薄层色谱法概述.ppt

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,薄层色谱法概述PPT课件,薄层色谱与高效液相色谱的差别（特点）,固定相和流动相,TLC流动相流动靠毛细作用力，流动相选择较少受限制，固定相不用再生。而 HPLC是在封闭的系统内，流动相流量靠泵控制，溶剂选择受检测器限制，固定相需再生。,样品处理,TLC要求没有HPLC严格。,1/30/2026,2,色谱分离,TLC可同时分离多个样品，并可采用相同或不同溶剂进行同向或双相多次展开，通常采用正相色谱，色谱后衍生化方便。,HPLC一次只能分离一个样品，通常采用反相色谱，色谱后衍生化受限制。,对污染物抗受力强,TLC颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸附物质均无影响。,HPLC 颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸附物质均有大的影响。,1/30/2026,3,薄层色谱系统,薄层板,未改性固定相,硅胶为使用最广泛的薄层材料,氧化铝有碱性、中性、酸性,硅藻土为化学中性吸附剂,纤维素天然多糖类,聚酰胺为特殊类型有机薄层材料，对能形成氢键的物质有特别的选择性。,1/30/2026,4,表面改性固定相,疏水改性硅胶化学键合烷基,亲水改性硅胶引入氨基、氰基、二羟基等，薄层板极性介于极性吸附剂和疏水改性剂之间（极性次序：硅胶,氨基,氰基,二羟基,反相）。,表面改性纤维素乙酰化纤维素,药典收载的固定相有：硅胶类、硅藻土类、氧化铝类、微晶纤维素类等。颗粒直径一般要求10 40 um。,1/30/2026,5,载板玻璃板，放在饱和碳酸钠溶液中浸泡数小时，除去玻璃表面的油污。然后充分漂洗干净，干燥，置干燥器中备用。要求光滑、平整、洗净后不附水珠。,黏结剂,无机黏结剂石膏（硫酸钙），添加石膏的吸附剂以字母“G”表示。没有黏结剂的吸附剂以字母“H”表示。无机黏结剂的优点是：耐高温，耐酸碱，但涂铺薄板动作要快，否则匀浆易凝固。薄层强度差。,1/30/2026,6,有机黏结剂羧甲基纤维素钠（CMC）、淀粉、聚乙烯醇、高分子聚合物等。其特点是薄层强度高、使用方便，但不能用浓硫酸作显色剂。,荧光黏结剂在吸附剂中添加某种荧光指示剂，常用的荧光指示剂,在254nm紫外光下发蓝色荧光的有钠荧光素、硫化镉、阴极绿等。,在366nm有荧光的指示剂如彩蓝等。,含有荧光指示剂的商品吸附剂以“F”表示，并以下标注明其激发光波长。例 硅胶HF,254,1/30/2026,7,薄层板涂铺要求：均匀、平整、无气泡引起的凹坑和龟裂。例：,硅胶板（粒度10 40um）,硅胶G将硅胶置研钵中，加入少量水，研磨均匀，至无结块和气泡，再加入比例量的水(一般为1份固定相与3份水)，迅速研磨均匀，立即涂铺。,硅胶或硅胶G 以CMC为黏合剂。配制0.2%0.7%CMC水溶液,放置过夜,使悬浮的纤维沉降,取上层用来配制吸附剂匀浆。,1/30/2026,8,反相薄层板制备以不同链长的 正构烷烃为固定液,配制成适当浓度的溶液(如5%硅酮油乙醚溶液),浸渍硅胶板。,薄层板活化,涂布后的薄层先在室温下阴干，在使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化，然后置干燥器中备用。不同薄层活化条件略有不同，如：,硅胶 110,1h,氧化铝 110,30min,1/30/2026,9,点样,要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非极性，否则易使斑点扩展。,采用多次点加法，第二次点加时应待前一次点加的溶剂挥发后再进行。,点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差，以最小检测量的几倍,几十倍为宜。,手工点样工具：定容玻璃毛细管（1 5ul），微量注射器。,1/30/2026,10,自动点样,Limomat IV 喷样仪样品溶液通过气流成雾状喷向薄层，移动板台，使在薄层上流下样品条带。