紫外分光光度法的原理.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第七章 紫外分光光度法的原理和运用,一.比色分析的原理：光是一种电磁波，它的波长用nm或为单位，人的眼睛所能觉得到的光波长约400760 nm，这之间的光波称为可见光。短于400 nm的叫紫外线，短于200nm的叫远紫外线，再短的就是X射线和射线了。长于760nm的叫红外线，红外线可长达5mm，再长的就是无线电波了。,普通的日光、白炽灯光称为发射光，将这种日光或白炽光经过棱镜可以分解为红、橙、黄、,绿、蓝、青、紫等组成的光谱，称为发射光谱。假设在白炽灯光与棱镜之间放一个有色溶液的玻璃皿，那么经过棱镜后的光谱上会出现一处或几处暗带，这种带有暗带的光谱称为该有色溶液的吸收光谱，吸收光谱显示该溶液对光的选择性吸收的特性。溶液所呈现的颜色是它的吸收光谱中透过最多、吸收最少的那部分波长光线的颜色，而暗带部分那么是它透过最少、吸收最多的那部分波长光线的颜色。,不同分子的原子团和原子，它的发射光谱和吸收光谱不同。因此可以根据其光谱的特征和,强度研讨化合物的构造和测定其含量，称为光谱分析法，这也是比色分析的原理。根据发射光谱分析的如火焰发射光谱法又称火焰光度法，分析钠、钾、钙，荧光光度和荧光分光光度法根据荧光的发射强度进展分析。,根据吸收光谱分析的方法又称吸光光度法，如运用可见光的吸收光谱进展分析的普通的分光光度计和分光光度法；用紫外光的吸收光谱进展分析的叫紫外分光光度计和紫外分光光度法；用原子的吸收光谱进展分析的方法叫原子吸收分光光度计和原子吸收分光光度法。,硒-邻苯二胺络合物的吸收光谱特征吸收峰332.5nm,氧化钬的吸收光谱,二.郎伯-比尔定律：当一束单色入射光 I0经过厚度为L、浓度为C的有色溶液后，所透过光的强度 I1 与溶液厚度L及浓度C成负指数乘积的关系：I1=I010KLC 假设物质在溶液中的浓度和显色强度成正比，那么可以运用郎伯-比尔定律经过比色方法从显色强度求浓度，这是比色分析的原理。,入射光强度I0 透过光强度I1,溶液厚度L比色杯直径,I1=I010KLC移项成：I1/I0=10KLC 式中K为常数，可因物质的吸光特性和采用单色光的波长不同而有所不同，与溶液的厚度和浓度无关。上式写成以10为底的对数，Iog(I1/I0)=KLC，再以透光度T=I1/I0时，那么上式成为IogT=KLC或者IogT=KLC。I1/I0称为透光度或透光率，表示透过光强度是入射光强度的百分之几，其数值只能1，从0100%。为了方便起见，经常用透光度的负对数IogT来表示溶液吸收光线的情况，并称为吸光度(ABS)、消光度(E)、或光密度(OD或D)，这样，ABS=KLC,该式阐明溶液的吸光度和浓度C、厚度L之间皆成正比关系。当厚度一定时，溶液的浓度添加，那么吸光度成正比地添加，这就是比色分析的根据。实践运用中，溶液的厚度就是比色杯的厚度，它是相对固定的，有0.5、1、2、4cm的比色杯，运用最多的是1cm的比色杯。,比色分析中有时也用透光度做单位，根据透光度的负对数IogT=吸光度，透光率为100%时，吸光度=Iog1=0，而透光率为1%时，吸光度=Iog0.01=2，二者间呈对数指数关系。,当然，只需溶液的浓度和吸光度之间成直线,正比关系时才干进展比色分析，假设溶液的吸光度与浓度不成正比不符合郎伯-比尔定律，那么不能运用比色分析。有时，溶液的浓度只在一定范围内和显色成直线正比关系，而浓度超越一定限制时，失去正比关系，那么不能一概地用比色结果换算，通常都要研讨测定方法中什么浓度范围内二者成直线正比关系；或者绘制一系列浓度和吸光度之间的规范曲线，发现浓度添加到一定限制，规范曲线发生弯曲、变折，阐明超越该浓度时，要对溶液进展稀释才干用来比色分析。,可见光、紫外、荧光分析都要求溶液必需透明，否那么引起对光的吸收，影响分析的准确度。