蛋白质的提取.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,蛋白质的提取(tq),第一页，共70页。,蛋白质的分离(fnl)与纯化,蛋白质的性质(xngzh),蛋白质分离和纯化,蛋白质的分离步骤,蛋白质的纯化方法,蛋白质含量的测定,蛋白质纯度等的测定,第二页，共70页。,蛋白质存在(cnzi)于生物体的组织细胞中，不同的生物体组织细胞所含的蛋白质种类、数量也不尽相同。,一、蛋白质的性质(xngzh),第三页，共70页。,蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。,在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液(rngy)中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液(rngy)中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳。,1 、蛋白质的两性离解(l ji)和电泳现象,第四页，共70页。,由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。,由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此(ync)可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,2、蛋白质的胶体(jio t)性质,第五页，共70页。,蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。,改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质,在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀(chndin)出来。,3、蛋白质的沉淀(chndin)作用,第六页，共70页。,在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。,在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。,可逆沉淀是分离和纯化(chn hu)蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,可逆沉淀(chndin),第七页，共70页。,在强烈沉淀条件(tiojin)下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。,由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。,如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。,不可逆沉淀(chndin),第八页，共70页。,蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起(ynq)蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性。,4、蛋白质的变性(binxng),第九页，共70页。,蛋白质的变性(binxng),变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质(xngzh)。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。,第十页，共70页。,大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。,这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。,利用这个性质，可以对蛋白质进行定性(dng xng)鉴定。,5、蛋白质的紫外吸收(xshu),第十一页，共70页。,要研究某种蛋白质的结构、性质和功能，就必须将这种蛋白质从组织细胞中分离、纯化(chn hu)出来。因此，蛋白质的分离与纯化(chn hu)技术便成为蛋白质研究的重要技术。,二、蛋白质分离(fnl)和纯化,第十二页，共70页。,研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。,(1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；,(2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。,(3)分离(fnl)和纯化过程都必须在温和的条件下进行。,第十三页，共70页。,(1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法和酶解法等。,(2)根据(gnj)蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。,水溶性蛋白用中性缓冲溶液（透析液）抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用有机溶剂抽提等。,(3)粗提:离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。,(4)提纯：可用层析法、电泳法等进行提纯。,(5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。,1蛋白质的分离(fnl)步骤,第十四页，共70页。,血红蛋白(xuhng dnbi)提取和分离步骤,具体操作,步骤(bzhu),（一）,（二）,（三）,（四）,第十五页，共70页。,血,液,血 浆,水 分,固体(gt)物质,血浆(xujing)蛋白,无机盐,磷 脂,葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞,（,最多,）,血红蛋白(xuhng dnbi),（）,90,血液组成成分,第十六页，共70页。