植物细胞组织培养的基本技术.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2012-3-2,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2012-3-2,#,2026/1/30 周五,1,第二章 细胞组织培养的基本技术,2026/1/30 周五,2,本章教学目的与要求,(1),掌握组织培养实验室的设计；,(2),掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用方法；,(3),掌握调控组织培养的主要环境条件。,(5),掌握灭菌的不同方法和具体操作过程；,(6),掌握无菌接种的步骤；,(7),掌握外植体的培养方法和步骤；,(8),一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法；,(9),掌握试管苗驯化的基本程序；,2026/1/30 周五,3,植物细胞组织培养实验室构建及操作技术,2026/1/30 周五,4,本章主要内容,商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备,培养基及其配制,外植体的选择与培养,试管苗的驯化与移载,2026/1/30 周五,5,第一节 商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备,培养皿的清洗；,培养基的配制、分装和高压灭菌；,无菌操作,材料的表面灭菌和接种；,将培养物放到培养室培养；,试管苗的驯化、移栽和初期管理。,2026/1/30 周五,6,一、设计,2026/1/30 周五,7,(,一,),、洗涤室,(cleaning room),洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。,室内配备：,大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。,备有塑料筐，用于运输培养器皿。,备有干燥架，用于放置干燥涮净的培养器皿。,2026/1/30 周五,8,洗涤室,2026/1/30 周五,9,(,二,),、准备室,(repairing room),完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。准备室要求明亮、通风。,如果房间较多，可将准备室分为,洗涤室,和,配置室,两部分。洗涤室专门负责试管苗出瓶与培养器皿的清洗工作；配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。,2026/1/30 周五,10,(,三,),、缓冲室,进入无菌室前要在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。,应当在此室内安装灭菌用的,紫外灯,。控制无菌室及培养室的,配电板,等。,2026/1/30 周五,11,缓冲室,2026/1/30 周五,12,(,四,),、无菌操作室,(transfering room),接种室是进行植物材料的,分离接种,及,培养物转移,的一个重要操作室。其无菌条件的好坏对组织培养成功与否起重要作用。,配置：,在工作方便的前提下，接种室宜小不宜大，一般,7-8m2,，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。,接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装,1-2,盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。,无菌操作室,2026/1/30 周五,13,(,五,),、培养室,(culturing room),培养室,是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。,设计原则：,充分利用空间和节省,能源,高度比培养架略高为,宜,周围墙壁要求有绝热,防火的性能。,2026/1/30 周五,14,(,五,),、培养室,(culturing room),培养架,大多由金属制成。,规格：,一般设,5,层，最低一层离地高约,10 cm,，其他每层间隔,30cm,左右，培养架即高,1.7m,左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用,40W,日光灯，则长,1.3 m,，,30 W,的长,1m,，宽度一般为,60cm,。,2026/1/30 周五,15,(,五,),、培养室,(culturing room),培养室最重要的因子是,温度,，一般保持在,20-27,左右，具备产热装置，并安装窗式或立式,空调机,。