FISH技术在血液肿瘤中的应用.ppt

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,上海市第一人民医院,Shanghai First Peoples Hospital,上海市第一人民医院,Shanghai First Peoples Hospital,上海市第一人民医院,Shanghai First Peoples Hospital,上海市第一人民医院 血液科,Shanghai First People,s Hospital,荧光,原位杂交,（,FISH,）,在血液肿瘤中的应用,FISH,的定义,荧光,原位杂交（,FISH,）,是20世纪八十年代在,细胞遗传学,、,分子遗传学,和,免疫学,相结合的基础上发展起来的新技术。它利用已知核酸序列作为探针，以荧光素直接标记或先以生物素或地高辛等半抗原标记后与靶,DNA,进行杂交，再通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，最后在荧光显微镜下观察杂交信号，从而对标本中待测核酸进行,定性,、,定位,和,定量分析,。,FISH,技术原理,FISH,技术原理,FISH,技术原理,FISH,技术原理,FISH,技术原理,FISH,技术原理,FISH,技术原理,FISH,的种类,间期,FISH,（,Interphase FISH）,染色体涂染分析（,Chromosome painting,）,多色,FISH,（,Multicolor-FISH,）,反向涂染（,Reverse painting）,比较基因组杂交（,Comparative genomic hybridization,）,FISH,探针的种类和用途,着丝粒探针,用于检测,染色体数目异常,如三体、单体等。,亚端粒探针,靠近端粒的200,-,300,Kb,为染色体特异性,DNA,，用于检测,涉及端粒的隐匿性易位,。,染色体臂或整条染色体涂染探针（,WCP,）,用于检测染色体,易位,和,标记染色体,。,序列特异性探针,包括臂、带和基因探针等多种，用于检测,基因缺失和重排,。,血液肿瘤,FISH,检测常见探针类型,双色双融合探针（,DC,，,DF,）,额外信号探针（,ES,）,分离探针（,BRK,）,FISH,在血液肿瘤中的应用,检测样本可以是血液、骨髓、石蜡切片,诊断和鉴别诊断,治疗和预后分层,监测疗效（微小残留病灶检测）,识别移植后骨髓细胞来源,一、诊断和鉴别诊断,核型,分析,缺点：,有丝分裂象少或缺如,染色体质量低劣，显带不佳,染色体异常复杂,分子生物学检测,不足：,常见的转录序列来设计引物，扩增的片段长度一般在,100,700bp,之间,mRNA,剪切方式比较特殊，假阴性结果，易造成漏诊或误诊,一、诊断和鉴别诊断,FISH,技术能弥补以上,2,种技术的不足之处,间期细胞上分析（无需中期分裂象），极大地提高了敏感性、准确性和可靠性。,对核型提示的染色体异常做进一步鉴定，从,“,正常核型,”,中筛查隐匿的染色体畸变，成为精确的染色体分析不可缺少的手段。,FISH,探针的片段相对较长，常可达数百,kb,，甚至大于,1Mb,，跨越融合基因每一侧多个外显子区域，只要发生在这些区域的缺失或易位都能被检测到，极少发生漏检，假阴性率很低。,举例,男性,46,岁,患者，,2003.2.24,内科急诊发现白细胞增高（,25,10,9,/L,）。,骨髓显示粒系极度增生，红系、巨核系以及血小板增生尚可，,NAP,积分,49,分，核型分析结果为,46,XY20,。,随访,3,年,，,其白细胞始终维持在,20-30,10,9,水平。,一、诊断,2006.5.4,发现白细胞增高至,170,10,9,，血小板,511,10,9,，血红蛋白,118g/dL,。,骨髓象显示早幼粒细胞占,6%,，中幼粒细胞占,13%,，核型分析未见分裂,象。,BCR-ABL 210,基因阴性，经单融合,FISH,探针证实骨髓,59%,细胞,BCR-ABL,融合基因阳性。,接受格列卫治疗，,2006.9.7,复查，,FISH,阳性细胞比例降低至,7.4%,，,2006.10.23,以后的复查结果,FISH,都为阴性。,一、诊断,其他常用于诊断的探针还有：,PML/RARA,，,AML1/ETO,，,CBF,，,TEL/AML1,等。,以,CBF,探针为例,：,发生,16,号染色体倒位的细胞其荧光信号由,2F,变成,1F/1R/1G,。,有研究表明,CBF,探针对,inv(16),导致的,CBF,-MYH11,融合基因的检出率与分子生物学的方法相当,。,一、诊断,一、诊断,急性淋巴细胞白血病,急性淋巴细胞白血病,检测探针,探针定位,异常染色体,GLP 4/GLP 10,GLP 4:4p11.1-q11.1,GLP 10:10p11.1-q11.1,+4,，,+10,GLP 17,GLP 17:17q11,+17,GLP TEL/GLP AML1,GLP AML1,：,21q22,GLP TEL,：,12p13,t(12;21),GLP MLL,GLP MLL,：,11q23,t(11;v),GLP BCR/GLP ABL(DF),GLP BCR:22q11.2,GLP ABL:9q34,t(9;22),一、诊断,淋巴瘤,B,细胞淋巴瘤,IGH,基因断裂重组,滤泡性淋巴瘤,IGH/BCL2,融合基因,套细胞淋巴瘤,IGH/CCND1,融合基因,弥漫大,B,细胞淋巴瘤,BCL6,基因,Burkitt,淋巴瘤,C-MYC,基因,粘膜相关淋巴组织淋巴瘤,MALT,基因断裂重组,鉴别诊断，以,BCR/ABL,探针为例：,额外信号的,BCR/ABL,探针（,ES,）,根据荧光信号的模式不同，可以鉴别,MBCR,断裂点（,P210,）和,mBCR,断裂点,(,P190,),。