,对特殊的均匀的浑浊液也可以进展比色分析,称为比浊法，比如运用于红细胞计数、细菌计数的比浊测定。,光线经过透明的溶液时，还有少量的光线在玻璃、溶液的外表被反射或散射，影响到吸光度，所以要用一个空白管进展校正，除去反射、光、散射光、试剂中杂质、非反响物的影响，即用空白试剂溶液进展调零的缘由。普通玻璃对紫外线也有吸收，所以在普通分光光度计上,运用普通玻璃比色杯，而在紫外分光光度计上必需用对紫外线无吸收的石英玻璃比色杯。,三.可见紫外分光光度计的运用,一光谱分析：有时候需求研讨某物质在某溶剂中的光谱特性，如Vc的乙酸溶液在252.0 nm和237.5nm处有吸收波峰。,大多数情况下，比色分析都提供了运用光的波长普通是最大吸收峰波长。假设没有提供运用波长的话，可以用紫外分光光度计从2001000nm范围内扫描吸收光谱，搜索到吸收峰，再用吸收峰波长来比色分析。,咖啡因样品用紫外光谱定性和定量，上：规范品；下：样品,二吸光系数：郎伯-比尔定律中的K称为吸光系数。因比色杯的直径用cm为单位，因此K的单位决议于浓度c用什么单位，如c以mol/L为单位时K称为摩尔吸光系数，用Emol或mol表示；假设物质的分子量未知，浓度可用%为单位，K称为百分吸光系数，用E%表示。,E的定义是：某波长光经过1cm杯、1mol/L或1%浓度的某溶液时，该溶液对该波长光的吸光度。E在特定波长、1mol/L或1%浓度、特定溶剂条件下是该物质的一个特征常数，反映该物质的吸光才干，资料和测定时都要标明其特征,假设有些物质不知分子量，用它的1%溶液在同,第八章 原子吸收分光光度法的原理,氯苯 碳氢化合物 267 200 210 7400,实践测定中还有许多本卷须知：,第八章 原子吸收分光光度法的原理,荧光定量分析的原理：荧光强度If和激发光的强度I0、物质的荧光效率f成正比：If=I0f-对待测溶液，设I0为入射光激发光强度，It为透射光强度，Ia为吸光强度，If为荧光强度，C为荧光物质浓度，L为溶液厚度(比色杯直径E为吸光系数。,如VB12含量测定：准确吸VB12注射液Vml，加重蒸水稀释n倍，使每含的标示量为30g/ml，另外配VB12规范液浓度为30g/ml，蒸馏水调零，用361nm测定吸光度A，计算：测定液中VB12含量g/ml=A样品/A规范品30；,水 210 乙酸乙酯 260 .,(1)测定1%混合物在0.,时，必需用一样的溶剂。,假设物质的分子量未知，浓度可用%为单位，K称为百分吸光系数，用E%表示。,光激发以后，可以向各个方 I0 It,5种氯丙嗪类药镇定药全用249307nm测定；,假设物质的分子量未知，浓度可用%为单位，K称为百分吸光系数，用E%表示。,3nm 铅：283.,磷光的能量比荧光小，波长较荧光长。,波长或最大吸收波长，表示为Emolnm,max,1cm或E%nm，max，1cm。许多物质的吸光系数在书或资料中可以查到，如药典规定VB12应该有2781 nm、3611nm、5502nm 3个吸收峰，其E1%361nm，1cm=207。实践任务中，1mol/L的浓度太高，可以配成1mmol/L或1mol/L的浓度，相应地写成Emmolmolnm，max，1cm。根据吸光系数的特性,，它有3项用途：,1.可作为物质定性的参考：被测物质的光谱特性和规范物假设一致，可粗略定性。如检查VB12注射液能否蜕变，测定其光谱，结果为279,0、361.50、550.70.3nm3个吸收峰，完全一致，可以断定该物质为VB12未蜕变。,一些苯衍生物的紫外光谱特征如下 ：,化合物 溶剂 吸收峰 吸收峰 吸收峰 Emolmax，1cm,苯 碳氢化合物254nm 250 204 8800,甲苯 碳氢化合物262 260 208 7900,六甲基苯,碳氢化合物 271 230 221 10000,氯苯 碳氢化合物 267 200 210 7400,苯酚 碳氢化合物 271 1260 213 6200 .,2.