蛋白质组学实验.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,植物蛋白质组学实验,范海延 教授,Email:hyfan74,1,2,3,蛋白质组学简介,蛋白质组学研究的技术路线,双向电泳实验,目 录,PROTEOME,：,PROTE,in,与,gen,OME,的杂合,蛋白质组学是研究活细胞内基因组编码的全部蛋白质功能的科学。它是功能基因组学的“中流砥柱”，是联系基因组序列与细胞功能的重要学科。,Proteome,包括了一个基因组、一种生物或一种细胞,/,组织所表达的全套蛋白质。,一门交叉学科,物理学,数学,化学,计算机科学,生物信息学,基因组 转录组 蛋白组,蛋白质组学的概念,1,.,植物蛋白质组学简介,双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术和质谱技术,被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。,2,.,技术路线和研究技术,蛋白质组学的研究技术,生物学问题的提出,实验模型,的设计,实验组和对照组,样品的制备,蛋白样品的,IEF,和,PAGE,电泳分离,图像扫描和初步分析,感兴趣,蛋白点,的切取,胰酶对脱色后蛋白质的消化,质谱的多肽指纹图、微测序分析,质谱结果的生物信息学分析和比对,鉴定差异蛋白质,其它实验的进一步验证,蛋白信息的初步获得,蛋白质的功能,蛋白质的表达,亚细胞定位,相互作用,技术路线,ExPASy,(Expert Protein Analysis System),数据库,expasy.org/tools/,几乎涵盖了所有蛋白质组学分析工具。如：,ProtParam,(,expasy.org/tools/protparam.html,),软件能检索蛋白质序列理化参数,PredictProtein,（,www.predictprotein.org/,）蛋白质序列和结构预测服务网站,KEGG,数据库,（,www.genome.jp/kegg,）,全球影响力最大的代谢数据库之一,生物信息学分析,2,.,技术路线和研究技术,3,.,双向电泳实验,细胞破碎,蛋白沉淀,蛋白溶解,去除杂质,防止蛋白水解,样品制备,第一向电泳,IEF,等电聚焦,第二向电泳,SDS-PAGE,染色,定量,平衡,选择胶条,IPG,胶条,重泡胀,电泳,选择凝胶,灌胶,将,IEF,胶条,移至第二向,电泳,图像分析,图像采集,斑点检测,背景消减,凝胶匹配,数据分析,2,-,DE,实验基本步骤,样品制备,3,.,双向电泳实验,TCA/acetone,法,取,1g,植物叶片，液氮冷冻研磨，加,5m,L含,0.2%DTT,和,20%TCA,的冷丙酮溶液匀浆，放置于,-20,冰箱过夜。之后,4,下,13000rpm,离心,30min,，弃上清液，沉淀用含,0.2%,的丙酮溶液清洗三次,(,每次均放于,-20,冰箱沉淀,1h),。最后沉淀冻干，放于,-80,冰箱待用。,通常可采用细胞或组织中的,全蛋白质组,分进行蛋白质组分析。也可以进行样品,预分级,，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。,P,EG,分级沉淀法,：由于,PEG,分子在溶液中可形成网状结构，与溶液中的蛋白质分子发生空间排斥作用，使蛋白质分子凝集、沉淀。蛋白质的分子量越大，将蛋白沉淀所需的,PEG,浓度越小；,PEG,的分子量越高，沉淀蛋白所需的浓度越低。,样品制备,3,.,双向电泳实验,3,.,双向电泳实验,聚乙二醇（,PEG,）分级沉淀法,取黄瓜叶片,2 g,，液氮冷冻研磨，加入,10 mL,预冷的,Mg,NP-40,蛋白质提取液，混匀，,4,下,13000 g,离心,15 min,，弃沉淀，上清液加入预冷的,50%(w/v)PEG,储备液，使,PEG,终浓度为,8%,，冰浴,30 min,，,2000 g,离心,10 min,，所得沉淀为,F2,；上清液继续加入预冷的,50%PEG,储备液，使,PEG,终浓度分别为,16%,，冰浴,30 min,，,13000g,离心,15 min,，所得沉淀为,F3,；上清液继续加入预冷的,50%(w,v)PEG,储备液，使,PEG,终浓度为,24%,，冰浴,30 min,，,13000g,离心,15 min,，所得沉淀为,F4,；上清液加入,4,倍体积的,TCA/,丙酮溶液，,4,下,20000g,离心,15 min,，得到的沉淀部分为,F5,，弃上清液。,所得的,F1,、,F2,、,F3,、,F4,、,F5,分别用,TCA,丙酮溶液和,80%,丙酮溶液洗涤至色素完全去除，最后沉淀冻干，放于,-80,冰箱待用。,消除蛋白质疏水基团之间的相互作用，增强蛋白质在其,pI,值处的溶解性。,兼性离子型去污剂：,CHAPS,，浓度,2-4%,；,SB3-10,、,ASB-14,非离子型去污剂：,NP-40,和,Triton-X-100,阴离子型去污剂：,SDS,，浓度低于,0.25%,离液剂,也称变性剂，主要为尿素（,urea,）和硫尿（,Thiourea,），破坏蛋白分子间形成的氢键，防止由氢键引起的蛋白质聚集及蛋白迁移中二级结构的形成。,表面活性剂,增加样品溶解性的手段,代替盐离子，促进蛋白质溶解，吸附高浓度尿素在溶液中形成的氰酸盐离子，离心时还有助于核酸的沉淀。,IPG buffer3-10,或,pH5-8,和,pH8-10,按,2,:,1,混合。,还原剂,主要是断裂蛋白质分子中半胱氨酸（,Cys,）残基之间形成的二 硫键，增加蛋白质的溶解性。