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室内,湿度,也要求恒定，相对湿度以保持在,70,-80,为好，可安装,加湿器,。,控制日光照时间可安装定时开,关钟,，,一般需要每天光照,10-16h,也有的需要连续照明。,现代组培实,验室大多设计为采用天然太阳光,照作为主要能源，这样不但可以,节省能源，而且组培苗接受太阳,光生长良好，驯化易成活。,2026/1/30 周五,16,(,六,),、驯化室,驯化室要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调节装置、通风口以及必要的杀菌剂。,2026/1/30 周五,17,(,七,),、温室,应配有空调机、通风口、加湿器、恒温恒湿控制装置、喷雾装置、光照调节装置以及必要的杀菌杀虫装置及相应药剂。,2026/1/30 周五,18,二、仪器设备和器皿用具,常见仪器设备,1,、,超净台,2,、无菌箱,3,、空调机,4,、除湿机,5,、,恒温箱,6,、烘箱,7,、高压灭菌锅,8,、冰箱,9,、电子分析天平和托盘天平,10,、显微镜及解剖镜,11,、水浴锅,12,、摇床与转床,13,、磁力搅拌器,14,、电蒸馏水器,15,、酸度计,16,、离心机,2026/1/30 周五,19,1,、超净台和无菌箱,1,、超净台,，优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，准备时间短。开机,10,分钟即可操作，可进行长时间使用。在工厂化生产中，接种工作量很大，需要经常长久地工作时，超净台是很理想的设备。,2,、无菌箱,，在投资少的情况下，可以用接种箱来代替超净台。接种箱依靠密闭、药剂熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌。但操作活动受限制，准备时间长，工作效率低。,2026/1/30 周五,20,工作原理,超净台功率在,145-260W,左右，它装有小型鼓风机，使空气穿过一个,前置过滤器,，在这里把大部分空气尘埃先过滤掉，然后再使空气穿过一个细致的,高效过滤器,，它除去了大于,0,3um,的尘埃、细菌和真菌孢子,等，最后以较洁净的气流吹到工作台面。超净空气的,流速为每分钟,24-30m,，这已足够防止附近空气袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。在这样的无菌条件下操作，就可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。,根据风幕形成的方式，超净台可分为,水平式,和,垂直式,二种型号。,2026/1/30 周五,21,5,、培养箱（植物光照培养箱）,2026/1/30 周五,22,（二）各类玻璃器皿,1,、,培养器皿,2,、分注器,3,、离心管,4,、刻度移液管,5,、,细菌过滤器,6,、,实验器皿,2026/1/30 周五,23,1,、培养器皿,1,、培养器皿：在组织培养中配制培养基和进行培养需大量的玻璃器皿。要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制成，以保证长期贮存药品及培养的效果；培养用的还要求透光度好，能耐高压高温，能方便放入培养基和培养材料的器皿，根据培养的目的和要求，可以采用不同种类、规格的玻璃器皿。其中以试管、三角瓶、培养皿等使用较多。,最常使用的是,三角瓶,培养皿,（,9,、,12cm,直径）用于：游离细胞、原生质体、花粉等的静置培养、看护培养、无菌种子的发芽、植物材料的分离等都需采用。,试管,（,18mmXl80mm,或,20mmX200mm,）用于：培养较高的试管苗。,工厂化生产可采用广口的,200ml,罐头瓶，加盖半透明的塑料盖，由于瓶口大，所以大量繁殖时操作方便、工作效率高，也减少了培养材料的损伤。但缺点是易引起污染。,2026/1/30 周五,24,瓶口封塞,瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的,通气性,和,密闭性,，以防止培养基干燥和杂菌污染。,以前封口常用,棉塞,。但这种封口办法夏季极易污染，且不易保持培养基的湿度。现在多采用,聚丙烯塑料薄膜,作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。为了增加通气性，可在里面衬一层,硫酸纸或牛皮纸,。这样经济方便，且通气好。也可采用专用的,封口膜,。,2026/1/30 周五,25,5,、细菌过滤器,用于除去不能采用湿热灭菌法的液体中的细菌。一般采用,0.22um,微孔滤膜,进行抽滤灭菌。包括滤头，注射器或采用抽滤装置：真空泵、吸滤瓶、滤气玻璃管等。