检查纯度：紫外光谱法检查纯度是一种简便有效的方法，用于许多化合物检测。如阿司匹林在空气中容易吸收水分产生水杨酸，阿司匹林在280nm处有强吸收峰，而水杨酸的吸收峰迁移到312nm，只需检测在312nm处能否有吸收峰，即可判别有无水杨酸。再如无水乙醇精制过程中要用苯，测定无水乙醇中能否残留苯,，测定其吸收光谱，乙醇在210 600nm之间无吸收峰，而苯在250、254 nm有吸收峰，以纯无水乙醇为参比，对样品进展光谱分析，假设在250、254nm处出现吸收峰，那么阐明有苯残留。,3.检查含量纯度:如药典规定VB12的E1%max，361nm，1cm=207，上述VB12注射液原标示浓度为0.05%，务虚际浓度，方法：药液用重蒸水准确稀释20倍，水做参比，用361nm测定的吸光度为0.512，其含量为：1%207=x%0.512，x%=0.00247%，浓度=0.00247%20=0.049%,4.运用摩尔吸光系数测定浓度:普通的比色分析中都有规范品，未知样品都是经过和规范溶液对比分析含量。某些情况下，没有规范品，可以用摩尔吸光系数或百分吸光系数进展测定，直接测定溶液的吸光度，经过和该纯物质的吸,光系数比较，可以计算出浓度。这样的分析需求经过准确校正了波长的分光光度计，紫外分光光度计的波长普通准确到2nm，可以承当这样的分析。假设知道分子量的话，百分吸光系数和摩尔吸光系数之间可以相互换算，换算公式是：百分吸光系数=10摩尔吸光系数物质的分子量。,比如血红蛋白是4个亚基组成的蛋白质，单个亚基的平均分子量是16114.5。每个亚基都在高铁氰化钾K3Fe(CN)6和氰化钾KCN溶液中构成单体氰化高铁血红蛋白HiCN，它的特征,最大吸收峰在540nm处，摩尔吸光系数是11000，表示为Emolmax,540nm,HiCN=11000。,测定样品在同样条件下的吸光度，就可以计算出含量。如：将血液0.02ml参与到5.0ml氰化高铁试剂中，用540nm测定的吸光度为0.35，求血液中Hb的含量(g/L)。第一步，计算血液稀释倍数：5.020.02=251倍；第二步，计算：1mol11000=x mol0.35，x=0.3511000 mol/L，乘以分子量和稀释倍数变为g，x=0.351100016114.5 251=128.7g/L。,假设有些物质不知分子量，用它的1%溶液在同,样条件下测定，用百分吸光系数同样可以换算。,5.紫外吸收光谱在某种程度上反映了化合物的性质和构造，所以可以用于有机化合物的定性和构造分析。利用规范样品或规范图谱可以对未知化合物进展鉴定，即控制一样的丈量条件，将未知化合物的吸收光谱与规范品或规范图谱进展对照，假设两者吸收光谱的外形、吸收峰的数目、位置、最大吸收波长及吸光强度完全一致，那么可阐明它们分子构造中存在一样的生色基团，初步确定它们是同一种物质，如咖啡因的定性。,由于大多数有机化合物的紫外光谱比较简单，缺乏精细的构造特征，而且很多生色团的吸收峰几乎不受分子中其它非吸收基团的影响，因此，仅根据紫外光谱鉴定有机化合物有很大局限，普通必需与红外光谱、质谱、核磁共振波谱等相配合，才干进展准确的鉴定。,6.溶剂对紫外光谱的影响：在测定有机物的紫外可见吸收光谱时，在溶解度允许范围内，应尽量选择非极性溶剂或极性较小的溶剂烷、烯烃，如正己烷、正庚烷，以获得吸收光谱的精细构造。与规范样品或规范图谱进展对比,样条件下测定，用百分吸光系数同样可以换算。,当原子蒸气厚度L一定时，设KvL=K，Iv=Iov eKC，Iov/Iv=eKC，将透光度Iv/Iov的的倒数取对数称为吸光度A，那么上式简化为 A=IgIv/Iov=KC，即吸光度A与浓度成线性正比关系。