课题2-土壤中分解尿素的细菌的分离与计数-(10).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,课题,2,土壤中分解尿素的细菌,的分离与计数,一、筛选菌株的思路,1.,自然界中目的菌株的筛选：,(1),依据：根据它对,_,的要求，到相应的环境中去寻找。,(2),实例：,PCR,技术过程中用到的耐高温的,_,，就,是从热泉中筛选出来的,Taq,细菌中分离出来的。,生存环境,Taq,DNA,聚合酶,2.,实验室中目的菌株的筛选,:,(1),原理：人为提供有利于,_,生长的条件,(,包括营养、,温度、,pH,等,),，同时抑制或阻止其他微生物生长。,(2),方法：利用,_,分离。,选择培养基：在微生物学中，将允许,_,种类的微生物生,长，同时,_,或,_,其他种类微生物生长的培养基，称为选,择培养基。,选择分解尿素的细菌的培养基特点：,_,是唯一氮源，按,物理性质归类为,_,。,目的菌株,选择培养基,特定,抑制,阻止,尿素,固体培养基,二、统计菌落数目的方法和注意事项,1.,常用方法：稀释涂布平板法。,(1),统计依据：,当样品的,_,足够高时，培养基表面生长的一个菌落，,来源于样品稀释液中的一个,_,。,通过统计平板上的,_,来推测样品中大约含有的活菌数。,稀释度,活菌,菌落数,(2),计算公式：每克样品中的,菌株数,=_,。,C,：代表某一稀释度下平板上生长的,_,。,V,：代表涂布平板时所用的稀释液的,_,。,M,：代表,_,。,(3),注意事项：,一般选择菌落数在,_,的平板进行计数。,统计的菌落数往往比活菌的实际数目,_,。,统计结果一般用,_,而不是用,_,来表示。,设置对照：主要目的是排除实验组中,_,对实验结,果的影响，提高实验结果的可信度。,(C,V),M,平均菌落数,体积,稀释倍数,30,300,低,菌落数,活菌数,非测试因素,2.,其他方法,利用,_,直接计数,滤膜法,显微镜,三、实验设计,1.,土壤取样：,(1),取样原因：土壤有,“,_,”,之称。同其他,生物环境相比，土壤中的微生物，数量,_,，种类,_,。,(2),土壤要求：富含,_,，,pH,接近,_,且潮湿。,(3),取样部位：距地表约,_,的土壤层。,微生物的天然培养基,最大,最多,有机质,3 cm,8 cm,中性,2.,样品稀释：,(1),稀释原因：样品的,_,直接影响平板上生长的,_,_,。,(2),稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获,得菌落数在,_,之间，便于计数。,(3),稀释倍数：,测定土壤中细菌的数量，一般选用,10,4,、,10,5,和,10,6,倍的稀释液,进行平板培养。,测定放线菌的数量，一般选用,_,倍稀释。,测定真菌的数量，一般选用,_,倍稀释。,稀释程度,菌落,数目,30,300,10,3,、,10,4,和,10,5,10,2,、,10,3,和,10,4,3.,微生物的培养与观察：,(1),培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养,_,和培,养,_,。,(2),观察：每隔,_,统计一次,_,数目，最后选取菌落数目,_,时的记录作为结果。,4.,细菌的计数：当菌落数目稳定时，取同一,_,下的,3,个平,板进行计数，求出,_,，并根据所对应的,_,计算出样,品中细菌的数目。,温度,时间,24 h,菌落,稳定,稀释度,平均值,稀释度,四、操作提示,1.,无菌操作：,(1),取土样的用具在使用前都需要,_,。,(2),应在,_,旁称取土壤，并在火焰附近将称好的土样倒入锥,形瓶中，塞好,_,。,(3),在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在,_,旁操作。,2.,做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，,最好使用前就做好,_,。,灭菌,火焰,棉塞,火焰,标记,3.,制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先,_,，,以便提高工作效率。,4.,菌种鉴定：细菌合成的,_,将尿素分解成,_,，使培养基的,碱性,_,。在以,_,为唯一氮源的培养基中加入,_,指示,剂，培养某种细菌后，若指示剂变,_,，可初步鉴定该种细菌,能够分解尿素。,制定计划,脲酶,氨,增强,尿素,酚红,红,【,思考辨析,】,1.,判断正误,(1),选择分解尿素的细菌的培养基为液体培养基。,(,),【,分析,】,选择分解尿素的细菌的培养基为固体培养基，固体,培养基具有分离、鉴定作用。