢！,