,2026/1/30 周五,26,6,、实验器皿,在组织培养中配制培养基，贮藏母液，材料的消毒等需要各种化学实验用的玻璃器皿，包括,:,100ml,、,250ml,、,500ml,、,1000ml,烧杯；,l0ml,、,l00ml,、,1000ml,量筒；,l00ml,、,1000ml,试剂瓶,(,棕色,),等等。,2026/1/30 周五,27,（三）、器械用具（,P13,）,1,镊子类：尖头和枪形,2,剪刀类,3,解剖刀,4,解剖针,5,、接种工具：接种针、接种钩及接种铲（由白金丝或镍丝制成）,6,、钻孔器,7,、其它：酒精灯，电炉，试管架，搪瓷盘等,2026/1/30 周五,28,第二节 培养基及其配置,目的要求：,(1),一般掌握培养基的种类、特点；,(2),掌握基本培养基的配方；,(3),一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；,(4),掌握培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤；,(5),熟练掌握培养基的灭菌方法；,(6),一般掌握培养基的筛选办法。,2026/1/30 周五,29,培养基及其配制,培养基的种类,培养基的成分,培养基配制,2026/1/30 周五,30,1.,培养基的种类,按成分分类,:,MS,B5,White,NT,KM-8P,N6,等。,按状态：,液体，固体。,2026/1/30 周五,31,固体培养基,液体培养基,2026/1/30 周五,32,2026/1/30 周五,33,（,1,）,MS,培养基（,Murashige and Skoog Medium,）,July 15,1908February 15,2001,2026/1/30 周五,34,MS,培养基（,Murashige and Skoog Medium,）,Toshio Murashige,Folke Skoog,.,A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures.,Physiol.Plant.,1962,15:473-497.,植物组织培养中常用的一种培养基。,离子浓度较高，硝酸盐含量较其他培养基高。,器官，花药，细胞，原生质体培养。,2026/1/30 周五,35,2026/1/30 周五,36,（,2,）,B,5,培养基（,B,5,Medium,）,Gamborg,O.L.;Miller,R.A.;Ojima,K.Nutrient requirements of suspension,cultures of soybean root cells.,Exp.Cell Res,.50:151158;1968.,2026/1/30 周五,37,B,5,培养基（,B,5,Medium,）,铵含量较低,木本植物，十字花科植物,2026/1/30 周五,38,（,3,）,White,培养基（,White Medium,）,White,P.R.Handbook of plant tissue culture.New York:The Ronald Press Co.;1943.White,P.R.;Grove,A.R.Proceedings,International Conference on Plant,Tissue Culture(1963:University Park,PA).Berkeley,CA:McCutchan Pub.Corp.;1965:553 pp.,无机盐含量低,生根培养,2026/1/30 周五,39,（,4,）,NT,培养基（,NT Medium,）,1970,烟草叶肉原生质体培养,2026/1/30 周五,40,（,5,）,KM-8,培养基（,KM-8 Medium,）,1974,有机成分复杂，包括所有单糖和维生素，呼吸代谢主要有机酸,原生质体和融合体培养,2026/1/30 周五,41,（,6,）,N6,培养基（,N6 Medium,）,1974,，朱至清等。,成分简单，,KNO,3,和（,NH4,）,2,SO,4,含量高,小麦，水稻及其他植物花药培养和组织培养,2026/1/30 周五,42,2.,培养基的成分,水,无机营养成分,有机营养成分,植物生长调节剂,附加成分,2026/1/30 周五,43,（,1,）水,培养基的主要组分,水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒，是生命活动过程中不可缺少的物质。,配制培养基母液时要用,蒸馏水,，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程发霉变质。大规模生产时可用,自来水,。,2026/1/30 周五,44,蒸馏水器,2026/1/30 周五,45,超纯水器,2026/1/30 周五,46,（,2,）无机营养组分,作用,满足植物对各矿质元素的需求,。