,MBCR,断裂点的细胞呈现,1,Y,/2,R,/1,G,的信号模式，而,mBCR,断裂点的细胞则是,2,Y,/1,R,/1,G,的信号模式。,一、鉴别诊断,一、鉴别诊断,双色双融合信号探针（,DF,）,虽不能区分,MBCR,和,mBCR,，但能检测,der,（,9,）的部分序列缺失,。,ABL,和,BCR,基因同时缺失：,1,R,/1,G,/1,Y,ABL,基因单独缺失：,1,R,/2,G,/1,Y,。,ES,探针却无法检测,der,（,9,）的部分序列缺失，其信号均显示,1,R,/1,G,/1,Y,。,一、鉴别诊断,IgH-CCND1,男性,，,54,岁患者，左颌下肿块,2,月余,白细胞增高（,21.3,10,9,/L,）,骨髓涂片见到增生活跃，以成熟淋巴细胞增生为主，考虑慢性淋巴细胞白血病。,流式分析显示,CD5,+,CD19,+,细胞占,86.5%,，以,CD19,+,的细胞群设门，,CD23,+,细胞约占,16.3%,。,FISH,检测患者外周血，约,50%,的圆形细胞显示融合信号，,提示,套细胞淋巴瘤,可能性大,。,病理证实了左颌下淋巴结非霍奇金套细胞淋巴瘤。,CLL,中的应用,CLL,的细胞大多处于间期，有丝分裂活性较低，细胞往往不分裂，即使分裂的细胞绝大多也是正常核型，核型分析的异常检出率很低。,CLL,的遗传学异常被认为与存活期有关：,正常核型和,13q-,预后相近,+12,、,11q-,和,17p-,的预后均较差,二、治疗和预后分层,FISH,共检出了,23,例异常（,76.7%,）。,完成核型分析的,18,例中仅,2,例检出异常。,正常核型的,9,例中，,FISH,检出,7,例异常。,未见分裂象的,7,例中，,FISH,检出,5,例异常。,而且这些由,FISH,检出的异常克隆比例基本都在,20%,以上。,CEP12,P53,D13S25,RB1,ATM,核 型,阳性例数,11,2,13,12,1,异常,2,正常,9,未见,7,未做,12,二、治疗和预后分层,MM,中的应用,MM,的骨髓瘤细胞有丝分裂指数低，且由于骨髓浸润程度不同，常规核型分析异常检出率相对较低，检出的异常往往是超二倍体和,/,或复杂核型。,MM,的遗传学异常同样被认为与预后相关，,13q14,的缺失被认为是复发和预后不良的独立危险因素，,1q21,扩增、,p53,缺失也都提示预后不良。,二、治疗和预后分层,二、治疗和预后分层,FISH,共检出了,17,例异常（,56.7%,）。,完成核型分析的,27,例中,6,例检出异常,（,22.2%,）。,正常核型的,15,例中，,FISH,检出,9,例异常,。,未见分裂象的,7,例中，,FISH,检出,3,例异常,。,FISH,检出的异常克隆比例大多都低于,30%,。,浆细胞比例低于,20%,，异常检出率会大大降低。,1q21,P53,D13S319,RB1,IgH,核 型,阳性例数,6,2,8,7,10,异常,6,正常,15,未见,6,未做,3,MDS,中的应用,FISH,在,MDS,中的应用价值相对较低。,MDS,的患者大多能成功完成核型分析，且被分析的分裂象数目和质量尚可。,FISH,检测普遍采用组合探针（,-5/5q-,、,-7/7q-,、,+8,、,20q-,和,-Y,）对五大类常见异常进行分析。,二、治疗和预后分层,在我院新近完成的,70,例,MDS,患者的研究中,：,核型和,FISH,分别检出,21,例和,22,例异常，异常检出率相当。,核型异常但,FISH,正常的,6,例，这,6,例异常均发生于探针覆盖范围以外区域。,核型正常而,FISH,异常,7,例，这,7,例的异常克隆细胞比例大多较低（,10%,）。,对于未见分裂像和正常核型的患者有一定的应用价值，能提高小克隆异常的检出率。,二、治疗和预后分层,三、,监测疗效,对于某些,不具有特定分子水平改变,，或者是,基因重排方式比较特殊,，常规的分子生物学方法不能检测，但其在疾病初发时有较大片段的易位、缺失、扩增或重排并能被现有的,FISH,探针检出的患者，可在治疗后进行,FISH,监测。,FISH,在异性别异基因造血干细胞移植后供受者,嵌合比例的监测,中也有非常重要的价值。,比较未分选细胞的,STR,和,FISH,两种技术，,FISH,的敏感性和准确度更高,，对于早期提示复发或排斥反应的临床应用价值更大。,四、,识别移植后骨髓细胞来源,小 结,FISH,的优点：,简便迅速,。,杂交和检测效率高,。,敏感性和特异性高,，,能对间期细胞进行分析,。,缺点包括：,价格相对较高,。,受探针来源,的,限制,。,检测三体敏感性高于单体或缺失,。,石蜡包埋或冰冻切片较难处理,。,需荧光显微镜和分析系统,。,一次杂交只能检测,1,至数个异常。,小 结,血液,肿瘤,妇科,肿瘤,产前,诊断,泌尿生殖肿瘤,上海市第一人民医院,Shanghai First Peoples Hospital,Welcome to ShanghaiWelcome to our hospital,