,特点：适合于大量稀样品溶液的喷加；条带宽度不超过2mm，有利于改善分辨率；便于狭缝式光密度计扫描；要求薄层板强度高。,自动薄层色谱点样仪由计算机控制。,药典规定：点样基线距底边2.0cm,样点直径2-4mm,点间距离约为1.5-2.0cm。,1/30/2026,11,展开方式,多数采用直线形上行展开，薄层板水平角度以75,为最佳。展开距离一般为10-15cm。,多次展开一次展开未达满意分离时，可将薄层板干燥后再次用同一种溶剂展开，可重复多次，直到混合物分离为止。,分步展开混合物性质差别较大时，一种流动相不能有效分离时，可采用不同溶剂依次展开不同距离。,1/30/2026,12,连续展开使到达薄层上缘的溶剂不断蒸发，连续展开以增加展开距离。因无溶剂前沿，需要有个参照物同时展开，以计算相对保留值。,二维展开在两个垂直的方向上进行展开。将样品点在薄层板的一个角上，展开适当距离后，挥干溶剂，再将薄层板以与原展开方向成90,的方向进行展开。,原点,1,2,1/30/2026,13,分光光度法、HPLC法、GC法、质谱法,溶剂储藏时间和条件对溶剂质量影响，应注意出厂日期。,0cm,样点直径2-4mm,点间距离约为1.,取决于吸附剂和流动相的组成,此外还有：化学键合相反相展开、化学键合相正相展开、离子交换、离子对色谱、凝胶、胶束、手性展开。,实际工作中常常使固定相预吸附一定量单一或混合溶剂蒸气，预吸附量越大，溶剂前沿运动速度越快，物质斑点的Rf值越小。,Rx=Ls/Lr,间接法将部分照射光的能量转换成较长波长的荧光，即荧光测量。,对于易挥发的溶剂，难于配制稳定组成的流动相。,不同薄层活化条件略有不同，如：,无机黏结剂的优点是：耐高温，耐酸碱，但涂铺薄板动作要快，否则匀浆易凝固。,3 环己烷 0.,在TLC中斑点的移动与扩散是二维的，因为斑点在展开方向和与之垂直方向上的扩散速度是不相等的，展开剂的移动速度也是不等的，在单位体积或单位质量薄层内所含的溶剂量越接近溶剂前沿减少得越明显，直至溶剂前沿时为零，这一现象称为“溶剂的体积梯度”，在各种展开形式中均存在。,单光束双波长对背景不均匀引起的干扰有补偿作用，选择的两个波长应接近些。,疏水改性硅胶化学键合烷基,硅胶为使用最广泛的薄层材料,有机黏结剂羧甲基纤维素钠（CMC）、淀粉、聚乙烯醇、高分子聚合物等。,氧化铝 110 30min,离心展开薄层板以适当转速旋转时，流动相以适当速率转移到薄层上。该技术主要用于制备色谱。,锲尖技术圆形离心展开具有分辨率高的优点，但需要有一定的仪器装置。采用锲尖技术可以在一般的展开室中进行类似展开。,薄层被刮掉部分,溶剂前沿,1/30/2026,14,检测,物理方法紫外光下显示荧光或荧光淬灭,化学方法加化学试剂显色，要求显色稳定、持久、专属、灵敏、线性良好。,斑点定位方法,碘蒸气法灵敏、简便，为通用显色法。将碘结晶放在密封的展开缸中，碘的升华，使缸内充满紫色的碘蒸气。将展开后的板挥干溶剂置碘缸中至薄层色谱上出现棕色斑点。放置时间不宜太长，否则背景吸附剂也吸附碘，使信噪比降低。用针头将斑点标记下来，放在通风处使碘挥发。,1/30/2026,15,薄层色谱参数,保留参数（Rf值）,用来表征斑点位置的基本参数是保留因子，通常称作比移值，用Rf表示。,R,f,=Ls/L。，,原点,S,R,W,Ls,L。,Lr,原点,参比,样品,前沿,1/30/2026,16,Limomat IV 喷样仪样品溶液通过气流成雾状喷向薄层，移动板台，使在薄层上流下样品条带。,展开方法使用直线化功能定量时，为避免展开距离不同产生的误差，实际定量时，将已知浓度的标准品在同一块板上展开是较理想的。,展开距离一般为10-15cm。,展开过程中用不同于展开剂的溶剂调节槽内气氛,对于易挥发的溶剂，难于配制稳定组成的流动相。,硅胶为使用最广泛的薄层材料,薄层色谱定量测定的光学方法是基于测量斑点和薄层空白处光学响应信号的差值。,当然，对于这一问题实际上只是在定量斑点浓度时才需要考虑。,二维展开在两个垂直的方向上进行展开。,荧光黏结剂在吸附剂中添加某种荧光指示剂，常用的荧光指示剂,注意：,同一物质在不同展开方式中得到的比移值是不相同的。