,大量元素，,6,种,微量元素，,7,种,非必须元素，,6,种,铁采用,螯合铁,，,FeSO,4,加,EDTA,2026/1/30 周五,47,（,3,）有机营养成分,碳源,蔗糖,维生素类,硫胺素（,B1,），烟酸（,B3,），吡哆醇（,B6,），泛酸钙（,B5,），肌醇。,氨基酸,蛋白质组成成分，促进细胞生长。,其他有机附加物,椰子汁，酵母提取物，马铃薯，水解酪蛋白等。可以促进组织生长。,2026/1/30 周五,48,椰子汁,椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在,10%-20%,。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。,2026/1/30 周五,49,马铃薯,去掉皮和芽后，加水煮,3,0,分钟，再经过过滤，取其,滤液,使用。对,PH,值缓冲作用大。添加后可得到健壮的植株。,2026/1/30 周五,50,酵母提取物，香蕉，水解酪蛋白等。,其他,2026/1/30 周五,51,（,4,）植物生长调节物质,生长素,细胞分裂素,赤霉素,乙烯,生长素,赤霉素,细胞分裂素,脱落酸,乙烯,-,植物激素“五兄弟”,向光性：,在单侧光的照射下，植物,朝向光源方向生长的现象。,生长素（,auxin,）的发现,胚芽鞘,1,、,19,世纪末达尔文,(C.R.Darwin),实验,实验材料：,尖 端,尖端下面一段,胚芽鞘,光,图,2,光,图,3,图,1,光,光,图,4,总结上述三个实验,达尔文提出,:,胚芽鞘尖端受,单侧光,刺激后,就向下面的伸长区传递影响，造成伸长区,背光面比向光面生长快,因而使胚芽鞘出现向光弯曲。,琼脂片,云母片,2.1910,年詹森（,B.Jensen,）的实验,结论：胚芽鞘的尖端产生的某种刺激可以透过琼脂片传递给下面一段。,黑暗中,1 2,b,a,3.1914,年拜尔（,Paal,）的实验,去尖端，,把尖端放于胚芽鞘切面的,左侧,，,胚芽鞘,向右侧,弯曲生长。,去尖端，,把尖端放于胚芽鞘切面的,右侧,，,胚芽鞘,向左侧,弯曲生长。,结论：,胚芽鞘的弯曲生长，是因为尖端产生的,影响在其下部分布不均匀造成的。,4,、,1928,年（,F.W.Went,）温特的实验,朝对侧弯曲生长,不生长也不弯曲,结论：胚芽鞘的弯曲生长确实是一种,化学物质引起的，并命名为生长素。,1934,年从人尿分离出具有生长素效应的物质,吲哚乙酸,。,1942,年从高等植物中分离出生长素，并确认是,IAA,。,在植物体内，具有促进植物生长的功能，除了,吲哚乙酸（,IAA,）,外，还有,苯乙酸（,PAA,）,和,吲哚丁酸（,IBA,）。,生长素生理作用的应用,顶端优势,植物的向光性,根的向重力性（向地性）,茎的背重力性（背地性）,解除顶端优势,顶端优势,顶端优势现象,顶端优势：,植物的顶芽优先生长，而侧芽生长受抑制的现象。,形成原因：,顶芽产生的生长素向下运输，大量地,积累在侧芽,部位，侧芽对生长素浓度又比较敏感，使,侧芽的生长受到抑制,。,顶芽,侧芽,切除顶芽,根,茎,根,茎,根,茎,根,茎,重 力,促进,慢,抑制,快,茎的背地性和根的向地性生长,2,1,3,4,根：浓度,21,，,茎：浓度,43,，,1,处生长快，,2,处生长慢，向地生长,4,处生长快，,3,处生长慢，背地生长,根,茎,1,2,3,4,茎的背地性和根的向地性生长,在单侧光线照射下，,背光,侧,向光侧,，,背光侧细胞生长快,植物向光性,结果使茎朝向光源一侧弯曲,生长素类似物的应用,(1),促进扦插的枝条生根,(2),促进果实发育（培育无籽果实）,(3),防止落花落果，疏花疏果,（,4,）用作除草剂,1,、促进扦插枝条生根,用一定浓度的生长素类似物溶液浸泡插枝的下端后栽插。,传粉受精后，胚珠发育成种子的过程中产生大量生长素，促进子房发育成果实。,2,、生长素促进果实发育（无籽果实）,如何培育无籽果实？,在没有接受花粉的雌蕊柱头上涂上一定浓度的生长素类似物，使,子房正常发育为果实，因为,没有受精,，果实内,没有种子,。,3,、防止落花落果,农业生产上常用一定浓度的生长素类似物溶液喷洒棉株，可以达到保蕾保铃的效果。,4,、杂草的除草剂,如,(2,，,4-D),，适用于麦田、稻田，,双子叶植物,比单子叶植物对生长素更,敏感,，用高浓度的除草剂能抑制,双子叶植物（杂草）,的生长。,2026/1/30 周五,73,生长素（,auxin,）,吲哚乙酸（,IAA,，天然），奈乙酸（,NAA,），二氯苯氧乙酸（,2,4-D,），吲哚丁酸（,IBA,），,2,4,5-,三氯苯氧乙酸（,2,4,5-T,）。,促进细胞分裂与根分化,2,4-D,有强烈的愈伤组织诱导能力，但抑制器官分化,2026/1/30 周五,74,细胞分裂素（,cytokinin,）,激动素（,KT,），,6-,苄基腺嘌呤（,6-BA,），玉米素（,ZT,），异戊烯氨基嘌呤（,2IP,）,刺激细胞分裂，诱导芽的分化、叶片扩大和茎长高，抑制根的生长。