,这样的分析需求经过准确校正了波长的分光光度计，紫外分光光度计的波长普通准确到2nm，可以承当这样的分析。,实践测定中还有许多本卷须知：,5种氯丙嗪类药镇定药全用249307nm测定；,实践测定中还有许多本卷须知：,发射光谱的强度与物质的浓度在一定范围内成线性关系，据此可以测定含量。,I1/I0称为透光度或透光率，表示透过光强度是入射光强度的百分之几，其数值只能1，从0100%。,大多数情况下，比色分析都提供了运用光的波长普通是最大吸收峰波长。,运用摩尔吸光系数测定浓度:普通的比色分析中都有规范品，未知样品都是经过和规范溶液对比分析含量。,但原子的吸收谱线并不是几何学上的线条，而是有一定宽度的波长范围，通常称为谱线轮廓。,VB11用254nm分析。,当原子蒸气厚度L一定时，设KvL=K，Iv=Iov eKC，Iov/Iv=eKC，将透光度Iv/Iov的的倒数取对数称为吸光度A，那么上式简化为 A=IgIv/Iov=KC，即吸光度A与浓度成线性正比关系。,时，必需用一样的溶剂。所选择的溶剂在所研讨的光谱区域内应该没有明显的吸收；并且不含有其它干扰物质；与溶质没有相互作用。否那么会使光谱线产生挪动，低于此波长时，溶剂的吸收不可忽略。,常用溶剂的波长范围如下：.,溶剂 运用波长范围 溶剂 运用波长范围 甲醇 210 二氯甲烷 235 .乙醇 215 氯仿 245 .,水 210 乙酸乙酯 260 .,96%硫酸 210 苯 280 .,乙醚 215 甲苯 285 .,三作为光度计运用：有色的反响液可以用普通的分光光度计721、722、浓度计，也可以用紫外分光光度计比色。某些溶液、反响液无色，在200400nm之间有特征性光吸收,就只能用紫外分光光度计。,1.单一物质测定：先测定溶质的吸收光谱，普通用最大吸收波出息展比色。常用方法有2种。,1规范曲线法：用规范液制造一系列规范管的规范曲线，样品测定结果查规范曲线求知。,2对看管法：制造规范测定管和样品测定管，在特征吸收峰或最大吸收峰处测定吸,吸光度进展比较，可直接求出样品含量。如VB12含量测定：准确吸VB12注射液Vml，加重蒸水稀释n倍，使每含的标示量为30g/ml，另外配VB12规范液浓度为30g/ml，蒸馏水调零，用361nm测定吸光度A，计算：测定液中VB12含量g/ml=A样品/A规范品30；注射液中VB12含量g/ml=A样品/A规范品30 n稀释倍数V取样量,ml,2.混合物中两物质同时测定两物质的最大吸收峰有部分重合,例四环素和金霉素混合物的测定：四环素在0.25,N NaOH中最大吸收峰为380nm，E1%1cm，max=372.0；在0.1N HCl中最大吸收峰为355nm，,E1%1cm，max=303.2；两吸收峰都可以做为四环素的测定波长。但与金霉素共存时，由于金霉素在355nm处有吸收金霉素在0.1N HCl中E1%1cm，max=182.6，只能用380nm测定四环素。混合样品在355nm处测定二者的总吸光度,在380nm处测得四环素的吸光度，那么两者的浓度都可以求出。测定方法：,(1)测定1%混合物在0.1N HCl溶液的吸光度A335,(2)测定1%混合物在0.25N NaOH溶液的吸光度,A380，计算：四环素浓度C1g%=AC0/E1%C11cm，380=AC0/372.0,金霉素浓度C2g%=AC1+C2335E1%C11cm，355 C1E1%C21cm，355 =AC1+C2335303.2AC0372.0182.6,四.紫外分光光度法的运用：紫外光度法广泛运用在化学、生物化学、医学、环境检测、食品卫生检验分析方面。凡在200-1000nm范围内有特征性吸收，或与试剂反响后构成特征性吸收,符合郎伯比尔定律的，都可以分析，如：,1.测定蛋白质：蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸对280nm的紫外线有最大吸收，吸收值与其浓度成正比，样品不用反响，稀释后直接测定。