,-,巯基乙醇,DTT,浓度,20-100mmol/L,TBP,(,非巯基还原剂，三丁基膦,),，浓度,2mmol/L,载体两性电解质,Reagent,9.5,M,U,rea,2M Thiourea,1%,DTT,2mM TBP,4%CHAPS,0.2%,C,arrier ampholytes,0.25%Tween 20,10mM PMSF,10%Glycerol,0.0002%,B,romophenol blue,ddH,2,O,裂解液,蛋白质,浓度检测,3,.,双向电泳实验,Bio-Rad RC DC Protein Assay,微离心管检测方法,Bradford,检测法,考马斯亮蓝,G-250,法,Lowry,检测法,+,pH 3,pH 7.5,pH 10,+,pH 3,pH 7.5,pH 10,+,pH 3,pH 7.5,pH 10,+,pH 3,pH 7.5,pH 10,1-D Isoelectric Focusing Theory,第一向等电聚焦操作步骤,1.,从,-20,冰箱取出保存的,IPG,预制胶条（,7cm pH3-10,），室温放置,10,分钟。,2.,沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各,1cm,左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡，否则影响到胶条中蛋白质的分布。,3.,当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制,IPG,胶条上的保护层。,IPG,胶条的长度,分析型的上样量,（银或,SYPRO Ruby,染色）,制备型的上样量,（考马斯亮蓝染色）,7 cm,10-100ug,蛋白,200-500ug,蛋白,11cm,50-200ug,蛋白,250-1,000ug,蛋白,17cm,100-300ug,蛋白,1-3mg,蛋白,ReadyStrip,TM,IPG,胶条的长度,上样体积,7 cm,125ul-250ul,11cm,185ul-370ul,17cm,300ul-600ul,4.,分清胶条的正负极，轻轻地将,IPG,胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有,+,）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。,5.,在每根胶条上覆盖,2-3m,L,矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。,6.,对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。,7.,聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向,SDS-PAGE,电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，,-70,冰箱保存。,7cm,胶条,等电聚焦程序,水化 12h（17-20）,主动水化,S1 250V 慢速 2 h,除盐,S2 500V 慢速 1 h,除盐,S3 1000V 快速 1 h,除盐,S4 4000V 线性 3 h,升压,S5 4000V 快速 25000 伏h 聚焦,S6 500V 快速 任意时间 保持,1,、配好的尿素储液必须马上使用，或用,mixed-bed,离子交换树脂，清除长时间放置时尿素溶液中形成的氰酸盐，预防蛋白质的甲酰化。,2,、将水化上样缓冲液分装后再储存于,-20,。用时，只要解冻需要量，其余继续储存。水化上样缓冲液一旦溶解不能再冷冻。,3,、将水化上样缓冲液加入蛋白样品中，终溶液中,urea,的浓度需,6.5M,。,4,、等电聚焦溶胀缓冲液和样品溶液中都要加入两性电解质，它能够帮助蛋白质溶解。,等电聚焦注意事项,5,、胶条最少需要经过,11,小时的溶胀。即使看上去所有的缓冲液都已经被吸收，也一定要确保胶条在槽中溶胀充分的时间。只有在,IPG,凝胶的孔径已经溶胀充分后，才可以吸收大分子量蛋白质，否则大分子量蛋白质无法进入胶条。,6,、如果在等电聚焦过程中，聚焦盘中还有很多的溶液没有被吸收，留在胶条的外面，这样就会在胶条的表面形成并联的电流通路，而在这层溶液中蛋白质不会被聚焦。这就会导致蛋白的丢失或是图像拖尾。为了减少形成并联电流通路的可能性，可以先将胶条在溶胀盒中进行溶胀，然后再将溶胀好的胶条转移到聚焦盘中。在转移过程中，要用湿润的滤纸仔细地从胶条上吸干多余的液体。,等电聚焦注意事项,7,、带上手套用镊子去除,IPG,胶条上的保护层。将,IPG,胶条仔细的置于溶胀缓冲液上，胶面朝下，确保整个胶面都能被浸湿。,8,、在样品溶液中加入痕量的溴酚蓝对观察溶胀过程很有帮助。在覆盖矿物油之前，可以让胶条先吸收,1,小时的液体。,IPG,胶条上一定要覆盖矿物油，否则缓冲液会蒸发，使得溶液浓缩，导致尿素沉淀。作为防止缓冲液蒸发的预防措施，矿物油必须缓缓地加在每个槽内，确保完全的覆盖住每一根胶条。,9,、不同的样品需要的,volt-hours,不同。当聚焦过程无法达到最高电压时，只要最后能达到总的,volt-hours,，且,7cm,胶条电压不低于,3000,伏，,11cm,胶条电压不低于,5000,伏，,17cm,胶条电压不低于,7000,伏，也能对样品进行充分的聚焦。,等电聚焦注意事项,10,、为使样品进入胶的效率增加，采用,50V,低电压溶胀；继续以低电压梯度（,200V,，,500V,，,1000V,各一个小时）进行电泳，最后达到,10000V,进行聚焦。,11,、处理预制,IPG,胶条时，一定要始终带着手套。注意预防角蛋白污染。,12,、水化上样缓冲液的成分由不同的样品决定。,13,、每根胶条蛋白质的总上样量由特定的样品，胶条的,pH,范围，及最终的检测方式决定。,14,、所有含尿素的溶液加热温度不超过,30,，否则会发生蛋白氨甲酰化，使蛋白质,pI,值偏移。,等电聚焦注意事项,15,、主动水化过程，会帮助大分子量的蛋白质进入胶条，但会丢失部分小分子量蛋白。,16,、当样品中含盐量较高时，建议选用慢速升压。当样品中含盐量一般时，选用线性升压。当样品中含盐量很少时，可以选用快速升压，这样可以节省聚焦时间。,17,、虽然仪器中每根胶条的极限电流可以设为,99,A/,根。但一般,7cm,胶条的极限电流不超过,30,A/,根，,17cm,胶条的极限电流不超过,50,A/,根，最好也在,30,A/,根以下。,18,、可以在聚焦盘的两端电极处搭上盐桥，这可以帮助除盐。