,细胞分裂素常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。,细胞分裂素,合成部位,主要作用；促进细胞分裂,愈伤组织,2026/1/30 周五,76,细胞分裂素与生长素相互作用,生长素与细胞分裂素的比例被称为“激素杠杆”，决定着发育的方向。,当生长素含量高于细胞分裂素时，主要诱导植物组织脱分化和根原基的形成,当细胞分裂素的效应高于生长素时，主要诱导植物组织再分化和芽原基的形成。,2026/1/30 周五,77,生长素含量高于细胞分裂素,2,4-D 1mgL+6-BA 0.1mgL,2026/1/30 周五,78,生长素含量低于细胞分裂素,2026/1/30 周五,79,赤霉素（,gibberelin acid,）,GA,3,促进细胞生长,刺激不定胚发育成正常小植株,1926,年，水稻感染了赤霉菌,植物疯长,恶苗病,病苗细长，叶色淡绿，比健苗高，病株节间伸长，茎节,上逆生不定根，茎杆逐渐变褐，腐烂，其内有白色蜘蛛,丝状菌丝。,1935,年科学家从培养基滤液中分离出,赤霉素（,GA,）,将赤霉菌培养基的滤液喷洒稻健康水稻幼苗上,不感染赤霉菌，却有恶苗病的症状,对照,施用,5g GA,3,后第,7,天,GA,3,诱导甘蓝茎的伸长，产生超长茎,GA,3,对矮生型豌豆的效应,促进细胞伸长,促进种子萌发,主要作用,果实发育,未成熟的种子,幼根,幼芽,幼叶,合成部位,促进果实着色和成熟,乙烯,在常温下是气体。作为生长调节剂用的是,乙烯利,。,2026/1/30 周五,85,乙烯（,ethylene,）,对芽的诱导具有一定作用,在生理环境的温度和压力下，是一种气体，比空气轻，实验中很难掌握用量，所以一般不使用,培养的植物组织也会产生乙烯，如果封口用的是不透气的塑料膜，容器内就会逐渐积累乙烯，严重时可引起培养物的死亡,AgNO,3,可逆转乙烯的抑制作用,2026/1/30 周五,86,（,5,）附加组分,活性炭,渗压剂,硝酸银,抗生素,凝固剂,2026/1/30 周五,87,活性炭,吸附有害物质；遮光,作用：防止褐化和玻璃苗产生；促进根的生长,副作用：琼脂不易凝固；降低培养基,PH,；吸附植物激素,替代物：墨汁,2026/1/30 周五,88,活性炭,2026/1/30 周五,89,有活性炭,无活性炭,2026/1/30 周五,90,渗压剂,保持培养基中的渗透压,常用渗压剂,蔗糖，聚乙二醇（,PEG,），山梨醇，甘露醇。,2026/1/30 周五,91,硝酸银,Ag,与乙烯受体结合，抑制,乙烯,的作用,促进愈伤组织的生长、器官与胚胎分化，减轻培养物玻璃化和衰老,副作用：使再生植株畸形,2026/1/30 周五,92,抗生素,杀灭细菌和真菌，防止污染,常用的有：青霉素、链霉素、四环素、氯霉素、利福平、卡拉霉素,一般不耐高温，使用时单独过滤灭菌,副作用：对培养物生长有抑制作用；抗生素污染,2026/1/30 周五,93,凝固剂,制备固体培养基，使培养物能够处于表面，既能吸收必需的养分、水分，又可不致因缺氧而死亡。,材料必须无,毒害,作用，且不被培养的植物组织所,吸收,，不与培养液成分发生,化学反应,。,常用凝固剂,琼脂，淀粉，滤纸等,2026/1/30 周五,94,琼脂,来源于石花菜等,海藻,。高温下融化，温度降低凝固。不会被植物和菌类吸收利用。常用浓度：,0.7-1,质量差的琼脂要求的凝固浓度更高。,琼脂条,琼脂粉,石花菜,果冻,琼脂条,2026/1/30 周五,95,3.,培养基配制,母液的配制,培养基配制,培养基灭菌,2026/1/30 周五,96,(1),母液的配置,母液的定义,优点：,减少操作步骤；增加称量的准确性。,2026/1/30 周五,97,27.8,2780,P,33,参考修改,2026/1/30 周五,98,MS,培养基,大量元素母液,微量元素母液,铁盐母液,有机元素母液,肌醇母液,植物激素母液,2026/1/30 周五,99,大量元素母液（,10X,）,NH,4,NO,3,16.5g,KH,2,PO,4,1.7g,KNO,3,19g,CaCl,2,2H,2,O 4.4g,MgSO,4,7H,2,O,3.,7g,溶于,1000mL,水，放置,4,冰箱保存。,常用,10X,或,20X,。,2026/1/30 周五,100,配制大量元素母液时残留不溶物,各种化合物必须充分溶解后才能混合，混合时注意,先后顺序,要注意把钙离子和硫酸根离子和磷酸氢根离子错开,2026/1/30 周五,101,微量元素母液（,1000X,）,KI 0.8,3,g,Na,2,MoO,4,2H,2,O 0.25g,H,3,BO,3,6.2g,CuSO,4,5H,2,O 0.025g,MnSO,4,H,2,O 16.9g,CoCl,2,6H,2,O 0.025g,ZnSO,4,7H,2,O 8.6g,配成,1000mL,母液，存放于冰箱中。