,在同样溶剂的重复n次的多次展开后的比移值(R,f,),n,=1-(1-Rf),n,。,相对比移值（Rx）,Rf测量中一个重要的误差来源是难以确定溶剂前沿的位置，因此，引入相对比移值（Rx）。,Rx=Ls/Lr,1/30/2026,17,分离效能参数,理论塔片数 n=16Ls/W,2,，考虑静态扩散引起的起始斑点半峰宽的影响引入真实塔片数（n,真实,）,n,真实,=5.54Ls/（b,0.5,-b,0,）,2,b,0.5,为样品斑点半峰宽，b,0,样品起始斑点半峰宽。,塔片高度h,真实,=,Ls/n,真实,1/30/2026,18,容量因子（k）与比移值（Rf）,k=t,s,/t,m,（物质在两相中滞留时间之比）,又k=K（Vs/Vm）,R,f,=Vm/（Vm+KVs）=1/（1+k）,k,9 4 2 1 0.5 0,R,f,0 0.1 0.2 0.33 0.5 0.67 1,1/30/2026,19,分离参数,R=,因Ls=R,f,L。，同时对相邻的两个斑点，假定W,1,=W,2,=W,则R=L。=Rf,与n=16Ls/W,2,式合并，得：,2(Ls2-Ls1),W1+W2,R,f,2-R,f,1,W,L。,W,1/30/2026,20,R=,由上式，,Rf与,R之间存在着如图所示关系,4,Rf,Rf1,0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 Rf1,R,1.00,0.75,0.5,0.25,0,Rf=0.3,R最高,Rf在0.2-0.5,R变化不大,Rf0.1或0.7,R下降,1/30/2026,21,流动相与展开体系,液-固吸附 在该色谱中，溶质的保留和分离选择性决定于三个因素：,溶,解,能,力,流动相,溶质,吸附,剂,相互作用,竞争,1/30/2026,22,液-液分配,基于组分在互不相溶的两相间的溶解度不同而实现分离的一种展开系统。可在展开前，将薄层板浸入某种液体固定相。实际上在TLC中，分配与吸附是并存的（大气中水分也是一种固定相）。,此外还有：化学键合相反相展开、化学键合相正相展开、离子交换、离子对色谱、凝胶、胶束、手性展开。,1/30/2026,23,溶剂强度参数和选择性,溶剂的强度参数,定义：溶剂强度参数用,表示。流动相强度越高，表示它与吸附剂相互作用力强。溶质的R,f,值就越大。为得到满意的分离，选用的流动相使溶质的Rf值在0.3 0.7之间为宜。,溶剂强度也可用其在水中的溶解度参数,来表示。,1/30/2026,24,一些常用溶剂的溶剂强度与溶解度参数,溶剂,溶剂,正己烷 0.01 7.3 环己烷 0.04 8.2,苯 0.32 9.2 乙醚 0.38 7.4,二氯甲烷 0.42 9.6 正丙醇 0.82 10.2,正丁醇 0.70 /四氢呋喃 0.57 9.1,乙酸乙酯 0.58 8.6 氯仿 0.40 9.1,甲乙酮 0.51 /二氧六环 0.56 9.8,吡啶 0.71 10.4 丙酮 0.50 9.4,乙醇 0.88 /乙酸 1.00 12.4,二甲亚砜 0.75 12.8 甲醇 0.95 12.9,乙二醇 1.11 14.7 甲酰胺 /17.9,1/30/2026,25,流动相选择时需考虑溶剂的下列情况,一些溶剂如氯仿、乙醚一般含有微量乙醇作保护剂，有时需重蒸除去乙醇。,许多溶剂有吸湿性，使溶剂含水量不一致，导致实验难以重现。,溶剂储藏时间和条件对溶剂质量影响，应注意出厂日期。,混合流动相组分之间（或杂质）可能发生相互作用。,对于易挥发的溶剂，难于配制稳定组成的流动相。要求操作格外小心，同时混合流动相不应重复使用。,1/30/2026,26,溶剂的选择性,指溶剂引起两种溶质位移差别的能力，即分离度。,R=1/4（,-1）,k/（,k+1）,分离因子,=,k1/k2，k为k1和k2的平均值,由上式可见，R取决于三个因子：,理论塔片n主要是吸附剂性质的函数,k 反映了两种溶质的平均迁移速度，其由流动相溶剂强度,决定,取决于吸附剂和流动相的组成,1/30/2026,27,溶剂优化规则：,增加溶剂强度，使Rf值增大，但也可能降低分离能力。