,(2),统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最,多的平板进行统计。,(,),【,分析,】,统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数,在,30,300,的平板进行统计。,(3),统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。,(,),【,分析,】,由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的,只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。,(4),设置对照的目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的,影响，提高实验结果的可信度。,(,),2.,问题思考,(1),统计菌落数目的理论依据是什么？,提示：,当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。,(2),为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？,提示：,尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值。,一、培养基的类型及应用,依据,培养基类型,配制特点,主要应用,物理性质,固体培养基,加入琼脂较多,菌种分离、鉴定、计数,半固体培养基,加入琼脂较少,菌种保存,液体培养基,不加琼脂,工业生产，连续培养,依据,培养基类型,配制特点,主要应用,化学组成,合成培养基,由已知成分配制而成，培养基成分明确,菌种分类、鉴定,天然培养基,由天然成分配制而成，培养基成分不明确,工业生产，降低成本,目的用途,鉴别培养基,添加某种指示剂或化学药剂,菌种的鉴别,选择培养基,添加,(,或缺少,),某种化学成分,菌种的分离,【,易错提醒,】,(1),选择培养基不一定是在培养基中加入某种成分，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。其实培养基中的营养成分的缺少或未加入特定化学成分时，也可达到分离微生物的目的。,(2),能够在固体培养基上生长的微生物不一定是实验所需要的微生物，因为有些微生物可利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。,【,典例训练,1】,下面为一培养基配方，请根据下表回答问题。,编号,成分,含量,KH,2,PO,4,1.4 g,Na,2,HPO,4,2.1 g,MgSO,4,7H,2,O,0.2 g,葡萄糖,10.0 g,尿素,1.0 g,琼脂,15.0 g,将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到,1 000,mL,。,(1),在该培养基的配方中，为微生物提供碳源的是,_,，,提供氮源的是,_,。,(2),绝大多数微生物都能利用,_,，但只有能合成脲酶的微生物才能分解,_,。,(3),分析该培养基的配方，该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？,【,解题关键,】,解答本题应明确两点：,(1),培养基中特殊成分与培养基用途的相关性。,(2),该培养基对微生物起选择作用的原理。,【,解析,】,碳源是提供碳元素的物质，氮源是提供氮元素的物质，所以碳源、氮源分别是葡萄糖和尿素。绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，所以这种培养基对微生物有选择作用。选择原则是只有能利用尿素的微生物才能生长。,答案：,(1),葡萄糖 尿素,(2),葡萄糖 尿素,(3),该培养基对微生物具有选择作用。以尿素作为唯一氮源的培养基可以分离出能产生脲酶的微生物。,【,变式训练,】,用来判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置的对照是,(),A.,未接种的选择培养基,B.,未接种的牛肉膏蛋白胨,(,全营养,),培养基,C.,接种的牛肉膏蛋白胨,(,全营养,),培养基,D.,接种的选择培养基,【,解析,】,选,C,。将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，以牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照遵循的原则是单一变量，所以与选择培养基一样接种、培养。