,2026/1/30 周五,102,铁盐母液,200X,NaEDTA 7.46g,FeSO47H2O 5.56g,配成,1000mL,母液，存放于冰箱中。,刚配制的铁盐溶液放人冰箱后出现结晶,原因是铁离子和,EDTA,没有螯合彻底，室温放置过夜后再移入冰箱中保存,2026/1/30 周五,103,有机元素母液（,1000X,）,盐酸硫胺素（,VB1,）,0.1g,烟酸,0.5g,甘氨酸,2g,盐酸吡哆醇（,VB6,）,0.5g,配成,1000mL,母液，存放于冰箱中。,2026/1/30 周五,104,肌醇母液,10X,肌醇,1g,配成,1000mL,母液，存放于冰箱中。,常用,10X,或,100X,2026/1/30 周五,105,植物激素母液,各激素单独配置，通常浓度为,1mgmL,-1,生长素类,少量,NaOH,溶解后，加水定容。,细胞分裂素类,少量盐酸或,NaOH,溶解后，加水定容。,GA,3,乙醇溶解。或少量乙醇溶解后加水定容。,2026/1/30 周五,106,（,2,）培养基配制,先在烧杯中放入一些蒸馏水,分别取各种母液,称取蔗糖倒入，搅拌溶解,按设计好的方案添加各种激素,用精密试纸或酸度计调整,PH,加蒸馏水用量筒定溶至,1L,称取,5-10g,左右琼脂粉,倒入上面配好的溶液中，加热至沸腾，直到琼脂粉熔化,稍微冷却后，分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧,灭菌,灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。,2026/1/30 周五,107,PH,值,常用,PH5.8,检测,:,试制或,PH,计,高压蒸汽灭菌会造成,PH,值下降,0.2-0.5,过高或过低,PH,PH,值过低，琼脂培养基难以凝固。,PH,值过高，无极盐沉淀。,2026/1/30 周五,108,2026/1/30 周五,109,PH,试纸,PH,计,2026/1/30 周五,110,在三角瓶中分装灭菌的培养基,2026/1/30 周五,111,（,3,）灭菌,2026/1/30 周五,112,2026/1/30 周五,113,2026/1/30 周五,114,2026/1/30 周五,115,灭菌方法,打开锅盖，加水至水位线。,把已装好培养基的三角瓶，连同蒸馏水及接种用具等放人锅筒内，装时不要过分倾斜培养基，以免弄到瓶口上或流出。,然后盖上锅盖，对角旋紧螺丝。,接通电源加热，当升至,0,05MPa,时，打开放气阀放气，回,“,0,，后关闭放气阀。,当气压上升到,0.10 MPa,时，保压灭菌,20min,，到时停止加热。当气压回,“,0,”,后打开锅盖，取出培养基，放于平台上冷凝。,灭好的培养基不要放置时间太长，最多不能超过,1,周。,2026/1/30 周五,116,传统灭菌锅,全自动灭菌锅,2026/1/30 周五,117,过滤灭菌,赤霉素、玉米素、脱落酸等是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。,防细菌滤膜的网孔的直径为,0.45,微米,(,常用,0.22,微米,),以下，当溶液通过滤液后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻,2026/1/30 周五,118,抽滤装置,包括：滤器，接收瓶，泵，导管。,2026/1/30 周五,119,针头滤器,灭菌包装，配合一次性注射器一次性使用。,2026/1/30 周五,120,2026/1/30 周五,121,污染,真菌污染,细菌污染,污染来源：培养基灭菌不彻底；操作不严格；外植体灭菌不彻底,2026/1/30 周五,122,固体培养基灭菌后，不能凝固，可能的原因是什么？,PH,值偏酸；活性炭添加较多；琼脂条或琼脂粉浓度不够；琼脂质量差；反复灭菌,培养基灭菌后，出现沉淀，是什么原因？,PH,值偏碱,2026/1/30 周五,123,2026/1/30 周五,124,2026/1/30 周五,125,有菌的范畴,是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。,无菌的范畴,是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体,(,当然这些方法必须已经证明是有效的,),，高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。