,1.洗涤(xd)红细胞,1.1 洗涤的目的(md)：洗去血液中血浆及血小板等中的杂蛋白,1.2 洗涤过程：,血液(xuy),100mL,3g,柠檬酸钠,低速离心,2 min,红细胞,血 浆,吸出血浆,红细胞,5,倍体积,生理盐水,缓慢搅拌,10min,重复洗涤,3,次，直至上清液没有,防止破坏红细胞，使血红蛋白流失,（一）样品处理,黄色,第十七页，共70页。,2.血红蛋白(xuhng dnbi)的释放,原理：红细胞渗透作用吸水涨破，释放(shfng)血红蛋白,第十八页，共70页。,3.分离(fnl)血红蛋白溶液,分离(fnl)过程：,红细胞,混合液,离心管,甲苯层,脂类物质,血红蛋白层,破碎物沉淀层,高速离心,10min,滤纸,过滤,脂类物质,沉淀物,烧杯,分液,漏斗,第十九页，共70页。,20mmol/L,磷酸缓冲液,透析的目的(md)是什么？,1mL,1mL,1mL,去除血红蛋白中的小分子(fnz)杂质,（二）粗分离(fnl)透析血红蛋白,第二十页，共70页。,注意事项,（1）生理盐水(shnglynshu)作用？,（3）两次离心(lxn)的差异？,（4）透析袋的作用(zuyng)机理？,模拟红细胞生存环境，保持红细胞结构完整。,破碎红细胞；溶解细胞膜,释放血红蛋白。,前慢后快，前短后长。,渗透作用,（,2,）蒸馏水和甲苯的作用？,第二十一页，共70页。,离心沉降(chnjing)法,凝胶色谱法,萃取法,层析法,电泳法,（三）纯化(chn hu),第二十二页，共70页。,1.,凝胶色谱法,（1）原理(yunl)：,（2）材料：凝胶,大分子通过(tnggu)多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；,小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。,凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿(gunchun)的通道.,根据相对,分子质量的大小,分离蛋白质的方法,概念：,凝胶色谱法纯化蛋白质,第二十三页，共70页。,洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，,促使蛋白质分子的差速流动。,混合物,上 柱,洗,脱,大分子流动快,小分子流动慢,收 集,大分子,收 集,小分子,第二十四页，共70页。,1）原理(yunl)：,不同(b tn)蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同(b tn)，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同(b tn)，导致不同(b tn)蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同(b tn)。,电泳：带电粒子在电场(din chng)的作用下发生迁移的过程,（四）纯度鉴定,电泳,第二十五页，共70页。,2）电泳(din yn)结果分析,如果出现一个条带：样品中含有一个分子质量级别多肽；,如果出现两个条带：样品中含有两个分子质量级别多肽。,第二十六页，共70页。,由弱酸和相应(xingyng)的强碱弱酸盐溶解于水中。,如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等,3）缓冲溶液洗脱剂,作用(zuyng)：,配制：,调节酸和盐的用量，可配制(pizh)不同pH的缓冲液。,抵制外界酸碱对溶液,pH,的干扰而保持,pH,稳定。,思考：如何配制不同,PH,值不同的缓冲液？,第二十七页，共70页。,实验(shyn)四 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳,【目的要求】,1、掌握(zhngw)电泳技术的一般原理和基本操作过程。,2、熟悉血清中蛋白分类以及电泳分离操作。,第二十八页，共70页。,【实验(shyn)原理】,1.电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。,在一定pH条件下，不同(b tn)的蛋白质由于具有不同(b tn)的等电点而带不同(b tn)性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同(b tn)，它们的电泳迁移率不同(b tn)。,第二十九页，共70页。,V=EQ/(6r),M=V/E=Q/(6r),V：电泳速度 M：迁移率,E：电场强度 Q：颗粒带电荷(dinh)量,r：球形分子半径 ：介质粘度,第三十页，共70页。,【实验(shyn)原理】,2.影响(yngxing)电泳的因素：,内在因素：蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状,外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象,第三十一页，共70页。,影响(yngxing)蛋白质分子运动速度的因素,决定,运动方向,电场,作用力,形成,阻力,决定,运动速率,电荷性质,电荷量,分子形状,分子大小,第三十二页，共70页。,3.醋酸纤维素溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120m，有很强的通透性，对分子移动阻力(zl)很小。该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点,第三十三页，共70页。,血清蛋白参考值,等电点,分子量（,kDa,）,占总蛋白的百分数,(%),清蛋白,4.64,69,6171,1,球蛋白,5.06,200,34,2,球蛋白,5.06,300,610,球蛋白,5.12,90150,711,球蛋白,6.85,156950,918,第三十四页，共70页。,4.经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白及球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分(bi fn)含量。