但需注意的是，盐桥必须是湿润的但水不能太多，必要时需用滤纸吸去多余的水份。保持盐桥与电极的紧密接触。,19,、程序设置中的除盐步骤，可根据具体情况进行设置，如果样品中含盐量较高可设置多步除盐，并加长除盐时间。但这种方法只能除去很少量的盐离子，所以最好是在上样前，对样品进行除盐处理。,等电聚焦注意事项,+,pH 3,pH 7.5,pH10,pH 3,pH 7.5,pH10,charge,size,2-D Theory,1,、配制,10%,的丙烯酰胺凝胶两块。配,80ml,凝胶溶液，每块凝胶,40ml,，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留,1cm,的空间，用,MilliQ,水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整，聚合,30,分钟，一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。,2,、待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的,MilliQ,水、乙醇或水饱和正丁醇，用,MilliQ,水冲洗。,3,、从,-20,冰箱中取出的胶条，先于室温放置,10,分钟，使其溶解；,4,、配制胶条平衡缓冲液,I,。,第二向,SDS-PAGE,电泳操作步骤,5,、在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用,MilliQ,水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。,6,、将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入,5ml,胶条平衡缓冲液,I,。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃,15,分钟。,7,、配制胶条平衡缓冲液,II,。,8,、第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液,I,。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液,II,，继续在水平摇床上缓慢摇晃,15,分钟。,9,、用滤纸吸去,SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。,10,、将琼脂糖封胶液进行加热溶解。,11,、将,10,电泳缓冲液，用量筒稀释,10,倍，成,1,电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。,12,、第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液,II,。并用滤纸吸取多余的平衡液。,13,、将,IPG,胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在,1,电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。,14,、将放有胶条的,SDS-PAGE,凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。,15,、用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。,16,、放置,5,分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。,17,、在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。,18,、在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（,5mA/gel/17cm,）或低电压，待样品在完全走出,IPG,胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（,20-30mA/gel/17cm,），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。,19,、电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。,20,、进行染色。,3,.,双向电泳实验,高灵敏度,宽的定量线性范围,低毒安全,对环境无不良影响,兼容质谱分析,目前的技术没有完全符合上述要求的，从事双向电泳的实验室需要应用不只一种的检测方法。,胶上蛋白质的检测,考马斯亮蓝染色,1.,用去离子水清洗凝胶两次，每次,10min,，以去除,SDS,。,2.,固定：,50,乙醇,/10,冰醋酸,/,的水溶液，至少,30min,可过夜。,3.,染色：染色液为,45,甲醇,/10,冰醋酸,/0.25,G-250,溶液过滤所得，将凝胶浸泡后染色至少,2h,。,4.,脱色：多次更换脱色液（,25,乙醇,/8,冰醋酸溶液）直至背景脱净。,5.,保存：用保险膜包裹，可存一个月。或脱色后在,-80,下保存。,Molecular Imager FX Pro Plus MultiImager System,Fluorescent and storage phosphor imaging 488 nm,532 nm,and 635 nm laser excitation sources,GS-800 Calibrated Densitometer,Reflectance and transmittance modes30 x 40 cm scanning area,VersaDoc Imaging System,CCDbased UV/visible,fluorescence,and chemiluminescent imaging,凝胶成像与计算机图像分析,3,.,双向电泳实验,谢谢！,