,2.肌红蛋白：在576nm附近有吸收峰，不需求规范品，经过摩尔吸光系数法，可直接测定。,3.复原性谷胱甘肽：与四氧嘧啶反响，生成物,在305nm处有最大吸收峰。,4.过氧化氢酶：有可见光测定法，也有紫外法。,5.抗生素：大部分可用紫外法测定，如青霉素、链霉素、氯霉素、四环素、金霉素、新生霉素。,6.VA用乙醚提取，溶在异丙醇中用328nm测定。VB1用246nm分析。VB2用267和444 nm分析。VB6用291nm分析。VB11用254nm分析。VB12用278、361、550nm分析。VD用乙醚提取，纯化后溶在乙醇中用265nm测定。Vc在乙酸介质中与I2反响：C6H8O6+I2 乙酸溶液 C6H6O6脱氢Vc+2HI；样品中参与Vc后与I2反响，,减少了I2，也减少了I3生成，在一定范围内Vc与I3成反比，用350nm测定I3的显色减弱，间接测定Vc浓度。,7.许多药物要用紫外光谱测定，如咖啡因用272.6nm；巴比妥类安息药用220240nm测定；5种氯丙嗪类药镇定药全用249307nm测定；安息酮用235和503nm分析；安定镇静药用240和285nm分析。,8.食品中硒与邻苯二胺反响，将络合物提取到甲苯中，反响物在335nm左右有吸收峰，用紫外比色测定。,第八章 原子吸收分光光度法的原理,由原子构造实际可知，一个原子可具有多种能态，其中最低的能态称为基态，其它较高的能态称为激发态。处于基态的原子称为基态原子。原子吸收分光光度法的原理是：使样品中化合态的元素吸收热能，化合物解离后让元素变为基态原子。基态原子的能量最低，最稳定，假设基态原子受外界能量激发，其最外层电子能够跃迁到不同的能级，到达不同的激发态。电子从基态跃迁到能量最低的激发态第一激发态时要吸收一定波长的谱线，这一谱线称为“共振吸收线。,E6 .,E5 .,E4 .,E3 .,E2 .,E1 .最低激发态能级第一激发态,E,E0 .基 态,原子能量的吸收和发射,较高,激发,态能,级,而当电子从激发态再跃迁回基态时，那么辐射出一样波长的谱线，这一谱线称为“共振发射线，两线均称为共振线，波长是一样的。,由于各种元素原子构造和核外电子陈列不同，因此从基态跃迁到第一激发态或由第一激发态跃迁回基态时吸收或辐射的能量不同，因此各元素有不同波长的共振线，所以元素的共振线又称为元素的特征谱线。由于从基态到第一激发态的跃迁最容易发生，所以对大多数元素来讲，共振吸收线是元素一切谱线中最灵敏的谱线，原子吸收分光光度法就是利用基态原,子跃迁到第一激发态时吸收从光源灯元素灯发出的同一元素的共振吸收谱线又叫分析线，相当于吸收峰。但原子的吸收谱线并不是几何学上的线条，而是有一定宽度的波长范围，通常称为谱线轮廓。,Ko,Iv Ko/2 半宽度,Vo Vo,透射光强度Iv与波长Vo的关系 吸收线轮廓与半宽度,假设将吸收系数Kv随入射光波长变化的关系做图，那么称吸收线轮廓，吸收线轮廓的特征值是吸收线中心波长或频率为Vo，在Vo处，吸收系数Ko最大，在Vo两侧一定间隔后Kv减为零。吸收谱线在Vo两侧有一定宽度，通常以吸收系数等于极大值的一半Ko/2处吸收线两点间的轮廓频率范围表示吸收线的宽度,，称为吸收线的半宽度，以V表示，其范围为0.0010.01nm。同样发射谱线也有宽度，不过实践运用中都是用吸收谱线中心的最大吸收值Ko来测定元素含量，称为峰值吸收。,入射光强度Iov 透过光强度Iv,研讨证明，原子蒸气对共振发射谱线的吸收程度和蒸气中基态原子数成正比，也即同原子浓度成正比。当一束强度为Iov、频率为v的入射光谱线经过原子蒸气后，有一部分被吸收，其透过光的强度Iv与原子蒸气厚度即火焰的宽度L、原子蒸气浓度C的关系同有色溶液吸收光的情况完全类似，服从郎伯-比尔定律，即Iv=Iov eKvCL，式中e是自然对数的底，Kv是原子蒸气对频率为V的入射光的吸收系数。