,第三十五页，共70页。,【实验(shyn)器材】,1.DYY-6C型 双稳定(wndng)时电泳仪和DYY-型电泳槽,2.醋酸纤维薄膜（2 cm8cm）：1片/人。,3.培养皿：一排桌子公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。,4.点样器：载玻片。,5.滤纸：公用。,6.镊子：一个/组。,第三十六页，共70页。,蛋白质的性质(xngzh),植物芳香油的化学(huxu)本质:,该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120m，有很强的通透性，对分子移动阻力(zl)很小。,蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。,植物芳香油选择(xunz)方法的依据：,由弱酸和相应(xingyng)的强碱弱酸盐溶解于水中。,3、蛋白质的沉淀(chndin)作用,清水(qn shu)漂洗：浸泡好的橘皮用流水彻底漂洗干净，沥干。,本节内容目标：血红蛋白(xuhng dnbi)的分离和纯化,16世纪，制备植物芳香油的技术已相当成熟。,（2）蒸馏水和甲苯的作用？,要研究某种蛋白质的结构、性质和功能，就必须将这种蛋白质从组织细胞中分离、纯化(chn hu)出来。,第五十七页，共70页。,外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象,2、熟悉血清中蛋白分类以及电泳分离操作。,【实验(shyn)试剂】,1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液，0.07 mol/L，离子强度(qingd)0.06),2、0.5%氨基黑10B染色液,3、漂洗液,第三十七页，共70页。,1.浸泡,将28 cm醋酸纤维薄膜置于电泳(din yn)缓冲液中，浸泡15 min左右，至完全浸透，方可用于点样。,【实验(shyn)操作】,第三十八页，共70页。,2.点样,用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，迎光判断光面与无光泽面。用边缘整齐的玻片沾取少量无溶血血清，垂直(chuzh)按压于醋纤膜标号一端约1.5-2处(约23l),第三十九页，共70页。,3.电 泳,将点样端的薄膜平贴在阴极滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极滤纸桥上(见下图)。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。,平衡片刻(2-3min)；使其自然充满(chngmn)缓冲液；而后电压120V，电流0.6mA/，通电45分钟。,第四十页，共70页。,4.染色：,电泳完毕(wnb)后将薄膜取下,放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡3-5 min,第四十一页，共70页。,5.漂洗：,将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次(3-4次)，直至条带清晰为止(wizh)，可得到色带清晰的电泳图谱。,第四十二页，共70页。,6.记录和分析实验结果漂洗完毕后将薄膜取出,放在滤纸上。将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状(xngzhun)、大小及相对位置进行描述、记录在预习本上，并判断分析其结果。,第四十三页，共70页。,【,注意事项,】,1、点样前，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。,2、薄膜的浸润与选择正确膜面是电泳成败的关键之一。,3、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。,4.手尽量不要触及薄膜，用镊子(ni zi)夹取。,5、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜 片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。垂直点样。,6、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。,7、电泳开始后，不能再取放薄膜，以防触电。如必需进行，要先关闭电源。,8、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。,第四十四页，共70页。,【,思考题,】,电泳图谱清晰的关键(gunjin)是什么？如何正确操作？,第四十五页，共70页。,本堂小结(xioji),本节内容目标：血红蛋白(xuhng dnbi)的分离和纯化,获 取,红细胞,（离心(lxn)）,破碎红细胞，释放血红蛋白,从各,红细胞的成分,中获取血红蛋白 （离心）,初步纯化血红蛋白（透析）,第四十六页，共70页。,从生物材料中提取(tq)某些特定成分,第四十七页，共70页。,背景(bijng)知识,早在古代，人类就已发现芳香气味的植株或花卉能使人神清气爽，将这些植物制成干品后，可当做药物和香料使用。但是，植物香料易挥发，不易储存。欧洲中世纪香料贸易的发展，促成了植物芳香油提取(tq)技术的诞生。,第四十八页，共70页。,16世纪，制备植物芳香油的技术已相当成熟。19世纪，有机化学迅速发展，人们通过分析植物芳香油的化学成分，找到了芳香的根源，进而合成了人造香料。如今，植物芳香油广泛地应用于轻工、化妆品、饮料和食品制造(zhzo)的方面。,第四十九页，共70页。,基础知识,动物(dngw)：,植物(zhw)：,微生物：,主要来源于麝、灵猫(ln mo)、海狸和抹香鲸等,天然香料的来源,根、茎、叶、花、果实、种子,真菌,第五十页，共70页。,植物(zhw)芳香油的物理性质:,植物芳香油的化学(huxu)本质:,具有(jyu)很强的挥发性,主要包括萜类化合物及其衍生物,第五十一页，共70页。