,2026/1/30 周五,126,2026/1/30 周五,127,外植体消毒程序：,2026/1/30 周五,128,2026/1/30 周五,129,接种前的准备工作：,2026/1/30 周五,130,接种时的无菌操作技术：,2026/1/30 周五,131,2026/1/30 周五,132,2026/1/30 周五,133,2026/1/30 周五,134,2026/1/30 周五,135,胚状体（,embryoid,）,定义,：离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物，此现象无论在体细胞培养还是生殖细胞培养中均可以看到，因而统称为体细胞胚或胚状体。,2026/1/30 周五,136,胚状体（,embryoid,）,2026/1/30 周五,137,2026/1/30 周五,138,原球茎途径（兰科）,原球茎（,protocorm,）,种子萌发时先是胚的膨大,种皮破裂,40,天时肉眼可见浅黄色的原胚呈球状,称为,原球茎,.,。,兰花,茎尖等外植体在组培中也可诱导产生原球茎，并且原球茎还可以切割成若干小块，分别形成新的若干原球茎丛。,石斛原球茎,2026/1/30 周五,139,原球茎途径（兰科）,种子,原球茎,增殖,分化成苗,2026/1/30 周五,140,顶芽和腋芽的发育,采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长，从而形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。将这种丛生苗的一个枝条转接继代，重复芽,-,苗增殖的培养，并且迅速获得多数的嫩茎。然后将一部分嫩茎转移到生根培养基上，就能得到可种植到土壤中去的完整的小植株。,一些木本植物和少数草本植物,:,月季、茶花、菊花、香石竹等等。,也称作,微型扦插,。不经过发生愈伤组织而再生，所以是最能使无性系后代保持原品种特性的一种繁殖方式。,2026/1/30 周五,141,顶芽和腋芽的发育,2026/1/30 周五,142,采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其他如种子萌发后取枝条也可以,茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织作为外植体进行接种。,用靠培养顶芽得到的培养物一般是茎节较长，有直立向上的茎梢，扩繁时主要用切割茎段法，如香石竹、矮牵牛、菊花等。但特殊情况下也会生出不定芽，形成芽丛。,顶芽和腋芽的发育,2026/1/30 周五,143,不定芽的发育,不定芽,abventitious bud,，,adventive bud,，,indefinit bud,顶芽、腋芽、副芽等均在一定部位生出的芽，称为定芽,从叶、根、或茎节间等通常不形成芽的部位生出的芽，则统称为不定芽。,2026/1/30 周五,144,不定芽的发育,2026/1/30 周五,145,不定芽的发育,通常形成愈伤组织的细胞，经再分化，即由这些分生组织形成器官原基，它在构成器官的纵轴上表现出单向的极性,(,这与胚状体不同,),。多数情况下它先形成芽，后形成根。,另一种方式是从器官中直接产生不定芽，如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。许多常规方法中不能无性繁殖的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科，松科，银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。,在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基。用靠培养不定芽得到的培养物，一般采用芽丛进行繁殖，如非洲菊、草莓等。,2026/1/30 周五,146,2026/1/30 周五,147,（一）污染,2026/1/30 周五,148,2,、污染的预防措施,2026/1/30 周五,149,（二）外植体的褐变,1,、定义：,是指外植体在培养中体内的多酚氧化酶被激活，而使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，有时使整个培养基变褐，从而抑止其他酶的活性，影响材料的培养。,2026/1/30 周五,150,2,、褐变的主要原因,植物品种,在不同品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差异，因此，有些花卉品种的外植体在接种后较容易褐变，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。,生理状态,一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。