,流动相中较强组分的体积比小于5%或大于50%，选择性最大，此时最有利于溶质与流动相组分的选择性相互作用。,用乙醚或甲醇代替流动相中的一种较强组分，由于形成氢键可改善选择性。,若出现斑点拖尾，可向流动相中加少量水，或降低薄层活性，有利于改善分离。,也可采用两种强溶剂与一种弱溶剂组成的三元混合流动相，此时，溶剂强度由弱溶剂控制，而溶剂选择性则由两强溶剂控制。,1/30/2026,28,斑点的扩散与形状,在TLC中斑点的移动与扩散是二维的，因为斑点在展开方向和与之垂直方向上的扩散速度是不相等的，展开剂的移动速度也是不等的，在单位体积或单位质量薄层内所含的溶剂量越接近溶剂前沿减少得越明显，直至溶剂前沿时为零，这一现象称为“溶剂的体积梯度”，在各种展开形式中均存在。当然，对于这一问题实际上只是在定量斑点浓度时才需要考虑。,1/30/2026,29,同时一种成分的色谱行为会受到混合物中其他成分的影响，这种影响的大小取决于混合成分的种类、浓度、以及斑点间的距离等。这种影响一般使分配系数变小。如两个相邻斑点中后面的一个展开速度较其单独展开时为大。,1/30/2026,30,固定相的活度及其调节,在其他因素一定时，活度增加，Rf值减少，反之亦然。可通过预吸附溶剂分子，调节其表面活性。例如可将活化薄层板放在相对湿度恒定的空间里来达到调节活度的目的。,实际工作中常常使固定相预吸附一定量单一或混合溶剂蒸气，预吸附量越大，溶剂前沿运动速度越快，物质斑点的Rf值越小。,预吸附还可能影响Rf在0.6-1.0之间的斑点的分离。,1/30/2026,31,在层析过程中发生的边缘效应就是由于这种因素引起的。尤其是使用混合溶剂时，极性较弱和沸点较低的溶剂，在薄层边缘容易挥发，使边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例增大，Rf相对增大。同一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf值比边缘的Rf值小，即边缘效应，若在展开前先将展开槽与薄层板用展开剂蒸气饱和后再展开，边缘效应可消失。采用双槽层析缸尤为有利。,1/30/2026,32,预吸附中,展开中,展开过程中用不同于展开剂的溶剂调节槽内气氛,1/30/2026,33,薄层扫描,原理,薄层定量方法可分为,直接法测定照射光照射色谱后，因被测物斑点的存在引起的透射光和反射光的变化。并通过随行标准比较待测斑点的量。,间接法将部分照射光的能量转换成较长波长的荧光，即荧光测量。,薄层色谱定量测定的光学方法是基于测量斑点和薄层空白处光学响应信号的差值。,1/30/2026,34,一强度为I的光照射薄层时，被照射的一面为“近表面”，另一面为“远表面”。,近表面,远表面,光（I）,镜反射或表面反射I,s,(表面平滑),漫反射,(表面粗糙),入射强度I,0,出射强度(I,T,),I,T,/I,0,为薄层透射率A,T,返回光强(I,R,),I,R,/I,0,为介 质的漫反射率A,R,I,0,-（I,R,+I,T,）=差为被介质吸收并转换为热的光强,1/30/2026,35,光学系统,薄层色谱扫描仪光学系统有三种,单光束单波长受光源稳定性和薄层质量影响严重。,单光束双波长对背景不均匀引起的干扰有补偿作用，选择的两个波长应接近些。,双光束单波长可补偿光源不稳引起的误差，但对板层不均匀无作用。,光,单色器,检测器,光,波长1,波长2,检测器,斩波器,光,单色器,分,光,镜,检测器,检测器,1/30/2026,36,透射光法,测定组分对应的斑点对特定波长光的吸收度来确定含量。将薄层板从左至右移动，对斑点扫描，单色光透过薄层板后被记录下来，将测得的吸收度对Rf值绘制扫描曲线，得薄层色谱图,光源,单色器,1/30/2026,37,反射光法,一定波长的光照射薄层，穿进薄层内的光部分被薄层吸收，部分经过漫反射又折回表面成为反射光。当对薄层进行扫描时，测量其反射吸收度，可得到反射光谱。反射吸收度与物质含量有确定关系，可进行定量。,光源,单色器,1/30/2026,38,扫描方式,直线式扫描照射在薄层板上的光束与薄层板作直线相对运动。