,二、实验过程,1.,菌株计数：微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。,二者比较如下：,直接计数法,间接计数法,主要用具,显微镜、细菌计数板,培养基,计数依据,菌株本身,培养基上菌落数,优点,计数方便、操作简单,计数的是活菌,缺点,死菌、活菌都计算在内,操作较复杂，且有一定误差,计算公式,每毫升原液含菌株数,=400,1 000,每小格平均菌株数,稀释倍数,每毫升原液含菌株数,=,稀释倍数,注：,400,、,1 000,是常数。,2.,实验设计原则：,(1),设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布,3,个平板作重复组，增强实验结果的说服力与准确性。,(2),设立两种对照组：,判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的选择培养基同时进行培养。,判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。,3.,实验结果分析：,内容,现象,结论,有无杂菌,污染的判断,对照的培养皿中无菌落生长,未被杂菌污染,培养基中菌落数偏高,被杂菌污染,菌落形态多样，菌落数偏高,培养基中混入其他杂菌,选择培养基,的筛选作用,牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目,选择培养基具有筛选作用,样品的,稀释操作,得到,3,个或,3,个以上菌落数目在,30,300,的平板,操作成功,重复组的,结果,若选取同一种土样，统计结果应接近,【,思维拓展,】,(1),稀释涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要，一般以,3,个稀释度中的第二个稀释度倒平板所出现的平均菌落数在,50,个左右的最好。,(2),在设计实验时，一定要涂布至少,3,个平板作为重复组。,(3),在分析结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，如果差别过大，则意味着操作有误，需要重新实验。,【,典例训练,2】,在探究培养液中酵母菌种群数量变化的实验中，需利用计数板对微生物细胞进行直接计数。计数板是一个特制,的可在显微镜下观察的玻片，样品就滴在计数室内。计数室由,25,16=400,个,小室组成，容纳液体总体积为,0.1 mm,3,。某同学操作时将,1,mL,酵母菌样品加,99,mL,无菌水稀释。用无菌吸管吸取少许使其自行渗入计数室，盖上盖玻片并用滤纸吸去多余菌液，进行观察计数。,(1),在实验中，某同学的部分实验操作过程是这样的：从静置试管中吸取酵母菌培养液加入计数板进行计数，并记录数据；把酵母菌培养液放置在冰箱中；第七天再取样计数，记录数据，统计分析绘成曲线。,请纠正该同学实验操作中的,3,处错误：,._,。,._,。,._,。,(2),在实验前应该对计数板、吸管等器具进行,_,处理。,(3),如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应采取的措施是,_,。,(4),如果观察到如图所示,a,、,b,、,c,、,d,、,e 5,个大格共,80,个小室内共有酵母菌,48,个，则上述,1,mL,酵母菌样品中约有酵母菌,_,个；要获得较为准确的数值，减少误差，你认为该怎么做,?,_,。,【,解题关键,】,解答本题时，需要掌握用计数板对酵母菌细胞进行计数的方法，理解图中每个方格所代表的含义，还要注意若酵母菌密度过大，应适当稀释后再计数。,【,解析,】,(1),在从试管中吸取酵母菌之前，应将试管轻轻振荡几次，目的是使酵母菌在培养液中分布均匀。酵母菌的培养液应置于适宜条件下，并且每隔,24,小时就要统计一次菌落数目。,(2),为了避免杂菌污染，实验中所用吸管、计数板等器具需进行灭菌处理。,(3)(4),解答时要注意以下两点：统一单位；注意体积的变化。,400,个小室共容纳液体总体积为,0.1 mm,3,，则,80,个小格容纳体积为,2,10,-2,mm,3,，含酵母菌,48,个，又因酵母菌培养液总体积为,100,mL,，统一单位后即可求出酵母菌个数。,答案：,(1).,应将试管轻轻振荡几次再吸取酵母菌培养液进行计数,.,应将酵母菌培养液放置在适宜温度下培养,.,应,连续七天，每天观察、取样计数并记录数据,(2),灭菌,(3),适当稀释,(4)2.4,10,8,多次计数，求平均值,【,互动探究,】,(1),上题中对计数板、吸管等器具进行灭菌的方法是什么？,提示：,干热灭菌。,(2),统计菌落数目除了上题中的方法外还有哪些方法？,提示：,活菌计数法、滤膜法。,