,植物芳香油的提取(tq)方法：,植物芳香油选择(xunz)方法的依据：,根据(gnj)植物原料的特点来决定,蒸馏、压榨、萃取,第五十二页，共70页。,提取(tq)植物芳香油的常用方法：,提取植物(zhw)芳香油常用方法的原理：,水蒸气蒸馏法：,水中蒸馏法、水上(shu shn)蒸馏法、水气蒸馏法,利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后，油水混合物又重新分出油层和水层,第五十三页，共70页。,水中蒸馏适于某些鲜花、破碎果皮(gup)和不易粘结的原料。但水中蒸馏精油中的酯类成分易水解，所以含酯类高的香料植物不能采用这种方法。,1.水中蒸馏(zhngli),第五十四页，共70页。,又称隔水蒸馏，是把原料置于蒸馏锅内的筛板上，筛板下盛放一定水量以满足(mnz)蒸馏操作所需的足够的饱和蒸汽，水层高度以水沸腾时不溅湿原料底层为原则。,2.水上(shu shn)蒸馏,第五十五页，共70页。,水上蒸馏应用较广，大面积种植的芳香植物为薄荷、香茅、桉树叶等都用水上蒸馏提取精油；此法也适用于粉碎后的干燥原料(yunlio)包括某些干花。,第五十六页，共70页。,是由外来的锅炉蒸汽直接进行蒸馏。通常在筛板下锅底部位装有一条开小孔的环形管，锅炉来的蒸汽通过小孔直接喷出。通过筛板的筛孔进入原料层加热原料。由锅炉来的蒸汽是具有(jyu)一定蒸汽压力，温度较高而含湿量又较低的饱和蒸汽，能很快加热料层，因此，对干料加热蒸馏时，干料必须在装锅前预先湿透。直接蒸汽蒸馏，其蒸馏速度快，温度高，可缩短蒸馏时间，高沸点的成分可蒸出，出油率高。,3.直接(zhji)蒸汽蒸馏,第五十七页，共70页。,因为水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解(shuji)等问题,原因(yunyn)：,提取(tq)柑橘芳香油的方法：,通常用,压榨法,第五十八页，共70页。,萃取(cuq)法的原理：,将粉碎、干燥的植物原料用有机溶剂浸泡，使芳香油溶解在有机溶剂中的方法。芳香油溶解于有机溶剂后，只需蒸发出有机溶剂，就可以(ky)获得纯净的植物芳香油了。,第五十九页，共70页。,比较项目,实验原理,方法步骤,适用范围,水蒸气,蒸馏法,萃取法,压榨法,利用水蒸气将挥发性较强的植物(zhw)芳香油携带出来,使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发(zhngf)后得到芳香油,通过机械加压，压榨(yzh)出果皮中的芳香油,水蒸汽蒸馏,分离油层,除水过滤,粉碎、干燥,萃取、过滤,浓缩,石灰水浸泡、漂洗,压榨过滤静置,再次过滤,提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油,原料颗粒尽可能细小，能充分浸泡在有机溶剂中,适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取,植物芳香油提取三种方法的比较,第六十页，共70页。,1、提取(tq)方法：,水蒸气蒸馏(zhngli)法,一、玫瑰精油(jn yu)的提取：,实验设计,2,、实验设计玫瑰精油的提取装置：,第六十一页，共70页。,3、实验(shyn)步骤：,采集玫瑰花：采集盛花期（5月上中旬）的玫瑰花，清水清洗沥干。,装入蒸馏原料(yunlio)：称取50g玫瑰花放入蒸馏瓶，添加200mL蒸馏水。,安装蒸馏装置：所有(suyu)仪器必须事先干燥，保证无水。,加热蒸馏,第六十二页，共70页。,拆卸蒸馏装置(zhungzh)：,分离油层：,蒸馏完毕，应先撤出热源(ryun)，然后停止通水，最后拆卸蒸馏装置，拆卸的顺序与安装时相反。,收集锥形瓶中的乳浊液，向锥形瓶中加入质量浓度为0.1 gmL的NaCl，然后将其倒入分液漏斗中，用分液漏斗将油层和水完全分开(fn ki)。放出玫瑰精油，用接收瓶收集。,除去水分：,向接收瓶加入无水,Na,2,S0,4,，,24h,后过滤，得到玫瑰油。,注意事项：蒸馏时间不能过短，温度不能过高。,第六十三页，共70页。,鲜玫瑰花+清水(qn shu),水蒸气蒸馏(zhngli),油水(yu shui)混合物,油水分离,除水,玫瑰油,加无水,Na,2,SO,4,加,NaCl,氯化钠：,促使油水混合物（乳浊液中油和水,的分离。,无水硫酸钠：,吸收油层中的水分。,实验流程示意图：,第六十四页，共70页。,压榨(yzh)装置,通过(tnggu)机械加压，压榨出果皮中的芳香油,实验(shyn)原理：,实验装置：,二、橘皮精油的提取：,提取方法：,压榨法,第六十五页，共70页。,实验(shyn)步骤：,橘皮的处理：在实验前一天，将新鲜橘皮用清水(qn shu)清洗沥干。,石灰水浸泡：用pH大于12、质量分数为78石灰水浸泡橘皮1624h。,清水(qn shu)漂洗：浸泡好的橘皮用流水彻底漂洗干净，沥干。,第六十六页，共70页。,粉碎和压榨：将橘皮粉碎，加入相当于橘皮质量的NaHCO3和5的Na2S04，并调节pH为78。用家用榨汁机或手动压榨机得到压榨液。,过滤(gul)压榨液：将压榨液先用普通布袋过滤(gul)除去固体物和残渣，再用分液漏斗或吸管将上层的橘皮油分离出来。,第六十七页，共70页。,静置处理：将橘皮油在510冰箱中静置57d，使杂质沉淀，分离出上层(shngcng)澄清橘皮油。,分析(fnx)：静置处理目的：除去果蜡和水分。,再次过滤：将下层橘皮油用滤纸过滤，滤液与上层(shngcng)橘皮油合并，得到橘皮精油。,第六十八页，共70页。,静置,漂洗(pio x),压榨(yzh),过滤(gul),石灰水浸泡,再次过滤,橘皮油,提取橘皮精油的实验流程示意图：,石灰水：,防止压榨时滑脱，提高出油率，降低压榨液黏稠度，过滤不堵塞筛眼。,小苏打、硫酸钠：,促进油和水的分离（用量分别为橘皮质量的和,5,）。,第六十九页，共70页。,结果分析(fnx)与评价：,你是否(sh fu)提取出了玫瑰精油或橘皮精油？你能描述提取出的精油的特点吗？,从颜色、气味等方面来评价所提取的精油的纯度和质量。玫瑰精油为浅黄色至黄色的液体，并带有甜韵的玫瑰香；橘皮精油为无色透明的液体，具有诱人(yu rn)的橘香味。,第七十页，共70页。,