,火焰宽度L,当原子蒸气厚度L一定时，设KvL=K，Iv=Iov eKC，Iov/Iv=eKC，将透光度Iv/Iov的的倒数取对数称为吸光度A，那么上式简化为 A=IgIv/Iov=KC，即吸光度A与浓度成线性正比关系。在确定的实验条件下，原子蒸气中的原子浓度与样品中的元素实践浓度成正比，这就是原子吸收分光光度法测定元素的原理。实践测定中还有许多本卷须知：,1.元素测定都要先制备任务曲线，每个任务曲线至少要67个点，而且最好从低浓度高浓度，范围尽能够大，而且要符合线性关系。,2.处置样品同时要制备它的空白对看管，测定管吸光度减去空白管吸光度，再经过任务曲线计算元素浓度。,3.原子吸收分析的优点是灵敏度高，绝对检出线可达1091010g，相对误差普通0.10.5%,测定范围广，从106109g。选择性好，分析速度快，溶液中多种离子不需求分别直接测定。但也有缺陷，主要是元素在火焰中熄灭过程中有许多干扰要素。,4.原子吸收分析，样品溶液的最适浓度在灵敏度的15100倍范围内。,一些元素的分析谱线,镁：285.2nm；钙：422.7nm；铁：248.3nm；,铜：324.8nm；锰：279.5nm；锌：213.9nm；,铬：357.9nm；镍：232.0nm；钴：240.7nm,钼：313.3nm 铅：283.3nm；镉：228.8 nm；,锡：224.6nm 锑：217.6nm；铝：309.3nm；,砷：.8nm；汞：253.7nm；,第九章 火焰光度法,某些原子或分子的电子遭到热能或电能的激发后跃迁到激发态，当这些电子再由激发态回到基态时，以光的方式释放出所吸收的能量，构成发射光谱。每个原子或分子的的能量形状是一定的，所以它们的发射光谱线也是特异的；激发的能量越大，被激发的电子的能量也越高，呈现的谱线也越多。,用火焰作为激发能量，使某些金属元素离子产生发射光谱进展分析的方法称为火焰光度分析法。普通火焰属于热能，能量不及电弧,火花高，因此产生的光谱比较简单，有时仅二、三条谱线。普通煤气-空气火焰的温度不太高，所以能激发的元素也仅限于碱金属和碱土金属,，目前用该法测定的元素为钠、钾、钙。,一.火焰光度计的测定原理：金属元素离子经过熄灭的火焰激发出特异的发射光谱，如钠的发射光谱为黄色，钾的发射光谱为淡红色。发射光谱的强度与物质的浓度在一定范围内成线性关系，据此可以测定含量。,将样品制成溶液，借紧缩空气吸入到火焰光度计的雾化器，并在火焰中喷为很细的微粒。,溶液中含有各种不同的离子，激发出各自不同的光谱，但经过特异的滤光镜可选择需求的元素的谱线，谱线投射到光电池管上，产生电流，电流经放大后用电流计检测。,二.测定方法：,一直接测定法：,1.规范曲线法：用一系列稀释的规范液在火焰光度计上测定，读数绘制规范曲线，同法稀释样品后测定，查规范曲线求含量。,2.比较法：用2个规范液，一个高浓度，一个低浓度，使样品液的浓度介于两者之间。通常,第十章 荧光分光光度法分析的原理,一.荧光的发生：有些物质吸收紫外光照射后会发射出波长对比射光波长还长的光，称为荧光和磷光。荧光和磷光有区别，分子的能量从激发态直接降落到基态发出的波长较长的光称为荧光。分子的能量从激发态并不直接降落到基态，而是经过一个中间的亚稳定形状，稍停留后，再放出能量，下降到基态，发出的光称为磷光。,荧光和磷光,第二电子激发态,吸光 无辐射跃迁,第一电子激发态,吸光 荧光,亚稳态,磷光,基态,磷光的能量比荧光小，波长较荧光长。从激发到发光，荧光所需的时间较短，在激发光照射后1081014秒之间，磷光所需的时间较长，在激发光照射后10410秒以上。本章主要引见荧光光度分析法。,照射物质的紫外光称为激发光，物质产生的荧光称为发射光。