,培养基成分,过高浓度的无机盐、细胞分裂素过高会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。,培养条件不当,光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。,2026/1/30 周五,151,3,、减轻褐变现象发生的措施,选择合适的外植体,一般来说，最好选择生长处于,旺盛,的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。,合适的培养条件,无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养,均可以减轻材料的褐变现象。,使用抗氧化剂,在培养基中，使用,半胱氨酸、抗坏血酸,等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。,连续转移,对容易褐变的材料可间隔,12-24h,的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理,7-lOd,后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。,加活性炭,另外使用,0.1,-0.5,的活性炭,对防止褐变也有较为明显的效果。,2026/1/30 周五,152,（三）玻璃化现象,1,、定义：,在长期的离体培养繁殖时，有些试管苗的嫩茎、叶片呈现半透明水渍状，这种现象称为玻璃化。,2026/1/30 周五,153,玻璃化的愈伤组织,玻璃化的苗,2026/1/30 周五,154,2,、玻璃化现象产生的原因,2026/1/30 周五,155,3,、预防措施,增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；,减少培养基中含氮化合物的用量；,增加光照；,增加容器通风，最好进行,C0,2,施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；,降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生；,降低培养基中细胞分裂素和赤霉素浓度，可以考虑加入适量脱落酸。,2026/1/30 周五,156,2026/1/30 周五,157,一、试管苗的特点,1.,试管苗的生态环境,试管苗由于是在无菌、有营养供给、适宜光照和温度近,100,的相对湿度环境条件下生长的，因此，在生理、形态等方面都与自然条件生长的正常小苗有着很大的差异。,高温且恒温,高湿,弱光,无菌,2026/1/30 周五,158,2,、特点：（与常规苗相比）,2026/1/30 周五,159,二、炼苗（驯化）,2026/1/30 周五,160,适合于栽种试管苗的基质要具备,透气性,、,保湿性,和,一定的肥力,，,容易灭菌,处理，并不利于杂菌滋生的特点，一般可选用珍珠岩、蛭石、砂子等。,2026/1/30 周五,161,移栽用基质,河砂,草炭土,腐殖土,容器,2026/1/30 周五,162,河砂,分为粗砂、细砂两种类型。粗砂即平常所说的河砂，细砂即通常所说的面砂。,河砂的特点是排水性强，但保水蓄肥能力较差，一般不单独用来直接栽种试管苗。,2026/1/30 周五,163,草炭土,草炭土是由沉积在沼泽中的植物残骸经过长时间的腐烂所形成,其保水性好，蓄肥能力强，呈中性或微酸性反应，但通常不能单独用来栽种试管苗，宜与河砂等种类相互混合配成盆土而加以使用。,2026/1/30 周五,164,腐殖土,腐殖土是由植物落叶经腐烂所形成。一种是自然形成，一种是人为造成。,腐叶上含有大量的矿质营养、有机物质，它通常不能单独使用。掺有腐殖土的栽培基质有助于植株发根。,2026/1/30 周五,165,容器,栽培容器可用,6X 6cm-10Xl0cm,的软塑料钵，也可用育苗盘。前者占地大，耗用大量基质，但幼苗不用再移，后者需要二次移苗，但省空间、省基质。,2026/1/30 周五,166,移栽和幼苗的管理,从试管中取出发根的小苗，用自来水洗掉根部粘着的培养基，要全部除去，以防残留培养基滋生杂菌。,用消毒水浸泡灭菌。,栽植时用一个筷子粗的竹签在基质中插一小孔，然后将小苗插入，注意幼苗较嫩，防止弄伤，栽后把苗周围基质压实，栽前基质要浇透水。再将苗移入高湿度的环境中。保证空气湿度达,90,以上。,2026/1/30 周五,167,移栽和幼苗的管理,保持小苗的水分供需平衡。在移栽后,5-7d,内，应给予较高的空气湿度条件。当,5-7d,后，逐渐降低湿度，减少喷水次数，通风，使小苗适应湿度较小的条件。约,15d,以后揭去拱棚的薄膜，逐渐减少浇水，促进小苗长得粗壮。,防止菌类滋生。应对基质进行高压灭菌或烘烤灭菌。可以适当使用一定浓度的杀菌剂以便有效地保护幼苗。在移苗时尽量少伤苗。喷水时可加入,0,1,的尿素，或用