光束固定，扫描板台运动。光束落在薄层上的截面为一长方形带。,锯齿式扫描照射在薄层板上的光束与薄层板的相对运动轨迹呈锯齿形或矩形。,直线扫描,锯齿扫描,轮廓曲线,积分曲线,1/30/2026,39,斑点,斑点,A B C,A,B,C,C,A,B,对于不规则斑点，两种扫描结果不一样。同一斑点从A、B、C三个不同方向扫描，锯齿扫描所得积分值变动小，而直线扫描所得积分值变动大。,1/30/2026,40,测量方式,吸光度测量测定的是漫反射光。适合于本身有颜色或有紫外吸收的物质。,I,0,I,R,检 测 器,1/30/2026,41,荧光测量灵敏度较吸光度测量高，板层不吸收发射光，测量噪音小，基线稳定。为消除激发光的影响，在板层和检测器之间必须加一块滤光片，以截去反射激发光，只让发射的荧光抵达检测器。,滤光片,荧光,检 测 器,1/30/2026,42,荧光淬灭测量吸附剂有荧光，样品斑点无荧光，在紫外光照射下，被测物在荧光背景上显示出暗灰斑点。本法适合于本身无颜色，又无特征紫外吸收或荧光的物质。该测量技术有三种形式：,测荧光,测紫外光,测紫外和荧光,1/30/2026,43,扫描仪,机械扫描仪可进行吸光度和荧光测量，以反射测量方式为主，也有能提供透射测量方式的（主要用于电泳谱图扫描测量）。,高速扫描系统可分为两类,光栅扫描系统,位敏扫描系统,这类扫描仪技术上一些问题还未解决。,1/30/2026,44,扫描定量中的标准曲线校正,薄层板上由于光被吸附剂散射，不能得到象通常溶液测定时的吸光度和浓度之间的简单直线关系。即物质浓度越大，薄层试样板上测定的反射吸光度比直线关系所示值越低。扫描仪系统设计时考虑到这一问题，采用微机处理使标准曲线直线化。在理论曲线上选择吸光度0 1之间的7个点，将各吸光度值转换为直线上的值，得到一条通过原点的直线。,1/30/2026,45,吸光度,1.0,0,物质量,经变换后的直线,理论曲线,直线化方法示意图,校正过度,校正适当,校正不足,未校正,试样量,积分值,校正情况判断,1/30/2026,46,使用直线化功能时的注意事项,发色试样的测定对于没有吸收的试样进行发色测定时，一般不使用直线化功能就可以得到近似的直线关系。,试样变质时试样展开后，应马上进行测定，如果放置一星期后再测定。即使近似地呈直线状也往往不能通过原点，认为是试样变质所引起的。,展开距离同一试样等量点样，同样展开，展开距离不同将引起误差。,展开方法使用直线化功能定量时，为避免展开距离不同产生的误差，实际定量时，将已知浓度的标准品在同一块板上展开是较理想的。,1/30/2026,47,定性、定量方法,定性方法,利用保留值,测定Rf值,测定相对Rf值，即Rx值。,利用二维色谱（改变色谱条件，比较Rf值是否一致）,s,b1,b2,b2,s,b1,s,b1,b2,点样,第一次展开,第二次展开,1/30/2026,48,通过板上化学反应,反应后生成特征颜色的化合物,反应后生成复杂的混合物，根据生成物的“指纹”特征加以鉴定。,可用于定性的板上反应有：乙酰化、浓硫酸脱水、偶氮化、酯化、卤化、酸碱水解、硝化、氧化还原、热解和光化学反应等。通过加热、喷雾等方法施加反应试剂。,1/30/2026,49,通过板上光谱图定性,直接测定薄层板上斑点的紫外或可见吸收光谱图，与平行点加的标准斑点的图谱对照。,可建立标准条件下的化合物的光谱图库，用计算机检索定性。,与其他技术连用,TLC-付里叶变换IR联用,TLC-MS联用,1/30/2026,50,定量方法,间接定量将薄层分离后物质斑点定量地洗脱下来，再对洗脱液定量。,分光光度法、HPLC法、GC法、质谱法,直接定量,斑点面积测量用透明纸覆盖在薄层表面，描出斑点界限，然后测量其面积。,目测法比较系列标准与样品的斑点面积大小、颜色深浅，得到样品的含量范围。,薄层仪扫描定量,1/30/2026,51,定量计算,归一化法、内标法、外标法,方法认证,稳定性考察在采样、样品预处理、贮存、展开，展开后处理等过程中的样品稳定性。,线性与范围相应于待测组分检出量的20%-120%范围。,灵敏度通常以标准曲线的斜率表示。,1/30/2026,52,