同一分子构造物质，用同一波长的激发光照射，可以产生一样的荧光；同一物质浓度高时，产生的荧光强度也强，利用这个性质可以进展定量测定，称为荧光光度分析法。荧光分析不是测定激发光的强弱，而是,测定发射光的强弱，所以属于发射光谱分析法。,二.激发光谱与发射光谱荧光光谱：假设将激发光源用单色器分光，让它发出一系列波长延续变化的光谱像在紫外光谱分析中，从200400nm延续扫描，测定物质吸收每一波长的激发光后所发出的荧光强度，得到的光谱图称为激发光谱excitation spectrum，简写Ex，激发光谱实践是荧光物质的吸收光谱。激发光谱中吸收最高的波长能使荧光物质发出最强的荧光，故称为最大激发波长，用ex表示，普通要用它激发荧光。,再使激发光的波长和强度不变，不断照射在荧光物质上，把产生的荧光经过单色器色散，变成延续变化波长的荧光，照射在光电接受管上，在一定范围内记录其荧光强度的变化，以波长变化和相应的荧光强度作图，称为荧光发射光谱或简称发射光谱fluorescence spectrum简写：Em。再以最大激发波长照射，测定荧光发射光谱，产生最大荧光强度的波长又称为最大发射波长，用em表示。普通分子荧光的发射波长总是大于激发波长。以下图是硫酸奎宁在硫酸中的激发光谱和荧光光谱。,硫酸奎宁的激发光谱和发射光谱,三.荧光定量分析的原理：荧光强度If和激发光的强度I0、物质的荧光效率f成正比：If=I0f-对待测溶液，设I0为入射光激发光强度，It为透射光强度，Ia为吸光强度，If为荧光强度，C为荧光物质浓度，L为溶液厚度(比色杯直径E为吸光系数。溶液被入射,光激发以后，可以向各个方 I0 It,向发出荧光强度而且激发光,的一部分能量可以透过溶液 If,，因此从透射光的方向,记录荧光强度是错误的，普通是从激发光源垂直的方向记录荧光强度。根据比尔定律，Ia=I0It=I0(110ECL)=I0(1e2.3ECL)-溶液的荧光强度If与吸收的光能Ia成正比，那么If=fIa=fI0(1e2.3ECL)，f为常数，而e2.3ECL=12.3ECL+(2.3ECL)2/2！假设浓度C很小，L为1cm，ECL的值也很小，当ECL0.05时，式中第二项以后可忽略，所以If=fI0(1e-2.3ECL)=fI01(12.3ECL)=fI02.3ECL，当I0和L一定时，f和E也是常数，以K表示，那么If=KC,上式阐明荧光强度与荧光物质浓度成线性关系,而且增大入射光强度，可以增大荧光强度。对于较浓的溶液，由于荧光熄灭等缘由，荧光强度与荧光物质浓度不成线性关系。,四.荧光分析的方法：,1.根据上述特点，荧光分析必需在很小浓度下进展，其灵敏度可达0.11ng/ml。,2.发射光谱图外形和激发波长无关，但荧光强度与激发波长有关，所以在荧光分析中普通都是固定一个荧光的发射波长，然后在一定波长范围内扫描物质的激发光谱，再选择ex做激,发波长，测定溶液的荧光强度，进展定量分析。,3.荧光分析普通采用规范曲线法，制造规范曲线和测定样品时都要将空白液的荧光强度调到零，再测定各规范管和样品的荧光强度。,4.有些荧光物质的稀溶液在激发光照射下很容易分解而使荧光强度不断降低，所以不能用激发光长时间照射溶液。荧光强度还受温度、pH值、溶剂的很大影响，荧光光谱受水、乙醇、环己烷的干扰较大，而氯仿的干扰较小。,5.荧光物质的浓度大于1mg/ml时，经常发生荧光自灭景象。,产生荧光的有机物绝大多数是环状化合物，如芳香环、苯类、菲类，还有不饱和杂环如喹啉、吲哚、长链共轭多烯烃，如VA、VB2等。许多有机物不产生荧光或荧光效率不高，可以把它们转化为能产生荧光的物质或设法加强它们的荧光，如甾族化合物不发生荧光，用硫酸处置后可以转化为荧光物质；有些无机物不产生荧光，可以和有机试剂结合生成产生荧光的络合物进展分析。许多药物中的胺类、甾体类、抗生素类、维生素类、氨基酸、蛋白质、酶都可以用荧光法分析。,